Посещений:
Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis | ||
---|---|---|
Cells have an intrinsic ability to self-assemble and self-organize into complex and functional tissues and organs. By taking advantage of this ability, embryoids, organoids and gastruloids have recently been generated in vitro, providing a unique opportunity to explore complex embryological events in a detailed and highly quantitative manner. Here, we examine how such approaches are being used to answer fundamental questions in embryology, such as how cells selforganize and assemble, how the embryo breaks symmetry, and what controls timing and size in development. We also highlight how further improvements to these exciting technologies, based on the development of quantitative platforms to precisely follow and measure subcellular and molecular events, are paving the way for a more complete understanding of the complex events that help build the human embryo. |
Клетки обладают замечательной способностью к самоорганизации в сложные и функциональные структуры. Хотя многие процессы заставляют клетки перегруппировываться во взрослых организмах, самая драматичная сборка происходит в раннем развитии. Во время гаструляции (см. Глоссарий, Вставка 1), которую Льюис Вольперт идентифицировал как самое важное событие в жизни (Wolpert и Vicente, 2015), клетки подвергаются поразительным морфогенетическим движениям и изменениям в судьбе, которые превращают кажущийся симметричный кластер клеток в ансамбль из разных и разграниченных типов клеток. Этот процесс связан со сложными, но прекрасно налаженными взаимодействиями, которые в конечном итоге приводят к образованию трех зародышевых слоев, которые впоследствии способствуют формированию органов. Например, у мышей требуется всего шесть с половиной дней, чтобы начать формирование плана тела, начиная с одной клетки (Wolpert et al., 2015).
В результате этого процесса происходят несколько крупных анатомических событий, включая морфогенетические движения, кавитацию и поляризацию тканей (Chazaud and Yamanaka, 2016). На каждое из них влияют различные биохимические и физические сигналы, изменения экспрессии генов, межклеточные взаимодействия и взаимодействия между клетками и внеклеточным матриксом (ECM) (Bedzhov et al., 2014а). В последнее время многие из этих событий развития были успешно воспроизведены in vitro, что позволило впервые получить количественную оценку понимания этих явлений. Эти эксперименты выявили замечательную способность клеток к формированию сложных структур посредством процесса, обычно называемого самоорганизацией или, иногда, как самосборка. Следует отметить, что клетки самоорганизующейся системы не означают, что они не требуют соответствующих условий культивирования, таких как присутствие сигнальных белков и подходящие механические свойства окружающей среды. Было показано на прекрасном примере самоорганизации, что кластер диссоциированных эмбриональных стволовых клеток мыши (ESCs), культивируемых in vitro, спонтанно формирует оптический бокал , демонстрируя присутствие всех слоёв нейрональной сетчатки, когда содержится в среде, содержащей низкие уровни фактора роста и обогащенной белками базальной мембраны (рис.1А) (Eiraku et al., 2011). Эта структура, называемая органоидом (см. Глоссарий, вставка 1), демонстрирует сильное сходство с тканью in vivo; она подвергается изменениям локальной тканевой механики, инвагинации для формирования характерной морфологии оптического бокала (рис. 1А) (Eiraku et al., 2011; Sasai et al., 2012).
Важно отметить, что этот органоид, образованный без внешней поддержки или механики, еще раз демонстрирует врожденную способность клеток к самогенерации функциональных многоклеточных структур. Позднее этот подход был адаптирован для изготовления ткани сетчатки из человеческих ESC (hESC) (Kuwahara et al., 2015). Совсем недавно было показано, что органоиды человеческих оптических бокалов, приживленные на поврежденные глаза у приматов, продолжают дифференцироваться в различные типы клеток сетчатки, даже создавая синаптические контакты с хозяином (Shirai et al., 2016). Также появилось много других примеров органоидов (рассмотрено McCauley and Wells, 2017), включая органоиды кишечника (Sato et al., 2009; Spence et al., 2011), почки (Takasato et al., 2015), поджелудочной железы (Greggio et Al., 2013) и даже мозга (Eiraku et al., 2008; Lancaster et al., 2013). Их генерация часто включает модификации условий 3D-культуры и имитацию предполагаемых событий передачи сигналов in vivo с помощью внешних факторов. Несмотря на то, что органоиды обладают очевидными потенциальными преимуществами для здоровья, потребуются значительные усовершенствования и разработки, прежде чем они станут обычным образом применяться в медицине. Важно, однако, что эти различные типы органоидов представляют собой перспективные новые модельные системы, которые могут быть использованы для понимания фундаментальных аспектов развития человека, которые иначе не могут быть изучены. Они облегчают изучение сигнальных путей в спецификации клеток и органогенезе, а также с механической точки зрения они определяют физическую основу формообразования ткани и органов (Lancaster and Knoblich, 2014).
В общем, органоид определяется как структура, в которой плюрипотентные или прародительские стволовые клетки дифференцируются в несколько клеточных популяций, которые самоорганизуются/собираются в ткань, которая напоминает орган in vivo (Clevers, 2016; Fatehullah et al., 2016; Kicheva and Briscoe, 2015, Lancaster and Knoblich, 2014; Sasai et al., 2012; Turner et al., 2016).
Аналогичным образом исследователи также создали структуры, называемые эмбриоидными телами, эмбриоидами и гаструлоидами (см. Глоссарий, вставка 1, рис. 1B, C). Эмбриоидные тела широко использовались в течение некоторого времени как модели раннего развития и обычно были дезорганизованными 3D кластерами плюрипотентных или дифференцированных клеток. Мы считаем, что термин эмбриоид означает собой более организованное эмбриоидное тело, которое возникает как следствие, например, поляризации клеток, вызванной ECM в окружающей среде, или из-за правильной топологии множественных типов клеток, представляющих эмбрион в определенное время развитие. Гаструлоиды, напротив, являются моделями гастрвлирующего эмбриона в 2D (Etoc et al., 2016; Warmflash et al., 2014), либо в 3D (Turner et al., 2016; van den Brink et al., 2014). Самосборка/организация также наблюдалась непосредственно в прикрепленных бластоцистах млекопитающих in vitro. В этих исследованиях было установлено, что эмбрионы человека и мыши могут быть культивированы ex vivo в отсутствие материнских тканей (Deglincerti et al., 2016a; Shahbazi et al., 2016) (Bedzhov et al., 2014b; Morris et al., 2012), обнаруживая важные события самоорганизации. Хотя эти анализы в настоящее время этически ограничены изучением эмбрионов человека только на срок до 14 дней развития, они обеспечивают дополнительный подход к эмбриоидным и гаструлоидным экспериментам для количественного изучения раннего развития человека и, вероятно, станут все более популярными в ближайшие годы. В свете этих недавних достижений в создании органоидов, эмбриоидов и гаструлоидов, понимание того, как клетки самоорганизуются для создания дискретных тканей и органов, имеет важное значение. Не менее важно, что разработаны количественные методы in vitro для обеспечения воспроизводимости процесса образования органоидов, поскольку одной из основных проблем является то, что спонтанные образования органоидов обычно приводят к гетерогенным и слабо воспроизводимым структурам. В дополнение к жизненно важным ролям, которые играют регуляция генов, сигнальные пути и дифференцировка клеток, многие классические вопросы, касающиеся тканевой механики, теперь вновь появляются. Например, каковы движущие силы самоорганизации/сборки в раннем развитии? Как этот процесс настолько хорошо контролируется для создания биомиметических структур (см. Глоссарий, вставка 1) in vitro при очень небольшом внешнем вмешательстве? Как связаны механические и биохимические сигналы?
Цель этого обзора - рассмотреть эти и подобные вопросы, подчеркнув примеры, в которых количественные подходы внесли значительный вклад в наше понимание раннего развития. Мы не будем сосредотачиваться на подробных молекулярных аспектах передачи сигналов и паттернов или методах производства органоидов, поскольку эти темы были тщательно рассмотрены в других местах (например, Clevers, 2016, Fatehullah и др., 2016, Kicheva and Briscoe, 2015, Lancaster and Knoblich, 2014; McCauley and Wells, 2017; Turner et al., 2016).
Вместо этого мы фокусируемся на трех ингредиентах, которые, по нашему мнению, являются ключевыми для создания функционального органоида: (1) самоорганизация/сборка, которая предполагает правильное позиционирование клеток по отношению друг к другу; (2) нарушение симметрии, при котором, например, в кажущемся однородным кластере клеток возникает ось тела; и (3) контроль сроков и размеров развития. Самосогласование и самоорганизация Формирование паттерна во время эмбриогенеза основано на физических и морфологических свойствах клеток, полученных ими сигналах и механических свойствах тканей. По мере развития эти свойства претерпевают изменения, обеспечивая динамические взаимодействия различных типов клеток. Например, размещение диссоциированных hESC на чашке, покрытой полимеризованными белками ECM, такими как ламинин, и культивирование в среде, которая поддерживает плюрипотентность, приводит к постепенной эпителизации в компактных колониях (фиг.2А). Это образование эпителия из не эпителиального состояния является примером самосборки. Это обусловлено эффективными сильными клеточными взаимодействиями с участием молекулы адгезии клеток E-cadherin, полимеризации актина и другими белками, связывающими клетки (Adams et al., 1998; Alberts et al., 2014; Vasioukhin et al., 2000). Эти адгезивные факторы также могут регулировать движения клеток и сортировку клеток и, следовательно, могут влиять на форму и структуру ткани. Наконец, механические сигналы из внешней среды, а также внешние факторы роста и сигналы также играют ключевую роль в определении судьбы клеток и, таким образом, в самоорганизации. Роль адгезивных сил Было показано, что адгезивные силы играют важную роль в контроле самоорганизации/сборки клеток внутри эмбриона. Интересно, что белки, которые опосредуют эти взаимодействия, такие как кадгерины и их партнерские белки, катенины, рассматриваются не только как механические, но и как биохимические сигналы (Shawky and Davidson, 2015).
Принимая во внимание роль кадгеринов в эпителизации, можно ли, модифицируя межклеточные взаимодействия, запускать перестройки in vitro? Эта идея возникла благодаря ранним экспериментам по смешиванию клеток. Смешанные клетки из разных тканей эмбрионов позвоночных приводило к рассортировке, так что клетки перегруппировывались в соответствии с их относительным положением внутри эмбриона (Holtfreter, 1944; Steinberg, 1970; Townes and Holtfreter, 1955). Напр., когда диссоциированные клетки из сетчатки, печени, сердца или зачатков конечностей от 5-дн. эмбрионов кур были реагрегированы в in vitro в разных бинарных комбинациях, то клетки всегда рассортировывались и повторно воссоединялись с тем же самым типом клеток (Steinberg, 1963). В конечном итоге, один тип клеток окружал др., при этом относительное расположение тканей соответствовало таковому у эмбрионов (Steinberg, 1963). Такая сортировка может быть обусловлена минимизацией энергии поверхности всей ткани, это помещает клетки с их строжайшими взаимодействиями и/или наивысшим натяжением ткани (see Glossary, Box 1) внутрь, окружая их слоями др. тканей с пониженной силой межклеточных взаимодействий (Fig. 2B). В подтверждение этой гипотезы, зародышевый слой агрегирует у леопардовой лягушки Rana pipiens спонтанно, стратифицируясь in vitro в соответствии с натяжением ткани, при этом натяжение снижется изнутри кнаружи (Davis et al., 1997). На молекулярном уровне различия в экспрессии cadherin (как в отношении количества, так и типа) приводят к сортировке клеток зависимым от натяжения способом in vitro и in vivo (Foty and Steinberg, 2005; Friedlander et al., 1989; Godt and Tepass, 1998; Gonz?lez-Reyes and St Johnston, 1998; Katsamba et al., 2009; Schotz et al., 2008; Steinberg and Takeichi, 1994). В самом деле, в некоторых случаях дифференциальная экспрессия cadherins не приводит к клеточной сортировке in vivo или в эмбриоидных телах (Moore et al., 2009, 2014; Ninomiya et al., 2012). Принимая во внимание, что клетки подвергаются активным процессам, таким как поляризация, результаты in vivo и in vitro могут быть согласованными. А именно, путем моделирования динамических взаимодействий с участием cadherins, ECM и цитоскелета, было установлено, что сортировка клеток не обязательно соответствует абсолютной поверхностной плотности cadherin, т.к. это зависит от разнообразных факторов (Amack and Manning, 2012). Поскольку понятно, что физические силы в ткани облегчают массивные перемещения клеток, которые происходят во время самоорганизации и самосборки органоидов, однако, как адгезивная энергия купируется с кортикальным натяжением не совсем понятно. Более того, степень, с которой сортировка участвует в эмбриогенезе, делая не только актуальными клеточные перемещения, но и также потенциально способствует дифференцировке и спецификации судеб клеток, в основном неизвестна (Fagotto, 2014). Уровни кадгерина также играют роль в процессе эпителиально-мезенхимного перехода (EMT) - противоположного эпителизации. Именно этот процесс освобождает плотно упакованные эпителиальные клетки, изменяя контакты клеток и активируя процессы, которые способствуют миграции клеток. В частности, E-кадгерин подавляется во время ЕМТ, в течение которого межклеточные взаимодействия уменьшаются, и заменяются N-кадгерином, который проявляет более слабые меж-белковые взаимодействия (Moore et al., 2014). В то же время клетки меняют свой профиль сигнализации и перестраивают свой цитоскелет, что способствует движению клеток (Lamouille et al., 2014). Важно отметить, что ЕМТ играет роль в формировании зародышевого слоя в качестве проникновения клеток эпителиальных эпибластов в примитивную полоску (Stern, 2004).
Учитывая роль кадгеринов в эпителизации, может ли изменение клеточных взаимодействий инициировать перегруппировки in vitro? Эта идея возникла в результате ранних экспериментов по смешению клеток. Смешивание клеток из разных тканей эмбрионов позвоночных приводит к сортировке, так что клетки перегруппируются в соответствии с их относительными положениями внутри эмбриона (Holtfreter, 1944, Steinberg, 1970; Townes and Holtfreter, 1955). Например, когда диссоциированные клетки, взятые из сетчатки, печени, сердца или зачатков конечностей пятидневного куриного эмбриона, оказывались рассортированы in vitro в разных бинарных комбинациях, клетки всегда не смешивались, независимо от комбинации, и повторно собирались ансамбли из того же типа клеток (Steinberg, 1963). В конце концов, один тип клеток оказался вокруг другого, где относительные положения тканей соответствовали тем, что были у эмбрионов (Steinberg, 1963). Эта сортировка может быть обусловлена минимизацией общей поверхностной энергии ткани, которая соединяет клетки с самыми сильными взаимодействиями и/или высочайшим тканевым натяжением (см. Глоссарий) во внутреннем пространстве, окруженная слоями других тканей с уменьшением силы межклеточных взаимодействий (фиг.2В). В подтверждение этой гипотезы зародышевые агрегаты из леопардовой лягушки Rana pipiens спонтанно стратифицируют in vitro в соответствии с натяжением ткани, причем напряжение уменьшается изнутри наружу (Davis et al., 1997). На молекулярном уровне различия в экспрессии кадгерина (как количества, так и типа) приводят к сортировке клеток зависимым от напряжения образом in vitro и in vivo (Foty and Steinberg, 2005; Friedlander et al., 1989; Godt and Tepass, 1998, Gonz? Lez-Reyes и St Johnston, 1998; Katsamba et al., 2009; Schotz et al., 2008; Steinberg and Takeichi, 1994). Тем не менее, недавние работы оспаривают это понятие. Действительно, в некоторых случаях дифференциальная экспрессия кадгеринов не приводит к сортировке клеток in vivo или в эмбриоидных телах (Moore et al., 2009, 2014; Ninomiya et al., 2012). Принимая во внимание, что клетки подвергаются активным процессам, таким как поляризация, результаты in vivo и in vitro могут отличаться. А именно, путем моделирования динамических взаимодействий с участием кадгеринов, ECM и цитоскелета было показано, что сортировка клеток не обязательно масштабируется абсолютной поверхностной плотностью кадгерина, так как она зависит от множества факторов (Amack and Manning, 2012). Хотя понятно, что физические силы внутри ткани способствуют массивным перемещениям клеток, которые происходят во время самоорганизации/сборки органоидов, то, как адгезивная энергия взаимодействует с напряжением кортекса, не полностью понятно. Более того, степень, в которой сортировка принимает участие в эмбриогенезе, не только для стимулирования движения клеток, но и для дифференциации и спецификации судьбы клеток, в значительной степени неизвестна (Fagotto, 2014). Уровни кадерина также играют роль в процессе эпителиально-мезенхимного перехода (ЕМТ) - обратной эпителизации. Именно этот процесс освобождает плотно упакованные эпителиальные клетки, изменяя контакты клеток и активируя процессы, которые способствуют миграции клеток. В частности, E-кадгерин подавляется во время ЕМТ, в течение которого межклеточные взаимодействия уменьшаются и заменяются N-кадгерином, который обусловливает более слабые межбелковые взаимодействия (Moore et al., 2014). В то же время клетки меняют свой профиль передачи сигналов и перестраивают свой цитоскелет, что способствует движению клеток (Lamouille et al., 2014). Важно отметить, что ЕМТ играет роль в формировании зародышевого слоя, способствуя проникновения клеток эпителиальных эпибластов в примитивную полоску (Stern, 2004). Fig. 1. Self-organization into organoids, gastruloids and embryoids. (A) A cluster of dissociated mouse embryonic stem cells (mESCs) cultured in a medium containing extracellular matrix (ECM) proteins and minimal growth factors spontaneously self-organizes, first into a polarized quasi-spherical epithelial tissue, then later giving rise to a structure resembling an optic cup. Rx+ cells (green) mark the retinal anlage; Mitf+ cells (red) mark the epithelial shell of the optic cup. NR, neural retina; RPE, retinal pigment epithelium. Microscopy image adapted with permission (Eiraku et al., 2011). (B) Dissociated human embryonic stem cells (hESCs) are seeded on a surface patterned with polymerized ECM proteins, creating demarcated cell colonies of defined size and shape. Subsequent addition of morphogen may give rise to the patterned differentiation of cells. In the case of BMP4 induction, patterned cells form gastruloids with all germ layers (Deglincerti et al., 2016b; Warmflash et al., 2014). Colors in patterned cell colonies represent different germ layers. (C) Some routes by which cells can be induced to form a multilayered embryoid. Left pathway: hESCs form an organized 3D structure, and subsequent induction leads to pattern formation. Right pathway: the mixing of multiple cell types gives rise to sorting and differentiation into an organized embryoid. Factors that regulate cavitation and lumenization Недавние успехи подходов по 3D культивированию ткани, включая методы получения органоидов, гаструлоидов и эмбриоидов, также предоставили способы изучения образования полостей и просветов. Напр., путем внедрения hESCs в гель из ECM белков было показано, что hESCs спонтанно формируют просвет (Fig. 2C)в результате взаимодействий с ECM (Bedzhov and ZernickaGoetz, 2014; Kadoshima et al., 2013; Taniguchi et al., 2015), тем же самым способом, как это было установлено ранее для Madin-Darby canine kidney (MDCK) и клеток колоректального рака человека (Martin-Belmonte and Mostov, 2008; Rodriguez-Fraticelli and Martin-Belmonte, 2013). В случае образования MDCK кист, ассоциированные с актином белки, такие как ezrin, переносятся в цитокинетическую плоскость, поскольку отдельные клетки сначала делятся (Bryant et al., 2014), образуя сайты, богатые актином, и маркируя инициальный регион на апикальной мембране (Apodaca et al., 2012). Клетки затем самоорганизуются в эпителий, формируя просвет на своей апикальной стороне. Очевидно, в случае диссоциированных плюрипотентных стволовых клеток человека, просвет может быть виден уже после6 первого деления между двумя клетками в 3D культуре (Taniguchi et al., 2015). Путем модификации среды 3D культуры, было продемонстрировано, что плюрипотентные стволовые клетки человека могут дифференцироваться в амнион-подобные клетки, окружающие просвет в центре колонии (Shao et al., 2016). Эти подходы для изучения образования полости открывают существующие пути для изучения онтогенетических событий, использующих эпителиальные переходы и подчеркивают важность морфологических элементов в биоинженеринге органоидов.
Input from external mechanical cues Механические сигналы, обеспечиваемые окружающей средой, также могут влиять на самоорганизацию клеток. В организме столь же простом, как вольвокс (тип зеленых водорослей), гаструляция приводит к драматической реорганизации, которая, как считается, является следствием изменений формы клеток. Зародыш Volvox - это сферический монослой, который выворачивается наизнанку, обнажая свои жгутики на внешнюю сторону (Kirk, 2005). Изображения в реальном времени и математическое моделирование показали, что несколько клеток преобразуются в клиновидные, вызывая локальную кривизну ткани, которая вместе с последовательным расширением ткани Рис. 2. Особенности самоорганизации и формирования. (A) Простой пример самоорганизации на основе полярности. Dissociated ESCs on a surface coated with polymerized ECM proteins form a polarized epithelium, with cells exhibiting apical (green) and basolateral (orange) surfaces. (B) Sorting driven by the minimization of tissue surface energy. Cells with the strongest cell-cell interactions (based on adhesive energy or tissue tension) migrate toward the interior of a cell cluster, while those with the weakest cell-cell interactions migrate toward the exterior. (C) Lumen formation in ESCs. Cells embedded in a gel of polymerized ECM proteins polarize and form a spherical embryoid with a lumen at its center. The proteins actin and ezrin are enriched at the apical part of polarized cells. Microscopy image reproduced with permission (Taniguchi et al., 2015). (D) Mechanical properties affect cell differentiation and patterning. Shown is an example demonstrating that cells cultured on a softer surface have a higher propensity for mesodermal differentiation than those cultured on a stiff surface. (E) Geometric confinement may give rise to a signaling gradient. Shown is an example of the BMP4-induced differentiation of hESCs grown in colonies of different sizes. The cells sense BMP4 only at the edge of the colony (i.e. only the cells in between the two dotted circles are competent to receive the BMP4 signal), inducing the secretion of an inhibitor which, together with the BMP4, establishes a signaling gradient. The result is a radially symmetric pattern of gene expression resembling that of germ layer formation in gastrulation. As the signaling gradient is constant, the inner cell fates do not arise in small colonies. TE, trophectoderm. Microscopy images adapted with permission (Deglincerti et al., 2016b). и контракциями, предоставляют механические силы для полного выворачивания эмбриона (Hohn et al., 2015). Перенос механических сил на эмбрион достигается с помощью кинезиновых моторов, располагающихся на цитозольных мостиках, соединяющих все клетки (Nishii et al., 2003). В др. исследовании было предположено, что хотя клеточные и сигнальные события в процессе гаструляции могут значительно отличаться у разных видов, механика гаструляции может быть эволюционно законсервирована (Brunet et al., 2013). В этом исследовании использовали ингибитор миозина, чтобы предупредить движения во время гаструляции у рыбок данио. Хотя такое воздействие не влияло на инициальную спецификацию зародышевых слоёв, ранний мезодермальный маркер, ntl (известен также как ta; brachyury ortholog), не экспрессировался у эмбрионов. Однако, при инъекции этих клеток с кусочками магнита, гаструляция воспроизводилась в условиях внешнего магнитного поля, используемого для растаскивания клеток. Этот процесс восстанавливал экспрессию ntl и связанные с ним гаструляционные перемещения в эмбрионе (Brunet et al., 2013). Согласно этим авторам, возможным объяснением этой находки может служить то, что механические силы запускают механосенсорную ядерную транслокацию β-catenin, эволюционно законсервированного пути, чтобы инициировать экспрессию нижестоящих мезодермальных генов. Формирование мезодермы также сильно чувствительно к механическим свойствам субстрата (Fig. 2D). При дифференцировке hESCs , растущих на hydrogel субстратах разной плотности, было установлено, что мягкий субстрат (с жесткостью в 400 Pa) способствует более обильной экспрессии мезодермальных маркеров, чем жесткий (60 kPa) субстрат (Przybyla et al., 2016). Конечно, жесткость тканевой культуры в обычной пластмассовой или стеклянной чашке составляет >1 GPa. Это исследование также подтвердило, чт жесткость субстрата способствует деградации β-catenin зависимым от интегрина способом, ингибируя тем самым дифференцировку мезодермы (Przybyla et al., 2016). Generating micropatterns: the role of confining external signals Эмбрион - это динамично меняющаяся система, далекая от равновесия и неясно, на какой стадии развития достигается равновесие interfacial тканевого натяжения. Несмотря на это, некоторое равновесие термодинамического феномена, описанное здесь, такое как управляемая адгезией или управляемая натяжением сортировка, по-видимому, объясняют некоторые аспекты поведения самоорганизации при образовании органоидов, почти также хорошо.
Была также продемонстрирована важность физических свойств и тканевой механики тканей, помогающих соответствующим сигнальным путям, чтобы дифференцировать клетки в направлении предназначенной ткани. Важно отметить, что судьба клетки находится под контролем сложной сигнальной сети, что в конечном итоге приводит к образованию зародышевых слоев и правильной пространственной организации паттерна в эмбрионе. Понимание того, сколько сигнальных путей функционирует и интегрирует клетки в паттерн эмбриона, является очень сложной задачей. Одно из основных предостережений об использовании эмбриоидных тел и органоидов для понимания основных механизмов конкретных сигнальных путей заключается в том, что эти системы часто не воспроизводимы с точки зрения размера, доли клеток с определенной судьбой и формы судьбоносных границ. В последнее время успехи в биофизических методологиях и визуализации живого изображения с высоким разрешением позволили добиться значительного прогресса в этом направлении путем моделирования процессов самосборки/самоорганизации на значительных количественных платформах. Например, путем пространственного предопределения hESC клеток в круги субмиллиметрового размера, так после применения белка BMP4 колонии дифференцируются в радиально-симметричный рисунок (фиг.1B, рис. 2E). Возникающая в результате картина, по существу, воспроизводит таковую, наблюдаемую у гаструлирующего эмбриона, при этом каждое кольцо экспрессирует гены, связанные с различными тканями (с краев внутрь): презумптивная внеэмбриональная ткань, эндодерма, мезодерма и эктодерма (см. Глоссарий, вставка 1) (Deglincerti et al. , 2016b, Warmflash et al., 2014). Эта система обнаружила, что рецепторы TGFβ, сверхсемейства факторов роста (в том числе BMP4), локализуются апикально на краю колонии, но в поперечном направлении в центре колонии. Поскольку BMP4 производит свой собственный ингибитор, noggin, то градиент морфогена формируется от краев внутрь, вызывая формирование радиального паттерна (рис. 2E) (Etoc et al., 2016). Было также показано, что изменения размером колонии путем формирования микропаттерна может превращать клетки в мезодерму в противовес дифференцировке в энтодерму (Lee et al., 2009), что, вероятно, будет являться следствием чувствительности краев и механизма реакции-диффузии. Микропаттерн также использовался для изучения процессов развития помимо гаструляции, а именно во время формирования и последующей характеристики кардиомиоцитов (Ma et al., 2015). Нарушение симметрии Нарушение симметрии необходимо для успешного становления оси тела и может возникать на нескольких уровнях, от внутриклеточного до эмбриологического (Stern, 2004). Один классический пример нарушения симметрии - это оплодотворение яйца амфибии. В этом случае проникновение спермия нарушает материнскую цилиндрическую симметрию, имеющуюся в неоплодотворенном яйце, и центриоль спермия организует микротрубочки яйца, так что полюс, противоположный точке входа, становится дорзальной стороной эмбриона (Wolpert et al., 2015) , Однако воспроизводимое получение нарушения симметрии in vitro оказалось сложным. Действительно, при формировании глазного бокала in vitro, несмотря на то, что у них наблюдалось поразительное сходство с организацией клеток in vivo, органоид по-прежнему не обладал некоторыми асимметричными аспектами, такими как структура с зазором в вентральной области зрительного бокала, наблюдаемая у эмбриона (Sasai et al. , 2012). Кроме того, спонтанная реорганизация клеток эмбриона цыплят в экспериментах по сортировке, хотя и приводила к правильному расположению типов клеток относительно друг друга, приводила к радиально-симметричному рисунку, несмотря на то, что эти клетки не имели радиально-симметричного паттерна у эмбриона (Steinberg, 1963). Аналогично, индуцированная BMP4 дифференциация микропаттерна hESCs, хотя и воспроизводит образование зародышевого слоя, но не нарушает радиальной симметрии (Warmflash et al., 2014). Как нарушается симметрия in vivo? В случае одной клетки клеточная поляризация может рассматриваться как событие нарушения симметрии, характеризующееся перераспределением цитоскелета и связанных с мембраной белков (фиг.3А, слева).
Этот процесс необходим для раннего развития и происходит во время процесса, называемого компакцией, при котором клетки эмбриона образуют плотно упакованный кластер и увеличивают контакты между собой (рис.3А, справа); В эмбрионе мыши это явление обычно имеет место при переходе от ст. 8 до 16 клеток (White et al., 2016a; Ziomek and Johnson, 1980). Во время образования органоидов ESC, внедренные в гель из полимеризованных белков ECM, также могут образовывать полость из-за поляризации клеток (как показано на Рис.2C). Но что может нарушить симметрию в эмбриональном масштабе? В классических экспериментах по биологии развития Шпеманн и Мангольд продемонстрировали, что пересадка кластера клеток, называемого организатором, из одной гаструлы на вентральную сторону другой, приводит к возникновению второй оси тела, в конечном итоге создавая двухголового головастика (Spemann and Mangold, 1924 ). Трансплантированные клетки способствовали созданию осевых мезодермальных производных (таких как хорда), тогда как нервная система (за исключением вентральной пластинки нервной трубки) была получена от хозяина. Важно отметить, что в этом эксперименте установлено, что нарушение симметрии вызывается локальными индуктивными сигналами (Ozair et al., 2013; Spemann and Mangold, 1924). В вопросе о том, как рано возникают эти сигналы, нарушающие симметрию, было показано, что присутствие двух-трёх бластомеров у эмбриона Xenopus с восемью клетками достаточны для индукции возникновения второй оси тела при трансплантации в эмбрион с 64 клетками (Gimlich and Gerhart, 1984). Эта область зародыша, называемая центром Ньюкупа, дает организатор Spemann-Mangold. В зависимости от стадии эмбриона при трансплантации трансплантируемый организатор может выступать в качестве индуктора нарушения симметрии в окружающих клетках или непосредственно вносить свои клетки в потомство. Поэтому локальный источник передачи сигналов и компетентность окружающих клеток отвечать на эти сигналы, являются минимальным требованием для нарушения симметрии. В случае образования дорсо-вентральной оси у лягушки этот процесс включает локализованную концентрацию BMP4 для предопределения дорсальной судьбы клеток, тогда как ингибиторы BMP4 Chordin, Follistatin и Noggin, секретируемые организатором Spemann и вместе формируют вентрализующий градиент BMP4 (Harland, 1994; Hemmati-Brivanlou et al., 1994; Hemmati-Brivanlou and Melton, 1992, 1994; Sasai et al., 1994; Smith and Harland, 1992). Локальные сигналы также важны для становления передне-задней оси тела. У мышей, например, сигналы от внеэмбриональной эктодермы и клеток дистальной висцеральной энтодермы (DVE), которые мигрируют в переднюю часть эмбриона, ограничивают сигналы, поступающие от первичной полоски проксимальных задних областей эпибласта. Этот процесс нарушает симметрию и помогает сформировать передне-заднюю ось (рис. 3А) (Stower and Srinivas, 2014). С другой стороны, лево-правосторонняя асимметрия у разных видов индуцируется концентрационным градиентом Nodal и его ингибитора Lefty. У позвоночных одна из моделей предполагает, что вращательные движения ресничек вызывает поток влево внеклеточной жидкости, что в свою очередь приводит к асимметричной активации каскада Nodal (Blum et al., 2014). Тканевая механика - еще один потенциальный ингредиент, способствующий нарушению симметрии. Посредством культивирования пост-имплантационных эмбрионов в соотв. пространстве было продемонстрировано, что внешние механические силы, которые могут возникать, скорее всего, из тканей матерей, являются ключевыми для образования эктопического утолщенного клеточного слоя, напоминающего DVE, что, в свою очередь, отвечает за становление передне-задней оси (Hiramatsu et al., 2013).
В недавнем исследовании было высказано предположение, что передне-задняя ось эмбриона мыши может образоваться в отсутствие каких-либо материнских сигналов (Bedzhov et al., 2015). Таким образом, целиком роль, с которой тканевая механика может влиять на формирование оси у гаструлирующего эмбриона, пока не определена. Несмотря на растущее знание сигнальных путей и клеточных событий, которые приводят к нарушению симметрии, точные молекулярные и физические основы, которые вызывают асимметрию, а также точное время событий, связанных с симметрией, остаются неуловимыми. Более того, остается неясным, можно ли дифференцировать hESC в истинные типы вне-эмбриональных клеток, что может быть важным техническим ограничением для достижения спонтанного нарушения симметрии in vitro. Тем не менее, некоторые недавние работы показали, что эмбриоидные тела или меньшие агрегаты могут в какой-то степени нарушать симметрию, о чем свидетельствует локальная экспрессия генов первичной полоски, либо в ответ на экзогенную стимуляцию Wnt (ten Berge et al., 2008), либо в ответ на стимуляцию активином А или агонистом Wnt CHIR99021 (van den Brink et al., 2014). Последняя демонстрация кажется надежной и даже обнаруживат сходство с образованием и удлинением оси, как это видно на эмбрионе мыши. Важно отметить, что нарушение симметрии, наблюдаемое в этих экспериментах, не нуждается в источнике инициального локального морфогена и очень чувствительно к начальному размеру агрегата (van den Brink et al., 2014). Это наблюдение, разумеется, не противоречит физическим основам формирования паттерна; Тьюринг удачно предположил, что взаимодействие активаторов и их ингибиторов в модели реакции-диффузии может привести к образованию паттернов из первоначально однородного поля морфогена (Turing, 1952). В последующих моделях были внесены минимальные ингредиенты, которые приводят к нарушению симметрии в ландшафте концентрации морфогена (Gierer and Meinhardt, 1972). Таким образом, математическое моделирование (Corson and Siggia, 2012; Gierer and Meinhardt, 1972; Turing, 1952) вместе с полученными экспериментальными примерами позволяет получить важные сведения о переменных (таких как размерность и плотность клеток), которые необходимо учитывать при создании органоидов in vitro. Также становится все более очевидным, что нарушение симметрии может происходить гораздо раньше в развитии, чем считалось ранее, до образования оси тела или даже разделения клонов. Действительно, это
Рис. 3. Нарушение симметрии в клетках и органоидах. (A) (слева) Нарушение симметрии на уровне одной ячейки. В этом примере клетки реорганизуют свои цитоскелетные и мембранно-закрепленные белки с образованием апикально-базальной полярности, причем среди многих других белков интегрины на базальной стороне и актин на апикальной. (Справа) Нарушение симметрии на многоклеточном уровне. В случае раннего мышиного эмбриона поляризация клеток лежит в основе процесса уплотнения, в результате чего кластер из восьми слабосвязанных неполяризованных клеток становится плотно упакованным, что значительно увеличивает контакты клеток и приводит к поляризации клеток. (B) Примеры потенциальных подходов к индукции нарушения симметрии в органоидах. (I) Нарушение симметрии с механизмом диффузионной реакции. Добавление морфогенов в эмбриоидные тела может вызвать секрецию индуктивных и ингибирующих молекул из клеток. Через процесс реакции-диффузии (Тьюринга) первоначально однородно распределенный сигнал может после достижения устойчивого состояния вызывать устойчивый градиент сигнализации, который, в свою очередь, может вызвать асимметричные изменения в судьбе клеток внутри органоида. (Ii) Нарушение симметрии также может быть вызвано путем локальной доставки морфогена с микропипеткой; В этом случае клетки, подвергнутые воздействию самого высокого уровня морфогена, будут индуцированы для изменения судьбы. (Iii) Нарушение симметрии через локальную секрецию морфогена из привитых клеток (красный) в органоиде, состоящем из другого типа клеток (синий). это становится очевидным, что выглядящие морфологически эквивалентными клетки эмбрионов на самом деле весьма различны с точки зрения их молекулярных профилей. Например, недавние эксперименты показали, что существует различающаяся межклеточная экспрессия белков уже на четырехклеточной стадии эмбриона мыши, хотя разделение судьбы на примитивную энтодерму, эпибласт и трофэктодерму происходит на ст. перехода от 16 к 32 клеткам (Goolam et al., 2016; White et al., 2016b). Кроме того, путем измерения динамики связывания факторов транскрипции с ДНК, было показано, что Sox2, кодирующий транскрипцию фактора плюрипотентности, обнаруживает гораздо более длительное связывание с ДНК в определенных бластомерах эмбриона с четырьмя клетками; эти бластомеры с более долгоживущими комплексами Sox2-ДНК позже вносили вклад в плюрипотентные клетки внутренней клеточной массы. Согласно этому исследованию, первое событие нарушения симметрии может быть вызвано при переходе от двух к четырем клеткам (Goolam et al., 2016; Torres-Padilla et al., 2007). В согласии с этим исследованием, одноцелевые транскриптомные анализы эмбрионов мыши показали, что по меньшей мере один бластомер в эмбрионе с четырьмя до восьми клеток демонстрирует низкие уровни экспрессии гена, стоящего иерархически ниже Sox2 (Goolam et al., 2016), это указывает на то, что предопределение клонов клеток происходит гораздо раньше, чем это морфологически проявляется. Эти наблюдения также усиливают представление о том, что ошибки в делении клеток (Shi et al., 2015) или случайные транскрипционные шумы (Eldar and Elowitz, 2010; Elowitz et al., 2002) могут быть механизмом, который приводит к нарушению симметрии эмбриона. Таким образом, из анализа нарушения симметрии как in vivo, так и в восстановленных системах вытекает несколько общих механизмов. Некоторые события, нарушающие симметрию, кажутся клеточно-автономными, определяются родительскими или закодированы к асимметричной экспрессии генов в клетках очень раннего эмбриона. Другие события, вызывающие нарушение симметрии, вызываются нарушениями градиента морфогена, определяемого локальным источником. Наконец, механизмы реакции-диффузии могут приводить к нарушению симметрии, несмотря на первоначальное гомогенное распределение морфогена. Благодаря продвижению методов 3D-культуры будущие усилия (рис. 3B) обеспечат лучшее понимание этих событий, связанных с симметриями, особенно на одноклеточном и молекулярном уровнях. Например, как было продемонстрировано ранее (van den Brink et al., 2014), простое добавление морфогена к среде, окружающей 3D-культуры, может привести к нарушению симметрии из-за механизма диффузионной реакции (рис. 3B). Лучшее понимание ингибиторов, которые клетки выделяют при стимуляции, в сочетании со способностью создавать различные топологии тканей, может обеспечить понимание многих процессов развития. Более того, было бы очень интересно определить степень, с которой создание локального градиента морфогена нарушает симметрию. Такие эксперименты могут быть выполнены, например, с использованием микропипетки для инъекций морфогена, микрофлюидных методов или, возможно, путем пересадки различных типов клеток (фиг.3В). Важно отметить, что эти эксперименты обеспечат уникальное понимание молекулярных основ нарушения симметрии и могут также помочь в разработке методов создания органоидов, которые наиболее близки к их аналогам in vivo. The control of size and timing during development Даже после правильной самоорганизации клеток и нарушения симметрии правильное развитие организма требует точного контроля времени и размера. Наше понимание регуляции и интеграции этих двух переменных во время развития остается проблематичным. В частности, понимание того, как масштабируется формирование паттерна с размером организма и что определяет абсолютный размер организма, остаются ключевыми вопросами в этой области. Последнее интимно связано с временным контролем, поскольку существует очевидная корреляция между размером организма и сроками развития, но также с тем, что каждый шаг развития происходит с постоянными временными интервалами у одного и того же вида. Size control and scaling Формирование паттерна зависит от размера эмбриона; по этой причине позиции паттерна относительны у эмбриона, а не абсолютны.
Большая часть этого вопроса изучалась у мух на различных моделях (Kicheva and Briscoe, 2015). Например, развитие имагинального крылового диска вдоль передней-задней оси считается находящимся под контролем градиента Decapentaplegic (Dpp, аналог BMP). Интересно, что градиент приспосабливается к размеру компартмента, при этом уровни Dpp максимальны в центре и минимальны по краям, и соответственно масштабируется паттерн (Hufnagel et al., 2007; Nellen et al., 1996; Teleman and Cohen, 2000). Также были предложены теоретические объяснения других известных примеров масштабирования у мух, такие как масштабирование градиента материнского Bicoid (Bcd), который устанавливает передне-заднюю ось в начале развития (He et al., 2015). Важные уроки в области масштабирования развития также получены из исследований лягушек. После разрезания эмбриона лягушки пополам спинная сторона, содержащая организатор, развивается в пропорционально масштабированный, хотя и меньший эмбрион (Reversade and De Robertis, 2005). Более того, несмотря на различия в размерах среди видов амфибий и изменчивость размеров яиц и гаструл одного и того же вида, животные всегда имеют одинаковый паттерн. Было также показано, что ингибитор BMP Chordin образует динамическую петлю обратной связи с ее стабилизирующим белком Sizzled: на вентральной стороне эмбриона амфибий Sizzled контролирует уровни Chordin и, следовательно, градиент BMP, который, в свою очередь, устанавливает паттерн (Inomata et al. ., 2013). В отличие от этих примеров, было показано, что масштабирование структуры нервной трубки у двух птиц разного размера обусловлено различием в пороге, при котором клетки двух видов реагируют на сигналы (Uygur et al., 2016). Существуют и другие примеры и теоретические модели, которые ещё больше проясняют масштабирование формирования паттерна in vivo (Kicheva and Briscoe, 2015; Umulis and Othmer, 2013). Но что известно о масштабировании и формировании паттернов in vitro? Например, двумерные гаструлоиды, образованные в замкнутых колониях, не масштабируют свой паттерн соразмерно ткани (Warmflash et al., 2014). Вместо этого при уменьшении размера ткани они теряют некоторые предначертанные судьбы, которые обычно присутствуют в интерьере колонии, как и следовало ожидать для механизма передачи сигналов, ограниченной краем (рис. 2E) (Etoc et al., 2016). В настоящее время неясно, имеют ли органоиды и эмбриоиды какой-либо контроль роста или масштабирования структуры. Таким образом, было бы интересно проверить, могут ли механизмы контроля размера, наблюдаемые у эмбрионов, быть воспроизведены in vitro. The control of developmental timing in vivo and in vitro Хотя приведенные выше эксперименты дают некоторое представление о существовании надежного механизма масштабирования размеров, многое еще предстоит выяснить. Кроме того, мало известно о регулировании сроков развития. Наступление некоторых событий в пре-имплантационном эмбрионе мыши, по-видимому, зависит от сложной комбинации факторов, которые могут обеспечить некоторую "меру" времени, включая размер эмбриона, общее количество клеток, количество делений клеток, ядерно-цитоплазматическое соотношение, репликацию ДНК, и специфические эффекторы в цитоплазме (Kojima et al., 2014). Например, было высказано предположение, что существует ингибирующий цитоплазматический фактор, присутствующий в одноклеточном эмбрионе, который может регулировать размер эмбрионов на ранней стадии развития; разведение этого фактора при дроблении эмбриона ниже некоего порога может вызвать начало компакции (Lee et al., 2001). Аналогично, порог в ядерно-цитоплазматическом отношении, который экспоненциально возрастает перед компакцией, может быть другим фактором времени (Kojima и др., 2014). Особенно интригующий эксперимент показал, что после уничтожения даже 90% эмбриона мыши при гаструляции эмбрионы в большинстве случаев восстанавливаются к концу органогенеза, хотя и с уменьшенной общей массой, подразумевая скоординированное действие между сроками и размером эмбриона (Snow and Tam, 1979). Подобный эффект наблюдался после удаления бластомеров из четырехклеточного мышиного эмбриона с использованием микроманипуляции; пролиферация ускоряется до тех пор, пока число клеток не восполнится и дальнейшее развитие происходит нормально (Power and Tam, 1993). В обоих случаях сроки развития отдельных органов не были согласованы со сроками развития других органов по сравнению с той согласованностью, которая наблюдался в здоровом контроле, хотя в большинстве случаев развитие было восстановлено к E12.5 (Kojima et al., 2014). Эти эксперименты показывают, что существуют основные механизмы, которые могут ускорить и, таким образом, контролировать динамику пролиферации и роста тканей вплоть до и во время органогенеза и, возможно, позже. Однако эти механизмы все еще остаются загадкой. Время формирования некоторых органоидов, таких как органоиды мозга, более или менее соответствует сроками развития in vivo в зависимости от используемого анализа (Gaspard et al., 2008; Turner et al., 2016). Кроме того, время дифференциации нейронов, по-видимому, специфично для видов, как показано in vivo, о чем свидетельствует более медленное созревание нейронное из hESC по сравнению с ESC (Otani et al., 2016) и более быстрая дифференцировка in vitro клеток мыши в нейроны по сравнению с клетками человека (Wichterle et al., 2002). В случае рассмотренного ранее оптического бокала потребовалось гораздо больше времени для образования органоидов из клеток человека, чем из клеток мыши (Kuwahara et al., 2015), это снова отражает различия в продолжительности развития у этих видов. Существует соблазн предположить, что время развития не зависимо от одной ткани к другой, это подтверждается наблюдением, что время коррекции развития у мыши не одинаково для каждого органа, как обсуждалось выше (Kojima et al., 2014). Возможны и другие объяснения: самоорганизация, например, сама по себе может быть ограничивающим фактором. Очевидно, необходимы дальнейшие исследования для лучшего понимания пространственно-временного контроля эмбрионального развития у млекопитающих. Каким образом контроль размера связи со временем? Какова роль сигнальных молекул по сравнению с ролью механических воздействий? Являются ли дифференцировка и развитие в целом связанными с регулированием размера и времени на уровне одной клетки? Органоиды, эмбриоиды и гаструлоиды представляют собой новую платформу для изучения механизмов, которые лежат в основе контроля размеров и времени в развитии, а быстрые успехи в создании, характеристике и количественном анализе этих структур, вероятно, приведут к многим открытиям в ближайшем будущем. Future perspectives Различные события самосборки и самоорганизации происходят во время развития эмбриона, органоида или гаструлоида. Как мы отметили в этом обзоре, становится ясно, что множественные комплексные факторы влияют на то, как клетки формируют паттерн ткани, как in vivo, так и in vitro. Возможно, что по этим причинам некоторые органоиды, такие как органоиды мозга, по-видимому, дают более воспроизводимые морфологические структуры, чем другие органоиды (van de Wetering et al., 2015). Возможные объяснения этого наблюдения заключаются в том, что мозговые органоиды обычно содержат гораздо больше типов клеток, чем другие органоиды, поэтому ландшафт взаимодействия намного сложнее. Более того, нейронная индукция занимает больше времени, чем дифференциация других тканей, поэтому любые ошибки, внесенные в начале, могут быть усилены с течением времени. Наконец, технические ограничения тканевой культуры, вероятно, повлияют на развитие органоидов. Хотя органоиды in vitro обычно производятся путем культивирования стволовых клеток в условиях, которые имитируют, насколько это возможно, ситуацию in vivo, мы все еще далеки от полного понимания всех сложных межклеточных и клетки-ECM, взаимодействий, также как и сигнальной сети, которая действует во время развития. Поэтому работа в ближайшем будущем требует знаний, полученных из биологии развития, и ее интеграции с физикой и биоинженерией для создания более устойчивых и воспроизводимых культур органоидов. Мы прогнозируем несколько аспектов, которые в ближайшем будущем ознаменуют значительное развитие. (1) Формировани микропаттерна. На многие ключевые вопросы были даны ответы с использованием эмбриоидных тел; однако эти системы обычно приводят к дезорганизованным структурам и поэтому их трудно использовать для решения количественных вопросов. Разработка микропотоковых анализов предлагает воспроизводимые способы создания органоидов, которые гораздо более поддаются количественным исследованиям, открывая важную главу в исследовании человеческого развития. (2) 3D-культуры. Недавние усилия по созданию более организованных трехмерных структур из hESCs - эмбриоидов - скорее всего, будут развиваться еще дальше благодаря разработке сложных гидрогелей, которые позволят клеткам организовывать более сложные структуры воспроизводимым образом (Gjorevski et al., 2016). Эти системы могут также служить средством для изучения событий, связанных с симметрией, путем локального доставки морфогенов либо методами микроинъекции, либо использованием совместных культур (Рис.3В). (3) Одноклеточное секвенирование. Впечатляющие успехи техники секвенирования одиночных клеток в последние годы значительно улучшат развитие органоидов, позволяя исследователям сравнить молекулярные сигнатуры клеток в этих структурах с их презумптивными аналогами эмбриона. Эти методы также помогут нам получить представление о молекулярных основах процессов самоорганизации в органоидах и эмбриоидах как во времени, так и в пространстве. (4) Микроскопия в реальном времени. Мы прогнозируем, что быстрые разработки в области световой микроскопии в сочетании с технологиями редактирования генов обеспечат важную информацию о молекулярной основе спецификации клонов и морфогенетических изменениях, которые происходят в раннем развитии с разрешениями, которые никогда не были возможными до этого. Каждый из этих методов имеет свои собственные ограничения. Например, в то время как 2D паттерн-формирующие культуры не имеют трехмерной архитектуры эмбриона, трехмерные эмбриоиды не точно представляют форму человеческого эмбриона, а 3D-гаструлоиды не генерируют ту же топологическую организацию различных тканей, что и в эмбрионе. Таким образом, одного метода недостаточно для ответа на все ключевые вопросы в области раннего развития, и поэтому их интеграция имеет решающее значение. В целом, разработка этих методов открывает путь к регенеративной медицине и, возможно, даже к биоинженерии человеческих органов.
|