Figure 1:

По срединной линии ранних эмбрионов ст. PS (~E11.5-E12), мы впервые обнаруживаем кластер SOX17+ клеток на заднем конце образующейся первичной полоски (Fig. 1c, d, Extended Data Fig. 1b); большинство из них экспрессирует BLIMP1, за исключением тех, что на переднем конце (стрелки на Fig.1c, d). Экспрессия SOX17 precedesпредшествует BLIMP1, а NANOGактивируется в SOX17+BLIMP1+ pPGCs (Fig. 1d, Extended Data Fig. 1b). У эмбрионов на ст. E12.5-E13.5, pPGCs обнаруживают совместную экспрессию SOX17, BLIMP1, NANOG, TFAP2C, OCT4, маркер клеточной поверхности pPGC Sda/GM2 (ref. 12), но имеют низкие уровни экспрессии T (Fig. 1e, Extended Data Fig. 1c, d). Этот кластер pPGC приблизительно из 60 SOX17+BLIMP1+ клеток, располагается по границе между эмбриональной и внеэмбриональной тканью у ранних эмбрионов PS-стадии (~E12), увеличиваясь до более 300 pPGCs на ст. E15.5 (Extended Data Fig. 2a-c). 6-часовое пульсовое воздействие мечением EdU показало, что синтез ДНК происходит вскоре после обнаружения эпитопа Sda/GM2 (Fig. 1f, Extended Data Fig.2d), показывая, что острое увеличение pPGCs, по-видимому, обусловлено дополнительным привлечением T+ компетентных предшественников. После этого pPGCs становятся покоящимися и берут паузу перед миграцией, как у мышей¹³ (Fig. 1f, Extended Data Fig. 2c). В частности, экспрессия PRDM14 в pPGCs слабая и, скорее всего, цитоплазматическая (Extended Data Fig. 1f), тогда как SOX2 не обнаруживается (Extended Data Fig. 2e, f).

Инициация эпигенетических программ, специфичных для зародышевой линии, ^{9, 14} обнаруживается в формирующихся pPGCs пи этом наблюдается глобальное снижение 5-methylcytosine (Extended Data Fig. 3b, c) и одновременно увеличение 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) (Fig. 1g, h). Соотв., UHRF1 подавляется (Fig. 1i), а TET1 усиливает свою активность (Extended Data Fig. 3a). Прогрессивное снижение экспрессии H3K9me2 и G9A (известен также как EHMT2) также было отмечено (Extended Data Fig. 3b, c) и глобальное деметилирование ДНК происходило во время миграции pPGCs в направлении гонад (Extended Data Fig. 3d). pPGCs продолжают экспрессировать SOX17, BLIMP1, TFAP2C, OCT4 и NANOG (головки стрелок Fig. 1e,Extended Data Fig. 2e, f), как это происходит в эквивалентных человеческих hPGCs in vivo^{4, 9}. Т.о., pPGCs, возникшие из пери-гаструляционного эпибласта свиньи, обнаруживают очень сильное сходство с hPGCs, сопровождаемое последовательной экспрессией SOX17 и BLIMP1 и началом работы эпигенетической программы ^{4, 9}.

Чтобы определить, действительно ли эпибласты свиней приобретают компетентность к судьбе pPGC, мы выделяли диски эпибластов из гипобласта и трофэктодермы на разных ст. развития (Fig. 2a, b, d, e). Мы подвергали их действию цитокинов, включая BMP2 или BMP4 (refs 2) (hereafter referred to as cytokines), в течение 64 ч, чтобы индуцировать pPGCs ex vivo (Fig. 2f). Хотя не было обнаружено реакции на ст. E10.5-E11 в раннем бислойном диске эпибласта, отчетливая индукция в pPGCs появлялась в эпибластах со ст. E11.5 pre-PS эмбрионов, при этом обнаруживалась совместная экспрессия SOX17, BLIMP1, NANOG, OCT4 и TFAP2C (Fig. 2g, h,Extended Data Fig. 3e).В частности, мы обнаружили сильный сигнал BMP2/4 от задних частей pre-PS и ранних-PS эмбрионов свиней in vivo ^{15, 16} (Fig. 2a), и этом обнаруживалась локализация в ядре pSMAD1/5/8 клеток задних частей эпибласта (Fig. 2c). BMP inhibitor (BMPi) устраняет индукцию pPGC (Fig. 2g, Extended Data Fig. 3e). Компетентность к выбору судьбы pPGC снижается во время ранней PS-стадии вместе с началом гаструляции и дифференцировки мезодермы (Fig. 1c). Передача сигналов WNT из задней части pre-PS эпибласта также важна¹⁶ (Fig. 2a), на что указывает высокая пропорция T+ клеток, нижестоящих мишеней для WNT17, во время индукции pPGC (Fig. 1b). Ингибитор WNT (WNTi) снижает индукцию pPGC, но не на ранней PS-ст. эпибласта, а когда они уже становятся компетентными к выбору судьбы (Fig. 2g, Extended Data Fig. 3e). Экспрессия T в ответ на WNT общим признаком компетентности к выбору судьбы зародышевых клеток ^{3, 4, 17}.

Figure 2: Competence for pPGC specification. < a href="http://www.nature.com/nature/journal/v546/n7658/fig_tab/nature22812_F2.html"> Figure 2:

Поскольку мы не можем проверить ранние эмбрионы человека непосредственно, мы стимулировали пери-гаструляционное развитие и индуцировали выбор судьбы hPGC in vitro. Мы получили модели in vitro с human pluripotent stem cells (hPSCs) для развития мезодермы и пери-гаструляции ^18-20 (Fig. 3a). Эти hPSCs в определенной подготовленной среде (после чего они обозначались как conv-hPSCs, see Methods) оказывались, скорее всего, эквивалентными пре-гаструляционному эпибласту свиней²¹. Чтобы отслеживать приобретение и потерю компетентности в отношении спецификации hPGC в ходе дифференцировки мезодермы, мы использовали клетки с чувствительностью к NANOS3-tdTomato репортеру (see Extended Data Fig. 4). Путем проверки индукции hPGCs цитокинами в 6 ч интервалах (Fig. 3a), мы выявили пик компетентности приблизительно в 12 ч во время дифференцировки мезодермы, который после этого снижается (Fig. 3b, d), иллюстрируя ступенчато-образный переход в клеточных состояниях. PGC-компетентные клетки обнаруживают умеренную активацию маркеров первичной полоски T, MIXL, GSC, EVX1 и EOMES, и небольшое снижение SOX2 (Fig. 3e,Extended Data Fig. 5a, b). Начиная с 18 ч, наблюдается активация поздних маркеров первичной полоски TBX6, MESP1/2 и SNAI1/2, которые запускали эпителиально-мезенхимный переход, происходящий во время гаструляции²² (Extended Data Fig. 5b). Реакции клеток также менялись в ответ на сигналы, так BMP2/4 теперь индуцировали мезодермальные клетки (Extended Data Fig. 5b, e-h), тогда как activin A и BMP ингибитор эффективно индуцировали дефинитивную энтодерму¹⁸ (Fig. 3c, d. Extended Data Fig. 5e-h). Т.о., начиная с 12 ч, мезодермальные предшественники (pre-ME) оказывались компетентными к выбору судьбы PGC, но приблизительно с 18 ч (мезэнтодерма (mesendoderm)), компетентность выбора PGC снижалась, с одновременным повышением компетентности выбора судеб дефинитивной энтодермы и/или мезодермы (Fig. 3a-c).

Figure 3

Figure 3: Simulation of human peri-gastrulation and hPGC competency.

Передача сигналов WNT и ACTIVIN/NODAL необходима для приобретения компетентности выбора hPGCs в 12 ч pre-ME (Extended Data Fig. 5c). Подавление BMP во время дифференцировки мезодермы заметно сниженает эффективность индукции hPGC, подтверждая роль эндогенного BMP (Extended Data Fig. 5d). Кроме того, BMP во время pre-ME (12 h), однако, не затрагивает компетентности hPGC, но способствует дифференцировке в латеральную мезодерму на ст. 24 ч., которая возникает из средней и задней частей первичной полоски (Extended Data Fig. 5e-h). Напротив, дифференцировка дефинитивной энтодермы происходит в передней части первичной полоски, что наблюдается на стадии первичной полоски у эмбрионов свиней (головки стрелок Fig. 1d, Extended Data Fig.1c), подтверждая, что BMP наделяет задними характеристиками первичную полоску во время гаструляции (Extended Data Fig. 5i). Совместные доказательства от эмбрионов свиней и экспериментов in vitro с conv-hPSCs, демонстрируют прогрессивное и временное приобретение компетентности для hPGC, сопровождаемое компетентностью к дефинитивной энтодерме и/или мезодерме.

Чтобы продемонстрировать приложимость этой модели к не=человекообразным приматам, мы использовали cynomolgus monkey PSCs (cmPSCs), чтобы индуцировать мезэнтодерму (Extended Data Fig. 6a, b). Поразительно, cmPSCs обнаруживают также временное увеличение компетентности к выбору судьбы cmPGC около 12 ч во время дифференцировки мезэнтодермы на ст. 24 ч (Extended Data Fig. 6c-f). Недавнее исследование подтвердило, что cmPGCs происходят от происходящего из эпибласта зарождающегося амниона, но также в принципе из задней части эпибласта²³; двойственное происхождение, однако, также возможно. Детальный молекулярный анализ амниона важен, поскольку SOX17 и BLIMP1 также действуют и в др. местах, включая вне-эмбриональные ткани ^{24, 25}, которые обладают гораздо большим онтогенетическим разнообразием и меньшими онтогенетическими ограничениями, чем эпибласт²⁶. Далее анализ in vivo эмбрионов не-человекообразных приматов и потенциально эмбрионов человека in vitro заслуживает внимание.

Затем мы исследовали комбинаторную роль ключевых транскрипционных факторов, принимая во внимание, что SOX17 является ключевым регулятором как hPGCs, так и дефинитивной энтодермы^{4, 27} (Fig. 3d). Эктопическая транскрипционных факторов SOX17 в pre-ME еа ст. 12ч индуцирует hPGCs, давая NANOS3-tdTomato+OCT4+BLIMP1+ клетки, но в мезодерме на ст. 24 ч он эффективно индуцирует FOXA2+ (дефинитивная энтодерма) (Fig. 3f, g). Во время индукции hPGCs в pre-ME с помощью BMP (Extended Data Fig. 7a, b), мы впервые обнаружили SOX17 на ст. 12 ч, и hrhjh 30-40% клеток экспрессировали также BLIMP1, но не TFAP2C (Extended Data Fig. 7c, d), как и у эмбрионов свиней (Extended Data Fig. 1e). TFAP2C был обнаружен примерно на ст. 18 ч, как ряд SOX17+BLIMP1+TFAP2C+ клеток, постепенно увеличивающихся. Эти предполагаемые hPGCs в конечном итоге формировали кластер в середине эмбриоидов на ст. 48 ч (Extended Data Fig. 7b, c, e). Начиная с 12 ч., экспрессия NANOG прогрессивно возрастала в SOX17+BLIMP1+ клетках (Extended Data Fig. 7e, f). Однако, в отличие от мышей на ст. 28 ч, NANOG в отдельности не мог индуцировать hPGCs (Extended Data Fig. 8a-c) и экспрессия PRDM14 оказалась низкой^{2, 4}, и может быть цитоплазматической на ст. E14 в pPGCs (Extended Data Fig. 1f) и in vivo в hPGCs гонад⁹. PRDM14 является критическим для выбора судьбы PGC и эпигенетического репрограммирования у мышей²⁹, но его роль, если это имеет место, в hPGCs и pPGCs требует дальнейших исследований.

Затем мы тестировали роли SOX17, BLIMP1 и TFAP2C индивидуально и в комбинации при индукции hPGCs в само-обновляющиеся PGC-компетентные hPSCs (comp-hPSCs)⁴, используя NANOS3-tdTomato репортер и индуцибельные трансгены SOX17, BLIMP1 и TFAP2C (Extended Data Figs 4c-j, 8d-g, see Methods). BLIMP1 и TFAP2C индивидуально и совместно вызывали незначительную реакцию после 2 дней, тогда как SOX17 в отдельности давал умеренную реакцию с или без TFAP2C (Fig. 4a). В особенности, SOX17 и BLIMP1 совместно продуцировали сильную реакцию и большую пропорцию клеток NANOS3-tdTomato+ (Fig. 4a), подтверждая, что они действуют синергично и быстро (в течение примерно 24 ч), по сравнению с 96 ч, необходимыми для цитокинов, чтобы индуцировать сходную реакцию (Fig. 4b, c). Этой реакции предшествует подавление SOX2 (ref. 30) и усиление активности 'naive' генов плюрипотентности, включая KLF4 и TFCP2L1, как в hPGCs in vivo ⁹ (Fig. 4e, Extended Data Fig. 8h). Реакция на SOX17-BLIMP1 во всем остальном сходна с таковой, вызываемой цитокинами, как показывает глобальное секвенирование РНК (RNA-seq) (Fig. 4d, Extended Data Fig. 8i, j).

Figure 4: Induction of hPGCs by SOX17-BLIMP1 and combined representation of hPGC and pPGC specification

http://www.nature.com/nature/journal/v546/n7658/fig_tab/nature22812_F4.html

Для получения дополнительной информации мы индуцировали эктопическую экспрессию SOX17 с или без экспрессии BLIMP1 в SOX17-нулевых comp-hPSCs⁴ (Extended Data Figs 9a, 10a, b). Хотя SOX17 инициирует выбор судьбы hPGC, обнаруживается также достоверное увеличение экспрессии FOXA2, энтодермального гена (Fig. 4f). Соотв., FACS-очищенные клетки обнаруживали экспрессию FOXA1, FOXA2 и HNF1β , а также PGC маркеры OCT4, NANOG, BLIMP1 и TFAP2C (Extended Data Fig. 9b), и маркер клеточной поверхности CXCR4, который экспрессируется энтодермой¹⁹ и PGCs у людей (Extended Data Fig. 9c, d). Это, по-видимому, происходит благодаря высокой эктопической дозе гена SOX17, превышающие уровни, индуцируемые с помощью BMP в дикого типа comp-hPSCs (Extended Data Fig. 9b, e-h), без пропорционального увеличения BLIMP1 (Extended Data Fig. 9i). Так, BLIMP1 репрессирует энтодермальные гены во время спецификации hPGC⁹. В самом деле, одновременно высокие BLIMP1 и SOX17 индуцируют мощно и быстро hPGCs, одновременно супрессирует энтодермальные гены (Fig. 4g, Extended Data Fig. 10c), и также инициирует специфическую для зародышевой линии эпигенетическую программу⁹, подавляя при этом DNMT3A, DNMT3B и UHRF1 и усиливая активность TET2 (Extended Data Fig. 8k), как в pPGCs (Fig. 1g-i, Extended Data Fig. 3a-d).

Пери-гаструляционные ex vivo эмбрионы свиней и in vitro воспроизведение развития человека и обезьяны являет пример законсервированных принципов для спецификации PGC в контексте развития эпибласта в плоских в виде дисков эмбрионов (Fig. 4h). Мы показали, что SOX17, по-видимому, регулирует PGCs и дефинитивную энтодерму. Мы также предположили, что передача сигналов, сопровождаемая эпигенетическим запуском (priming) регуляторных элементов может обеспечить компетентность для выбора судьбы PGC, а после этого дефинитивной энтодермы и/или мезодермы, как интегральной части программы развития эпибласта в направлении гаструляции. SOX17 и BLIMP1 необходимы и достаточны для индукции PGCs и для инициации специфической для зародышевой линии эпигенетической программы. Став специфицированными, PGCs необратимо детерминируются к выбору судьбы зародышевой линии (Extended Data Figs 2e, f, 10d, e). Наш целостный подход предоставил информацию о раннем развитии человека и выборе клеточных судеб.