Посещений:
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПЛАЙСИНГ, ВЫЗЫВАЕМЫЙ ТЕПЛОВЫМ ШОКОМ



Роль hnRNP K

Control of the heat stress-induced alternative splicing of a subset of genes by hnRNP K
KoichiYamamoto, Mari T. Furukawa, Kazuhiro Fukumura et al
Genes to Cell Volume 21, Issue 9 September 2016 Pages 1006-1014

Pre-mRNA splicing is widely repressed upon heat shock in eukaryotic cells. However, it has been shown that HSP105 pre-mRNA is alternatively spliced in response to heat stress. Using RNAi screening in HeLa cells, we found that RNA-binding proteins hnRNP K and PSF/SFPQ are necessary for the exon 12 exclusion of HSP105 during heat stress. Moreover, exon array analyses showed that a group of genes is alternatively spliced during heat stress in an hnRNP K-dependent manner, whereas hnRNP K is not necessary for the stress-induced alternative splicing of the remaining genes. Among the latter group, we found that SRp38/SRSF10 and SC35/SRSF2 are necessary for the inclusion of exon 13 of TNRC6A during heat stress. Thus, our study clearly showed that several RNA-binding proteins are involved in the splicing regulation in response to heat stress in mammalian cells
Экспрессия генов контролируется в ответ на клеточные стрессы. Известно, что сплайсинг пре-мРНК широко репрессируется после теплового шока в клетках эукариот (Yost & Lindquist 1986; Bond 1988; Shukla et al.1990). клетках эукариот. Недавнее исследование показало распространенное подавление сплайсинга затрагивает более 1700 генов во время теплового шока (44 °C) в фибробластах мышей (Shalgi et al. 2014).
Сплайсинг пре-мРНК катализируется крупным рибонукленопротеиновым комплексом, наз. Спалйсесома, который содержит пять небольших рибонуклеопротеинов (snRNPs), U1, U2, U4, U5 и U6, а также многие белка факторов сплайсинга (for a review, see Lee & Rio 2015). Не включенные в сплайсесомы РНК-связывающие белки, включая белки, богатые серином/аргинином (hnRNPs), соединяются с разными типами цис-действующих экзонных и интронных элементов и контролируют альтернативный сплайсинг. SR белки, обладающие одним или двумя, РНК распознающими мотивами (RRMs) и сопровождаемые доменом, богатым сериновыми и аргининовыми остатками (RS domain), обычно соединяются с экзонными энхансерами сплайсинга (ESEs) и активируют реакции сплайсинга. Напротив, разные hnRNP белки обычно соединяются с экзонными и интронными сайленсерами сплайсинга (ESSs и ISSs, соотв.) и репрессируют сплайсинг-реакции.
В клетках млекопитающих детрукция или инактивация U snRNPs вызывается во время теплового стресса (rev. Biamonti & Caceres 2009). Установлено, что один из белков SR, SRp38 (известен также как SRSF10), играет критическую роль в репрессии сплайсинга после теплового шока. Фосфорилированный SRp38 функционирует как активатор сплайсинга, тогда как дефосфорилированный SRp38 репрессирует сплайсинг, возможно благодаря взаимодействию с U1 snRNP (Shin et al. 2004). Serine/threonine фосфатаза PP1 ответственна за дефосфорилирование SRp38 во время теплового шока (Shi & Manley 2007). После теплового шока HSP27 стимулирует восстановление сплайсинга и повтороное фосфорилирование SRp38 (Marin-Vinader et al. 2006).
Heat shock proteins (HSPs) выполняют важные роли во время тепловых стрессов, действуя как молекулярные шапероны и защищая клетки от повреждений (rev. Velichko et al. 2013). Экспрессия HSP генов обеспечивается heat shock transcription factors (HSFs). Хотя большинство HSP генов не содержат интронов, транскрипты некоторых интрон-содержащих HSP генов, таких как HSP90a человека, подвергаются эффективному сплайсингу во время теплового шока (Jolly et al. 1999). Более того, показано, что Hsp47 и Hsp105 (известен также как Hsph1) pre-mRNAs подвергаются альтернативному сплайсингу в ответ на тепловые стрессы. 5' не кодирующий экзон мышиного Hsp47 альтернативно используется с помощью 5' выбора места сплайсинга, генерации сплайсинг изоформ, которые транслируются более эффективно во время теплового шока (Takechi et al. 1994). При нормальных условиях Hsp105 продуцирует белок, который локализуется в цитоплазме. Напротив, экзон 12 из Hsp105 исключается при умеренном тепловом шоке, приводя к продукции ядерного белка (Yasuda et al.1999; Saito et al. 2007). Т.о. , скорее всего, группа транскриптов не является предметом сплайсинга, но субнабор таких транскриптов подвергается альтернативному сплайсингу во время теплового стресса.
В данном исследовании мы сконцентрировались на механизме, лежащем в основе альтернативного сплайсинга HSP105, контролируемого во время теплового стресса. Используя скрининг RNAi, мы обнаружили, что hnRNP K и PTB-ассоциированный фактор сплайсинга /сплайсинг-богатый глютамином (PSF / SFPQ) необходимы для исключения экзона 12 HSP105, вызванного тепловым стрессом. Более того, анализ ряда экзонов показал, что группа генов альтернативно сплайсируется во время теплового стресса hnRNP в K-зависимом режиме, тогда как hnRNP K не является необходимым для вызванного стрессом альтернативного сплайсинга остальных генов. В качестве одного из примеров последней группы мы обнаружили, что SRp38 и SC35/SRSF2 необходимы для включения экзона 13 тринуклеотидного повтора, содержащего 6A (TNRC6A) во время теплового стресса. Таким образом, наше исследование ясно показало, что в регуляции сплайсинга участвуют несколько РНК-связывающих белков в ответ на тепловой стресс в клетках млекопитающих.

Discussion


Итак, альтернативный сплайсинг HSP105 контролируется с помощью hnRNP K и PSF, тогда как таковой TNRC6A обеспечивается с помощью SRp38 и SC35 в клетках человека (Fig. 6).

Figure 6.

Mechanisms of the heat stress-induced splicing. The present study suggests that hnRNP K and PSF/SFPQ induce the exon 12 exclusion of HSP105 during heat stress. In the case ofTNRC6A, hnRNP K represses exon 13 usage under normal conditions, and SRp38/SRSF10 and SC35/SRSF2 are necessary for the induction of exon 13 inclusion upon heat stress.



Impact of alternative splicing induced by heat stress


Сообщалось, что, хотя сплайсинг различных генов широко ингибируется во время теплового шока, сплайсинг из 600 генов оставался полностью незатронутым (Shalgi et al., 2014). Nevo et al. (2012) показали, что интронные латентные донорские участки активируются путем теплового шока: латентный сплайсинг обладает потенциалом внесения преждевременных терминальных кодонов (ПТК) в мРНК. Интересно, однако, что сплайсинг сохраненного интрона в мышиных Clk1 / 4 пре-мРНК стимулируется стрессами такими, как тепловой шок и осмотический стресс, генерирующие функциональные SR-киназы SR (Ninomiya et al., 2011). Т.о., скорее всего, определенная группа функциональных белков или специфических изоформ белков может продуцироваться посредством зависимого от стресса сплайсинга. Наш GO анализ подтвердил, что многие гены, участвующие в разного типа клеточных событиях, таких как клеточный цикл, убиквитинирование м метаболизм мРНК, также как и реакции на стрессы, контролируются с помощью альтернативного сплайсинга во время теплового шока. Примечательно, что некоторые гены, кодирующие факторы сплайсинга, такие, как SR белки (SRSF), подвергаются альтернативному сплайсинге при тепловом шоке. Т.о., возможно, что альтернативный сплайсинг SRSF генов вызывается на ранней фазе теплового шока, что дополнительно приводит к регуляции сплайсинга различных генов в более сложные паттерны во время теплового стресса.

Mechanisms of heat stress-induced alternative splicing


Дефосфорилированный SRp38, как известно, ингибирует сплайсинг РНК во время теплового стресса (Shin et al. 2004). ыло также предположено, что hnRNP M действует во время раннего ареста индуцированного стрессом сплайсинга (Gattoni et al. 1996). Напротив, предыдущие исследования показали, что альтернативный сплайсинг некоторых Hsp генов вызывается в ответ на тепловой стресс (Takechi et al. 1994; Yasuda et al. 1999). Изучая альтернативный сплайсинг HSP105, мы показали, что консервативный экзонный C-богатый элемент у млекопитающих необходим для тепловым шоком вызываемого пропуска экзонов. Возможно, что дополнительные чувствительные к тепловому стрессу элементы могут располагаться во фланкирующих регионах экзона 12, поскольку hsp105 Ex12 репортер обнаруживает более слабую реакцию на тепловой стресс, чем hsp105 IntEx12 репортер. Было также предположено, что CA-богатая последовательность (нуклеотиды 56-67 в экзоне 12) действует как энхансер экзонного сплайсинга (ESE), который1 может быть нацелен с помощью активаторов сплайсинга, подобных SR белкам. Кроме того, некоторые мутации в др. экзонных регионах, затрагивают альтернативный сплайсинг до некоторой степени. Мы полагаем, что такие мутации могут затрагивать альтернативный сплайсинг возможно за счет изменения РНК контекста, хотя мы не исключаем возможности, что некоторые дополнительные элементы, такие как экзонные сайленсеры участвуют в альтернативном сплайсинге.
Используя siRNA скрининг, мы установили, что во время теплового стресса альтернативный сплайсинг HSP105 контролируется с помощью hnRNP K и PSF, но не с помощью SRp38. Было показано, что hnRNP K контролирует альтернативный сплайсинг нескольких генов, таких как apoptotic peptidase-activating factor 1 (APAF1) и protein tyrosine kinase 2 (PTK2B) (Venables et al. 2008). PSF / SFPQ является кислотно-связывающим белком с двумя RRM, который участвует в различных процессах экспрессии генов, включая регулирование сплайсинга (Yarosh et al. 2015). Т.о., возможно, что hnRNP K и PSF действуют как репрессоры сплайсинга HSP105 экзона 12, возможно посредством C-богатого элемента, противодействующего активаторам сплайсинга (Fig. 6). Однако, механизм, лежащий в основе того, как hnRNP K и PSF регулируются в ответ на тепловой стресс, ещё предстоит выяснить.
Анализ массива экзонов в комбинации с siRNA нокдауном hnRNP K показывает, что субнабор генов, таких как SRSF11, PPP1CB и ZDHHC20, подвергается альтеренативному сплайсингу K-зависимым способом во время теплового стресса. Напротив, в случае HSP105, hnRNP K необходим для включения экзона в SRSF11, PPP1CB и ZDHHC20. Предыдущие исследования подтвердили, что hnRNP K способствует как пропуску, так и включению экзонов (Venables et al. 2008). Однако, необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить, что hnRNP K прямо способствует включению экзона в транскрипты мишени.
Мы установили также, что многие гены подвергаются альтернативному сплайсингу способом, независимым от hnRNP K во время теплового стресса. Среди таких генов SRp38 и SC35 необходимы для индуцируемого стрессом сплайсинга TNRC6A (Fig. 6). Было интересно прояснить, действительно ли дефосфорилирование SRp38 участвует в индукции альтернативного сплайсинга как это происходит в случае подавления сплайсинга во время теплового стресса.
Наш дальнейший анализ экзонов подтвердил, что альтернативный сплайсинг некоторых генов индуцируется тепловым стрессом способом, независимым как от hnRNP K, так и SRp38 (our unpublished observation). Т.о. , скорее всего, различные РНК-связывающие белки функционируют в ответ на тепловой стресс, организуя регуляторную сеть из разных групп генов посредством альтернативного сплайсинга, а также подавления сплайсинга, чтобы отвечать соотв. образом на стресс.