FGF signaling enforces cardiac chamber identity in the developing ventricle.
 Development (2017) 144, 1328-1338 doi:10.1242/dev.143719 | |
|---|---|
|
Гены Nkx, по-видимому, находятся почти на вершине транскрипционной иерархии, которая гарантирует сохранение качественных особенностей рано дифференцированных и поздно дифференцированных кардиомиоцитов. Мы попытались определить сигнальные пути, которые стоят выше Nkx генов, чтобы контролировать сохранение вентрикулярных характеристик. Привлекательным кандидатом является путь передачи сигналов FGF, т.к. в предыдущих исследованиях было продемонстрировано его влияние на индукцию экспрессии nkx2.5 и на регуляцию размера желудочков. У рыбок данио, кур и Xenopus, экспрессия nkx2.5 в мезодерме передней латеральной пластинки существенно снижена, когда подавлен путь FGF (Alsan and Schultheiss, 2002; Keren-Politansky et al., 2009; Reifers et al., 2000; Sim?es et al., 2011). Кроме того, ингибирование передачи сигналов FGF во время гаструляции у рыбок данио уменьшает количество клеток обеих кардиальных камер, при этом наблюдается более сильное влияние на желудочки (Marques et al., 2008). Это раннее влияние передачи сигналов FGF отражается на более поздних стадиях, когда передача сигналов FGF способствует ускорению поздно дифференцирующихся клеток на артериальном полюсе желудочка (de Pater et al., 2009; Lazic and Scott, 2011; Marques et al., 2008; Zeng and Yelon, 2014). Сходным образом у мышей гипоморфный аллель Fgf8 или ткане-специфическая делеция Fgf8 приводят к образованию гипопластичного правого желудочка и тракта оттока (Abu-Issa et al., 2002; Ilagan et al., 2006; Park et al., 2006). Здесь мы продемонстрировали ранее недооцененную роль передачи сигналов FGF во время развития желудочков: помимо стимуляции локализации (allocation) соотв. количества вентрикулярных кардиомиоцитов, передача сигналов FGF гарантирует, что эти клетки соотв. поддерживают свои специфичные для желудочков характеристики. Мы установили, что ингибирование передачи сигналов FGF вслед за началом специфичной для камер дифференцировки приводит к постепенному накоплению атриальных клеток, сопровождаемому потерей вентрикулярных клеток и обнаруживается прогрессивное увеличение появления эктопических клеток, экспрессирующих amhc в желудочках. Исследование динамики локализации Vmhc и Amhc, а также анализ amhc-экспрессирующих клеток, используя фото-конвертируемый трансген, подтверждает, что устойчивая передача сигналов FGF необходима, чтобы репрессировать приобретение атриальных признаков вентрикулярными кардиомиоцитами. Эта роль передачи сигналов FGF влияет на сохранение вентрикулярных характеристик, как в рано дифференцирующихся клетках, формирующих первоначальный желудочек, так и поздно дифференцирующихся клеток, вносящих вклад в атриальный полюс. Наконец, мы продемонстрировали, что передача сигналов FGF действует выше Nkx генов, чтобы осуществлять свою важную функцию по приобретению вентрикулярных характеристик. Итак, наше исследование предоставило информацию о механизмах, регулирующих пластичность и детерминацию вентрикулярных кардиомиоцитов, которые являются фундаментально важными для стратегий кардиальной регенеративной медицины.
Ингибирование передачи сигналов FGF приводит к эктопической экспрессии amhc в желудочках мутантных fgf8a рыбок данио, имеющих небольшие сердца с тяжелым дефицитом размеров предсердий и желудочков (Marques et al., 2008; Reifers et al., 2000). Нами было показано, что передача сигналов FGF выполняет раннюю роль, способствующую продукции кардиомиоцитов предсердий и желудочков, при этом особенно значительный эффект обнаруживается в кардиомиоцитах желудочков (Marques et al., 2008). Эта функция передачи сигналов FGF объясняет уменьшенный размер камер сердца у fgf8a мутантов, но остается необъясненным аспект мутантного фенотипа fgf8a: в противоположность сердцам дикого типа (Fig. 1A,E), fgf8a мутантные сердца экспрессируют amhc не только в предсердиях, но и также в отдельных кластерах кардиомиоцитов желудочков, несомненно, вне обычного домена экспрессии amhc (Fig. 1B,F.) ( 'ectopic amhc-expressing cells'.) Этот сценарий напоминает фенотип мутантов nkx2.5 , которые первоначально обладают нормальным паттерном экспрессии amhc и vmhc, но затем они начинают обнаруживать клетки, эктопически экспрессирующие amhc на более поздних стадиях (George et al., 2015; Targoff et al., 2013). Поэтому мы исследовали, отражает ли этот аспект мутантного fgf8a фенотипа позднюю роль передачи сигналов FGF по предупреждению эктопической экспрессии amhc expression, помимо его более раннего влияния на инициальную продукцию клеток желудочков. Чтобы оценить, действительно ли передача сигналов FGF играет и относительно позднюю роль по репрессии эктопической экспрессии amhc, мы подавляли путь FGF на стадиях после дифференцировки предсердий и желудочков. Благодаря экспрессии amhc и vmhc , начинающейся на ст. 18 ч после оплодотворения (hpf ) (Fig. S1), мы избирательно редуцировали передачу сигналов FGF, начиная с этой стадии. Использовали: индуцированную теплом индукцию экспрессии доминантно-негативной формы Fgfr1, используя трансген Tg(hsp70l:dnfgfr1-EGFP) (Lee et al., 2005) [hereafter referred to as Tg(hsp70:dnfgfr1)], и воздействие FGFR антагониста SU5402 (Mohammadi et al., 1997). Используя любой из методов, подавление передачи сигналов FGF начиналось на ст. 18 hpf , постоянно генерируя клетки, экспрессирующие эктопически amhc, наиболее заметно на внутреннем вентрикулярном изгибе вблизи артериального полюса (Fig. 1C, D,G,H). Эти данные показывают, что передача сигналов FGF предупреждает эктопическую экспрессию amhc в желудочках; более того, передача сигналов FGF оказывает устойчивое влияние на развитие желудочков, помимо её роли у ранних эмбрионов (Marques et al., 2008). На ст. 18 hpf, fgf8a экспрессируется и вблизи вентрикулярных предшественников, и продолжает экспрессироваться в желудочках на ст. 48 hpf (Reifers et al., 2000). Такое сохранение экспрессии fgf8a заставило нас исследовать продолжительность передачи сигналов FGF, необходимую, чтобы предупредить экспрессию в желудочках amhc. На ст. 18 hpf, применение теплового шока к Tg(hsp70:dnfgfr1) эмбрионам на ст. 24 или 28 hpf также приводило к появлению клеток, эктопически экспрессирующих amhc (Fig. 2), тогда как эктопически экспрессирующие amhc клетки не обнаруживались у эмбрионов после теплового шока на ст. 29, 30 или 31 hpf. Кроме того, мы наблюдали различия в потенции эффекта экспрессии Tg(hsp70:dnfgfr1) на ст. 18, 24 и 28 hpf. В то время, как все эмбрионы после теплового шока на ст. 18 hpf (n=15/15) и почти все эмбрионы после теплового шока на ст. 24 hpf (n=22/24) обнаруживали клетки, эктопически экспрессирующие amhc, лишь небольшое количество эмбрионов после теплового шока на ст. 28 hpf (n=6/36) обладали подобным фенотипом. Также, когда эмбрионы подвергались тепловому шоку на ст. 18 hpf они обычно обнаруживали клетки, эктопически экспрессирующие amhc как на внутреннем изгибе, так и на атриальном полюсе (Fig. 1C,G), меньше эктопически экспрессирующих amhc обнаруживалось, преимущественно на атриальном полюсе после теплового шока на ст. 24 hpf (Fig. 2B,E), и енщё меньше amhc-экспрессирующих клеток наблюдалось на атриальном полюсе после теплового шока на ст. 28 hpf (Fig. 2C,F). Итак, эти результаты подтверждают, что передача сигналов FGF необходима вплоть до приблизительно 28 hpf , чтобы репрессировать эктопическую экспрессиюt amhc в желудочках, хотя эта потребность со временем исчезает.
Потеря передачи сигналов FGF приводит к прогрессивному накоплению атриальных клеток и к потере вентрикулярных клеток, помимо создания клеток, эктопически экспрессирущих amhc в желудочках, потеря передачи сигналов FGF на ст. 18 hpf также изменяет морфологию камер, так что предсердие выглядит аномально расширенным, а желудочек выглядит аномально компактным (Fig. 1E,G,H). Такая аберрантная морфология, по-видимому, является следствием изменения количества кардиомиоцитов в каждой из камер: напр., вследствие теплового шока на ст. 18 hpf, Tg(hsp70:dnfgfr1) эмбрионы обнаруживают повышенные количества Amhc+ клеток и пониженные количества Amhc- клеток на ст. 50 hpf (Fig. 3E-G), но их общее количество остается тем же самым (Fig. 3G). Этот феномен проявляется постепенно со временем у Tg(hsp70:dnfgfr1) эмбрионов. В линейной сердечной трубке наблюдается лишь незначительное увеличение количества Amhc+ клеток (Fig. 3A,B,G). Этот избыток Amhc+ становится более существенным на ст. 36 hpf (Fig. 3C,D,G) и ещё более заметным на ст. 50 hpf (Fig. 3E-G). На всех исследованных ст. мы выявили реципрокные изменения в количествах Amhc+ и Amhc- клеток, так что общее количество кардиомиоцитов изменялось несущественно (Fig. 3G). Более того, наблюдаемое увеличение Amhc+ клеток прежде всего управлялось изменениями внутри предсердных камер, при этом эктопические Amhc+ клетки в желудочке вносили лишь незначительный вклад в общее количество Amhc+ клеток. На ст. 26.5 hpf, мы иногда обнаруживали одну эктопическую Amhc+ клетку у Tg(hsp70:dnfgfr1) эмбрионов, а на ст. 36 и 50 hpf эктопические клетки составляли приблизительно 10% от общей популяции Amhc+ клеток (Table S1). Т.о., помимо предотвращения эктопической экспрессии amhc в желудочках передача сигналов FGF также играет важную роль в сохранении относительных пропорций желудочка и предсердия.
Интересно, что постепенный и реципрокный сдвиг в пропорциях камер, наблюдаемый у Tg(hsp70:dnfgfr1) эмбрионов отражает фенортип, наблюдаемый у Nkx-дефицитных эмбрионов, у которых кардиомиоциты, по-видимому, подвергаются трансформации желудочковых в предсердные (Targoff et al., 2013). Такое сходство подтверждает, что передача сигналов FGF сходна с таковой для Nkx генов, способствует поддержанию пропорций камер, возможно путем предупреждения превращения качественных особенностей вентрикулярных кардиомиоциты в атриальные. Потеря передачи сигналов FGF приводит к увеличению экспрессии amhc и снижению экспрессии vmhc в желудочках. Принимая во внимание, что сдвиг в пропорциях камер д. возникать в результате ventricular-to-atrial трансформации судьбы (Targoff et al., 2013), мы удивились бы, если бы появление эктопических клеток, экспрессирующих amhc у эмбрионов, лишенных передачи сигналов FGF могло также отражать дефект в поддержании качественных характеристик желудочков. Возникает ли аберрантная экспрессия amhc внутри кардиомиоцитов, располагающихся в желудочках, или клетки, эктопически экспрессирующие amhc, возникают ещё где-либо и затем поступают в желудочек. В качестве первого шага в направлении понимания происхождения клеток, эктопически экспрессирующих amhc, мы исследовали динамику экспрессии amhc и vmhc после подавления передачи сигналов FGF. Наш анализ Tg(hsp70:dnfgfr1) эмбрионов показал, что клетки, эктопически экспрессирующие amhc, появляются в желудочке с характерной пространственной организацией (Fig. 4A-H). Эти клетки впервые появляются между 26 и 29 hpf вдоль внутреннего изгиба желудочка (Fig. 4E,F) , а позднее обнаруживались и вдоль внутреннего изгиба и на артериальном полюсе (Fig. 4G,H). Экспрессия vmhc нарушалась реципрокным образом после подавления передачи сигналов FGF (Fig. 4I-P). Снижение экспрессии vmhc становится очевидным между 26 и 29 hpf (Fig. 4M,N), а на более поздних стадиях экспрессия vmhc, по-видимому, исключается из пропорций желудочка, которые содержат клетки, эктопически экспрессирующие amhc (Fig. 4O,P). Итак, динамика экспрессии amhc и vmhc у Tg(hsp70: dnfgfr1) эмбрионов подтверждает, что передача сигналов FGF не только препятствует эктопической экспрессии amhc в желудочках, но и также сохраняет экспрессию vmhc в желудочке.
Принимая во внимание, что передача сигналов FGF подавляет экспрессию amhc и способствует экспрессии vmhc в желудочке, мы исследовали, действительно ли она также способна репрессировать экспрессию amhc и индуцировать эктопическую экспрессию vmhc в предсердии. Мы использовали трансген Tg(hsp70:ca-fgfr1), который облегчает активацию передачи сигналов FGF путем экспрессии, вызываемой тепловым шоком с постоянно активной формы Fgfr1 (Marques et al., 2008). Хотя активация Tg(hsp70:ca-fgfr1) на ранних стадиях может генерировать избыток кардиомиоцитов (Marques et al., 2008; Sorrell and Waxman, 2011), мы установили, что индукция экспрессии трансгена на ст. 18 hpf не меняет вклад в экспрессию amhc (Fig. S2A,B), и не вызывает эктопическую экспрессию vmhc (Fig. S2C,D). Т.о., передача сигналов FGF недостаточна, чтобы регулировать экспрессию amhc или vmhc в контексте предсердия; её роль, по-видимому, ограничена контролем экспрессии amhc и vmhc только в желудочках.
 Fig. 1. Inhibition of FGF signaling results in ectopic amhc expression in the ventricle. (A-D) In situ hybridization showing amhc expression in frontal views at 48 hpf. (A) Wild-type embryos express amhc in the atrium. Similar phenotypes are seen in all controls examined: wild-type siblings of fgf8a mutants, nontransgenic siblings following heat shock, and DMSO-treated siblings. (B) In fgf8a mutants, amhc expression is found not only in the atrium but also in a small cluster of ventricular cells (arrowhead; n=32/46 mutants). (C) More ectopic amhc-expressing cells are induced in Tg(hsp70:dnfgfr1) embryos following heat shock at 18 hpf (n=15/15); these cells are typically seen along the inner curvature (arrow) and at the arterial pole (arrowhead) of the ventricle. (D) Similarly, ectopic amhcexpressing cells can be induced by exposure to SU5402 starting at 18 hpf (arrowhead; n=15/15). The relatively mild phenotype of fgf8a mutants (B), compared with the more striking presence of ectopic cells in Tg(hsp70:dnfgfr1)-expressing and SU5402-treated embryos (C,D), suggests that additional FGF ligands might work together with fgf8a to prevent inappropriate amhc expression. (E-H) Immunofluorescence with MF20 (marks the myocardium; red) and S46 (recognizes Amhc; green) showing cardiac morphology and Amhc localization in lateral views at 48 hpf. In contrast to wild type (E), ectopic Amhc (arrowheads) is seen in fgf8a mutants (F), Tg(hsp70:dnfgfr1) embryos after heat shock at 18 hpf (G) and embryos treated with SU5402 from 18-30 hpf (H) (n>10 each). Scale bars: 50µm. Комплементарная потеря экспрессии vmhc и избыточная экспрессия amhc в желудочках Tg(hsp70:dnfgfr1) эмбрионов заставили нас проверить, действительно ли эти реципрокные изменения происходят в одной и той же клетке. Мы исследовали динамику локализации белков Amhc и Vmhc (Fig. 5; Fig. S3). Когда передача сигналов FGF была снижена, то желудочки содержали Vmhc, но неt Amhc, нак ст. 26 hpf (Fig. 5A-D). Однако, на ст. 28 hpf, Amhc начинал обнаруживаться внутри Vmhc+ клеток, расположенных вдоль внутреннего изгиба (Fig. 5E-H). На более поздних ст. Vmhc+Amhc+ клетки становились все более и более преобладающими как на внутреннем изгибе и артериальном полюсе желудочка (Fig. 5IL), и эти клетки, по-видимому, обнаруживают всё более высокие уровни Amhc (Fig. 5M-P). Наблюдаемые паттерны экспрессии amhc и vmhc (Fig. 4) и расположения Amhc и Vmhc (Fig. 5) подчеркивают постепенные изменения вентрикулярных характеристик при потере передачи сигналов FGF. Наши результаты согласуются со сценарием, согласно которому снижение передачи сигналов FGF заставляет располагающиеся в желудочке кардиомиоциты активировать экспрессию amhc expression и терять экспрессию vmhc. Подавление vmhc лучше всего иллюстрируется при исследовании транскрипов (Fig. 4I-P), в то время как perdurance белка Vmhc объясняется, скорее всего, персистенцией клеток Vmhc+Amhc+ (Fig. 5I-P). Т.о., наши данные подтверждают, что передача сигналов FGF способствует поддержанию характеристик вентральных кардиомиоцитов, путем репрессии экспрессии amhc и поддержания экспрессии vmhc. В то же самое время эти результаты не исключают др. возможный механизм, с помощью которого передача сигналов FGF д.ю предупреждать появление эктопических amhc-экспрессирующих клеток. Ectopic amhc-expressing cells are not derived from the atrium Некоторые эктопические amhc-экспрессирующие клетки у эмбрионов со снижением передачи сигналов FGF располагаются в позиции, соседствующей с предсердием (Figs 1C,D and 4F-H), поэтому возникает вопрос, не происходят ли некоторые из этих клеток из атриальных или атриовентрикулярных кардиомиоцитов
 Fig. 2. Defining a time interval during which FGF signaling prevents ectopic amhc expression. (A-C) In situ hybridization depicts amhc expression in frontal views of nontransgenic (A) and Tg(hsp70:dnfgfr1) (B,C) embryos at 50 hpf. Heat shock at 24 hpf (A,B) induces ectopic amhcexpressing cells in nearly all Tg(hsp70:dnfgfr1) embryos (B; n=22/24), whereas ectopic cells are induced less frequently with heat shock at 28 hpf (C; n=6/36). Heat shock at 18 hpf gives rise to approximately 20-30 ectopic amhc-expressing cells (Fig. 1C), heat shock at 24 hpf induces approximately five to ten ectopic amhc-expressing cells (B, arrowhead), and approximately two to three ectopic cells are produced with heat shock at 28 hpf (C, arrowhead). (D-F) Three-dimensional reconstructions of immunofluorescence, as in Fig. 1E-H, of nontransgenic (D) and Tg(hsp70:dnfgfr1) (E,F) embryos. Whereas Tg(hsp70:dnfgfr1) embryos heat shocked at 18 hpf (Fig. 1G) typically display ectopic amhc-expressing cells in the ventricular inner curvature and at the arterial pole, Tg(hsp70:dnfgfr1) embryos heat shocked at 24 (E) and 28 hpf (F) primarily exhibit ectopic cells at the arterial pole (arrowheads) [n=15 for nontransgenic, n=10 per condition for Tg(hsp70:dnfgfr1)]. Scale bars: 50 µm.  Fig. 3. Progressive accumulation of Amhc + cells and decrease in Amhc- cells in embryos with reduced FGF signaling. (A-F) Immunofluorescence for Amhc (green) and mCherry (red) allows counting of Amhc+ and Amhc? cardiomyocytes in nontransgenic (A,C,E) and Tg(hsp70:dnfgfr1) embryos (B,D,F) carrying Tg(myl7:H2A-mCherry). Images depict hearts flattened to facilitate visualization of individual myocardial nuclei at 26.5 (A,B), 36 (C,D) and 50 hpf (E,F). Heat-induced expression of dnfgfr1 at 18 hpf results in a gradual shift in chamber proportions that leads to an enlarged atrium and a reduced ventricle. In addition, there is a visible increase in the presence of Amhc+ cells within the ventricle over time. (G) Numbers of Amhc+ (gray) and Amhc- (white) cardiomyocytes, as well as the total number of cardiomyocytes (mean+s.d.); asterisks indicate statistically significant differences from nontransgenic (P10 each). (E) At 26.5 hpf, amhc-expressing cells can be seen infringing the boundary between the atrium and the ventricle. (F) By 29.5 hpf, amhc levels in ectopic cells are upregulated (arrowhead). (G,H) A prominent population of ectopic cells is found at the inner curvature and arterial pole of the ventricle (arrowheads). (I-P) Whereas vmhc is robustly expressed in the ventricle of nontransgenic embryos (I-L), this expression pattern is disrupted in Tg (hsp70:dnfgfr1) embryos (M-P) (n>10 each). (M,N) At early stages, Tg(hsp70: dnfgfr1) embryos display lower levels of vmhc expression in regions adjacent to the atrium. (O,P) As development proceeds, vmhc levels at the arterial pole become reduced or absent (arrowheads); moreover, the vmhc expression pattern appears to be reciprocal to that of ectopic amhc in the ventricle. Scale bars: 50 µm. (George et al., 2015). Мы сначала исследовали, действительно ли клетки предшественники SHF присутствующие у эмбрионов соответствуют нашим экспериментальным условиям. Было установлено, сильное подавление передачи сигналов FGF высокой дозой SU5402 (10 µM), начиная с 24 hpf, может почти полностью устранить образование mef2cb-экспрессирующих клеток предшественников SHF (Lazic and Scott, 2011; Zeng and Yelon, 2014). Однако, наши стратегии по снижению передачи сигналов FGF на ст. 18 hpf, или с помощью теплового шока у Tg(hsp70:dnfgfr1) эмбрионов или с помощью воздействия  Fig. 5. Increased colocalization of Vmhc and Amhc in the ventricle when FGF signaling is inhibited. (A-P) Immunofluorescence showing Vmhc (red) and Amhc (green) localization in embryos treated with SU5402 from 18 hpf. Lateral views are three-dimensional reconstructions (A,E,I,M) or magnified single optical sections, showing both channels (B,F,J,N), green only (C,G,K,O) or red only (D,H,L, P). See Fig. S3 for DMSO-treated control embryos. (A-D) At 26 hpf, the SU5402-treated ventricle contains only Vmhc (n=10). (E-H) By 28 hpf, Amhc is evident within some Vmhc+ cells, particularly along the inner curvature (arrowheads; n=9). We presume that these cells are early-differentiating cardiomyocytes, as late-differentiating cardiomyocytes normally contribute to the heart after 30 hpf (Lazic and Scott, 2011). (I-L) By 32 hpf, increasing numbers of Amhc+Vmhc+ cells are visible in the ventricle (arrowheads; n=11). (M-P) By 48 hpf, higher levels of Amhc accumulate in ectopic cells (arrowheads), in concert with diminishing levels of Vmhc (n=9). Scale bars: 50 ?m. Fig. 6. Ectopic amhc-expressing cells are not derived from the atrium or AVC. (A-L) Dendra fluorescence in live DMSO-treated (A-D) and SU5402-treated (E-L) Tg(amhc:dendra) embryos at 48 hpf, following photoconversion at 26 hpf; two representative SU5402-treated embryos are shown. Images are threedimensional reconstructions (A-C,E-G,I-K) or single optical sections (D,H,L); lateral views, anterior to the right. (D,H,L) Overlay illustrates location of Dendra+ cells within the heart; white dashes outline the ventricle. See Fig. S4 for additional information regarding experimental design. (A-D) In DMSO-treated controls, Dendra is found only in the atrium and AVC. Both green and red forms of Dendra are visible, as illustrated in single channel and merged views (n=10). (E-L) SU5402-treated embryos exhibit Dendra+ cells in the ventricle, in distinct clusters at the arterial pole and in the inner curvature (arrowheads). Cells at the arterial pole and inner curvature fluoresce green, but not red (arrowheads; n=15). Dendra+ cells are also found in and near the AVC (arrows), as seen in controls (A-D), reflecting the wild-type expression of amhc in this area (Foglia et al., 2016). Scale bars: 50 µm (A,I); 100 µm (E). более низкой дозой SU5402 (5 µM), не влияет на экспрессию mef2cb в популяции SHF предшественников (Fig. S5; data not shown). Кроме того, в качестве контрольных эмбрионов (Fig. 7A-D), клетки предшественники SHF продолжали вносить вклад в поздно дифференцирующиеся кардиомиоциты на артериальном полюсе у Tg(hsp70:dnfgfr1) эмбрионов (Fig. 7E-H) (de Pater et al., 2009). Чтобы проверить, действительно ли эктопически amhc-экспрессирующие клетки на артериальном полюсе представляют собой рано и поздно дифференцирующиеся кардиомиоциты, мы предприняли адаптированный онтогенетический временной подход с использованием трансгенов Tg(myl7:dsredt4) и Tg(amhc:egfp). У контрольных эмбрионов, экспрессирующих эти трансгены на ст. 48 hpf, eGFP обнаруживался в предсердии, а DsRed обнаруживался у рано дифференцирующихся кардиомиоцитов (Fig. 8A-D). Напротив, если снижалась передача сигналов FGF, то eGFP обнаруживался и в предсердии и эктопически в желудочке (Fig. 8E-L). У всех обработанных SU5402 эмбрионов (n=10), желудочки содержали eGFP+DsRed+ кардиомиоциты (Fig. 8E-L, arrows), которые мы отнесли к рано дифференцирующимся. Кроме того, большинство таких эмбрионов (n=7/10) содержали также некоторые eGFP+ клетки на артериальном полюсе, которые были лишены DsRed и аоэтому отнесены к поздно дифференцирующимся (Fig. 8E-L, arrowheads). Исходя из полученных данных мы полагаем, что рано и поздно дифференцирующиеся вентрикулярные кардиомиоциты могут становиться эктопически amhc-экспрессирующими клетками, если передача сигналов FGF снижена. Кроме того, (Fig. 8E-L), расположение наблюдаемых эктопических клеток согласуется с их происхождением из обеих этих популяций. Поздно дифференцирующиеся кардиомиоциты занимают артериальнц полюс (de Pater et al., 2009; Hami et al., 2011; Lazic and Scott, 2011; Zhou et al., 2011), тогда как рано дифференцирующиеся клетки создают внутренний изгиб (curvature) (de Pater et al., 2009; Zhou et al., 2011), и мы как обычно установили эктопически amhc-экспрессирующие клеткм в каждой из этих областей (e.g. Fig. 8EL). Мы также установили эктопически amhc-экспрессирующие клетки в проксимальной части желудочка (e.g. Fig. 8E), др. рано дифференцирующаяся территория (de Pater et al., 2009). Эктопически amhc-экспрессирующие клетки в этом регионе также обнаруживаются в отдельном наборе экспериментов, в которых вызывали мозаичную экспрессию Tg(hsp70:dnfgfr1) конструкции в кластерах вентрикулярных кардиомиоцитов: у этих мозаиков, dnfgfr1- экспрессирующие клетки в проксимальной части желудочка, были Amhc+ (Fig. 8M-P). Временная рамка, в течение которой мы наблюдали появление эктопических amhc-экспрессирующих клеток, также совпадает по времени с ранней и поздней фазами вентрикулярной дифференцировки: у эмбрионов с пониженной передачей сигналов FGF, мы впервые выявили эктопический Amhc в Vmhc+ клетках в рано дифференцирующейся внутренней курватуре, начиная со ст. 28 hpf (e.g. Fig. 5E-H), в то время как большинство эктопических клеток появлялось в артериальном полюсе после ст. 30 hpf (e.g. Fig. 5I-L), когда обычно добавлялись поздно дифференцирующиеся клетки (Lazic and Scott, 2011). Итак, наши результаты подтверждают, что передача сигналов FGF играет важную и сходную роль в обеих популяциях вентрикулярных клеток: путь передачи сигналов FGF репрессирует предсердные характеристики и поддерживает вентрикулярные характеристики в обеих популяциях кардиомиоцитов. Передача сигналов FGF функционирует выше Nkx генов, чтобы репрессировать эктопическую экспрессию amhc. У эмбрионов с пониженной передачей сигналов FGF, как и у эмбионов, лишенных Nkx транскрипционных факторов (George et al., 2015; Targoff et al., 2013), мы наблюдали постепенное уменьшение желудочка, постепенное увеличение предсердия и появление эктопической экспрессии amhc в рано и поздно дифференцирующихся вентрикулярных кардиомиоцитах. Такое сходство подтверждает, что передача сигналов FGF и Nkx гены выполняют сравнимые роли в поддержании вентрикулярных качественных особенностей. Кроме того, мы установили, что воздействие низкой дозой SU5402 (4 µM) может слегка усиливать проявление эктопической экспрессии amhc у nkx2.5 мутантных эмбрионов (Fig. S6), подтверждая, что передача сигналов FGF и Nkx гены оперируют на том же самом пути.
Поскольку передача сигналов FGF, как было установлено, способствует экспрессии nkx2.5 в передней латеральной пластинке мезодермы ранних эмбрионов (Alsan and Schultheiss, 2002; Keren-Politansky et al., 2009; Reifers et al., 2000; Sim?es et al., 2011), поэтому мы исследовали экспрессию nkx2.5 и nkx2.7 в сердцах эмбрионов с пониженной передачей сигналов FGF. В противоположность контрольным сиблингам, экспрессия в сердце nkx2.5 и nkx2.7 была снижена в желудочках Tg(hsp70:dnfgfr1) эмбрионов вследствие теплового шока на ст. 18 hpf (Fig. 9A-D). Поскольку экспрессия nkx2.5 и nkx2.7 устанавливается до ст. 18 hpf (Lee et al., 1996), то эти результаты указывают на то, что передача сигналов FGF необходима для поддержания экспрессии Nkx генов. Чтобы проверить гипотезу, что передача сигналов FGF действует выше Nkx генов, чтобы предупредить экспрессию в желудочках amhc, мы исследовали, действительно ли избыточная экспрессия nkx2.5 может подавлять образование клеток, эктопически экспрессирующие amhc у эмбрионов с пониженной передачей сигналов FGF. Мы использовали ранее охарактеризованный трансген Tg (hsp70l:nkx2.5-EGFP) [abbreviated as Tg(hsp70:nkx2.5)] (George et al., 2015), чтобы вызвать экспрессию nkx2.5. Сначала мы показали, что избыточная экспрессия трансгена nkx2.5 может устранять дефекты непропорциональности камер и репрессировать эктопическую экспрессию amhc у мутантов nkx2.5 (George et al., 2015). В наших экспериментах Tg(hsp70:nkx2.5) эмбрионы подвергались действию SU5402 со ст. 18 hpf и затем подвергались тепловому шоку на ст. 24 hpf. Бы ло установлено, что 84% (65/77) не трансгенных эмбрионов при воздействии SU5402 имели клетки, эктопически экспрессирующие amhc, тогда как только 64% (74/ 119) из Tg(hsp70:nkx2.5) эмбрионов обнаруживали какую-либо эктопическую экспрессию amhc (Fig. 9E-H). Это снижение частоты обнаружения эктопической экспрессии amhc, хотя и незначительное, было статистически достоверным (P=0.0019, Fisher's exact test) и,а частичноен устранение фенотипа, вызываемого обработкой SU5402. Это указывает на то, что передача сигналов FGF действует выше nkx2.5 на пути, который гарантирует поддержание вентрикулярных качественных особеннностей. DISCUSSION Итак, наши данные продемонстрировали, что путь передачи сигналов FGF играет критическую роль в поддержании характеристик развивающегося сердца. Мы предложили модель, согласно которой передача сигналов FGF действует, чтоб усиливать детерминацию вентрикулярных характеристик, путем репрессии экспрессии атриальных генов и путем способствования экспрессии вентрикулярных генов. Для рано дифференцирующихся клеток передача сигналов FGF необходима, чтобы поддерживать соотв. количества кардиомиоцитов в желудочке, а также чтобы сохранять вентрикулярные характеристики этих клеток. Для поздно дифференцирующихся клеток передача сигналов FGF необходима, чтобы способствовать их наращиванию артериального полюса (de Pater et al., 2009; Lazic and Scott, 2011; Marques et al., 2008; Zeng and Yelon, 2014), а также регулировать в них представительство соотв. вентрикулярных характеристик. Т.о., устойчивая передача сигналов FGF супрессирует миокардиальную пластичность и защищает целостность вентрикулярных камер. Наше исследование предоставило новую информацию относительно природы пластичности и детерминации желудочков. Помимо определения новой роли передачи сигналов FGF по сохранению вентрикулярных характеристик, наша работа также пролила свет на пространственное распределение и временные ограничения вентрикулярной пластичности. Наши что определенные регионы в желудочке по-разному чувствительны к потере передачи сигналов FGF: напр., мы более часто наблюдали клетки, эктопически экспрессирующие amhc, на внутреннем изгибе, чем на наружном изгибе желудочка. Такое дифференциальное распределение д. иметь значение для пространственной гетерогенности в отношении степени, с которой клетки детерминированы к вентрикулярной дифференцировке, при этом наиболее примитивная часть миокарда внутреннего изгиба (curvature) оказывается наиболее чувствительна, чем работающий миокард наружного изгиба. being more malleable than the working myocardium of the outer curvature. Вообще-то унифицированность в программах генной экспрессии во внутреннем изгибе и на артериальном полюсе лежит в основе их сходной зависимости от устойчивой передачи сигналов FGF. Наши данные выявили определенное временной промежуток, во время которого вентрикулярный миокард чувствителен к эффектам снижения передачи сигналов FGF  Fig. 7. Late-differentiating cardiomyocytes contribute to the heart after inhibition of FGF signaling. (A-H) Three-dimensional reconstructions (A,E) and single optical sections (B-D,F-H) of live embryos carrying Tg(myl7:egfp) and Tg(myl7:dsredt4); lateral views at 40 hpf, after heat shock at 18 hpf. Owing to the differential protein-folding kinetics of eGFP and dsRed (Lepilina et al., 2006), reporter transgene expression distinguishes early-differentiating (eGFP+dsRed+) and late-differentiating cardiomyocytes (eGFP+dsRed?) (de Pater et al., 2009). As in nontransgenic embryos (A-D, n=6), late-differentiating cardiomyocytes (eGFP+dsRed?, dashed outlines) contribute to the arterial pole (brackets) in Tg(hsp70:dnfgfr1) embryos (E-H; n=8). Scale bar: 30 ?m. Fig. 8. FGF signaling influences the identity of both early-differentiating and late-differentiating ventricular cardiomyocytes. (A-L) Threedimensional reconstructions (A,E,I) and single optical sections (B-D,F-H,J-L) of live Tg(amhc:egfp);Tg(myl7:dsredt4) embryos; lateral views at 48 hpf, after exposure to DMSO (A-D) or SU5402 (E-L) from 18 hpf. (A-D) As expected, control embryos display eGFP in the atrium and not in the ventricle, and the arterial pole (bracket) is composed of late-differentiating cardiomyocytes (DsRed?) (n=5). (E-L) In SU5402-treated embryos, eGFP is routinely found in the ventricle (n=10). Two representative embryos (E-H and I-L) illustrate detection of eGFP both in earlydifferentiating cardiomyocytes (arrows, eGFP+DsRed+; n=10/10) and in latedifferentiating cardiomyocytes (arrowheads, eGFP+DsRed?; n=7/10). (M-P) Immunofluorescence for MF20 (magenta), GFP (green) and Amhc (red) at 48 hpf indicates mosaic expression of dnfgfr1-egfp in the ventricle of an embryo that was injected with the Tg(hsp70:dnfgfr1) construct and then heat shocked at 18 hpf; three-dimensional reconstruction (M) and single optical sections (N-P). The dnfgfr1-egfp-expressing cells inthe proximal ventricle exhibit variegated levels of Amhc (P; n=3). Scale bars: 30 µm. Ранние исследования показали, что nkx2.5 действует, чтобы поддерживать вентрикулярные характеристики во время того же самого временного промежутка e (George et al., 2015), эти находки могут отражать время перехода от пластичности к детерминации внутри вентрикулярного миокарда. Сходным образом, недавнее исследование на Xenopus подтвердило, что на детерминацию желудочков может влиять относительно широкое временное окно и что чувствительность вентрикулярных предшественников к индуцирующим сигналам постепенно теряется со временем (Caporilli and Latinkic, 2016). В будущих исследованиях интересно посмотреть различия в экспрессии генов, которые, по-видимому, лежат в основе пространственной гетерогенности и временного хода детерминации вентрикулярных характеристик. Кроме того, наша работа добавила новый штрих к нашему пониманию развития SHF. Многочисленные исследования сконцентрированы на путях передачи сигналов, которые регулируют продукцию, пролиферацию или дифференцировку происходящих из SHF клеток предшественников (e.g. de Pater et al., 2009; Dyer and Kirby, 2009; Ilagan et al., 2006; Lazic and Scott, 2011; Park et al., 2006; Tirosh-Finkel et al., 2010; Zeng and Yelon, 2014; Zhou et al., 2011), но сигналы, которые обеспечивают соотв. камер-специфичные характеристики этих поздно дифференцирующихся клеток, не были охарактеризованы. Удивительно, мы установили, что снижение передачи сигналов FGF заставляет поздно дифференцирующие клетки, инициировать эктопическую экспрессию amhcy, указывая или на неправильное становление атриальных характеристик или на неспособность поддерживать программу вентрикулярной дифференцировки. Т.о., наш анализ передачи сигналов FGF впервые продемонстрировал путь, который играет ключевую роль в индукции вентрикулярных характеристик в поздно дифференцирующихся кардиомиоцитах. Следует отметить, что наши исследования базируются на исследовании экспрессии vmhc и amhc, характеризующих вентрикулярные и атриальные качественные особенности. Хотя ни один из этих генов не является строго камер-специфичным (Berdougo et al., 2003; Foglia et al., 2016; Yelon et al., 1999), они служат здесь в качестве представителей основных программ генной экспрессии в желудочке и предсердии. Было бы интересно оценить, действительно ли клетки, эктопически экспрессирующие amhc в желудочке также экспрессируют дополнительные атриальные гены; к сожалению, amhc является наиболее четким маркером этого типа, который доступен на сегодня. Механизмы, регулирующие экспрессию vmhc и amhc несомненно имеют отношение к контролю качественных характеристик камер, но они д. быть также оценены в будущих исследованиях, чтобы расширить список вентрикулярных и атриальных маркеров и тем самым расширить наше понимание степени влияния передачи сигналов FGF. Мы предвидим путь, c помощью которого передача сигналов FGF действует выше Nkx генов, которые, в свою очередь, регулируют нижестоящие эффекторы irx4 и hey2 (Targoff et al., 2013). Наши находки, независимо от функции передачи сигналов FGF в рано и поздно дифференцирующихся вентрикулярных кардиомиоцитах отражают то, что ранее было обнаружено у Nkx-дефицитных эмбрионов рыбок данио (George et al., 2015; Targoff et al., 2013). Более того, наши данные подтвердили, что передача сигналов FGF действует посредством nkx2.5, чтобы осуществить свою функцию по репрессии эктопической amhc экспрессии. Однако хотя мы и наблюдали статистически достоверное улучшение у эмбрионов, обработанных SU5402, после избыточной экспрессии nkx2.5, это указывает только на частичное восстановление. Одним из возможных объяснений такого исхода заключается в том, что мы неспособны достичь уровня экспрессии nkx2.5, который необходим для полной репрессии эктопической экспрессии amhc. В противном случае, вообще-то и nkx2.5, и nkx2.7 необходимы для предупреждения эктопической экспрессии amhc. Поскольку функции этих двух генов не перекрываются полностью (George et al., 2015), то избыточная экспрессия nkx2.5 может оказаться неспособной компенсировать снижение активности обоих генов. Наконец, передача сигналов FGF может действовать посредством дополнительных нижестоящих эффекторных генов помимо nkx2.5 и nkx2.7, чтобы репрессировать эктопическую экспрессию amhc и поддерживать вентрикулярные характеристики. Идентификация этих предполагаемых нижестоящих эффекторов пути FGF, также как и выяснение механизма, посредством которого передача сигналов FGF способствует экспрессии Nkx генов, будет важным в будущих усилиях. Наша информация о сигнальных путях, которые обеспечивают качественные особенности камер, имеет важное значение для подходов в кардиальной регенеративной медицине. Усилия в отношении in vitro дифференцировки гомогенных популяцийй зрелых кардиомиоцитов смещаются всё более в направлении протоколов, которые используют коктейли из малых молекул, чтобы манипулировать сигнальными путями и модифицировать хроматин (e.g. Cao et al., 2016). В будущем было бы важным контролировать не только пути, которые управляют выбором путей камер-специфических клонов,  Fig. 9. FGF signaling functions upstream of Nkx genes to repress amhc expression in the ventricle. (A-D) In situ hybridization showing nkx2.5 (A,B) and nkx2.7 (C,D) expression in dorsal views at 26.5 hpf, following heat shock at 18 hpf. Nontransgenic embryos (A,C) exhibit robust expression of nkx2.5 (n=24) and nkx2.7 (n=12), and Tg(hsp70:dnfgfr1) embryos (B,D) exhibit reduced expression of nkx2.5 (n=24) and nkx2.7 (n=12). This reflects a reduced amount of ventricular tissue in Tg(hsp70:dnfgfr1) embryos (compare with Fig. 4M), as well as lower expression levels within this tissue. (E-G) In situ hybridization showing amhc expression at 48 hpf in nontransgenic (F) and Tg (hsp70:nkx2.5) (E,G) embryos treated with DMSO (E) or SU5402 (F,G); frontal views. In some cases (G), overexpression of nkx2.5 represses ectopic amhc expression in Tg(hsp70:nkx2.5) embryos that were treated with SU5402 at 18 hpf and subsequently heat shocked at 24 hpf. (H) Table reports the results of experiments gauging whether amhc expression in the ventricle of SU5402- treated embryos can be repressed by overexpression of nkx2.5. Asterisk indicates a statistically significant difference in the frequency of detecting ectopic amhc expression, compared to nontransgenic siblings (P=0.0019, Fisher's exact test), representing partial rescue of the SU5402-treated phenotype. The degree of rescue was not enhanced when we used embryos carrying two copies of Tg(hsp70:nkx2.5) or when we administered two rounds of heat shock (data not shown). Scale bars: 50 µm. которые индуцируют детерминацию характеристик камер. Наша работа подтверждает, что регуляция передачи сигналов FGF может быть важным элементом в стратегиях будущей регенеративной медицины, с целью использования наследственной пластичности вентрикулярных кардиомиоцитов. |