Система CRISPR-Cas9 является бактериальной защитной иммунной системой, которая защидает бактерии от инфекции фагами. Посредством РНК-наводимой активности эндонуклеазы Cas9 они деградируют двунитчатую ДНК соседствующую с protospacer adjacent motif (PAM) и в результате комплементарности РНК гида (1, 2,3, 4, 5). Недавно были идентифицированы два анти-CRISPR белка (AcrIIA2 и AcrIIA4 из Listeria monocytogenesprophages), оба ингибировали активность Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9) и L. monocytogenes Cas9 в бактериях и клетках человека (6). Однако, механизм обусловленного с помощью AcrIIA2- или AcrIIA4 подавления Cas9 оставался неизвестным. Здесь описывается кристаллическая структура SpyCas9 в комплексе с single-guide RNA (sgRNA) и AcrIIA4. Полученные данные показали, что AcrIIA2 и AcrIIA4 взаимодействуют с SpyCas9 зависимым от sgRNA способом. Структура показывает, что AcrIIA4 подавляет активность SpyCas9 за счет структурного воспроизведщения (mimicking) PAM, чтобы занять PAM-взаимодействующий сайт в PAM-взаимодействующем домене, блокируя тем самым распознавание двунитчатого ДНК субстрата с помощью SpyCas9. AcrIIA4 кроме того ингибирует активность эндонуклеазы SpyCas9, заслоняя её RuvC активный сайт. Структурное сравнение показало, что образвание AcrIIA4-связывающего сайта в SpyCas9 индуцируется с помощью связывания sgRNA. Полученные данные выявили механизм подавления SpyCas9 с помощью AcrIIA4, предоставляя структурную основу для разработки 'off-switch' инструментов для SpyCas9, чтобы избегать нежелательного геномного редактирования в клетках и тканях.