Посещений: 
РАННЕЕ ФОРМИРОВАНИЕ СЕРДЦА
Роль Id белков
Id genes are essential for early heart formation Thomas J. Cunningham, Michael S. Yu, Wesley L. McKeithan et al/
 Genes & Dev. 2017. 31:1325-1338
|
Deciphering the fundamental mechanisms controlling cardiac specification is critical for our understanding of how heart formation is initiated during embryonic development and for applying stem cell biology to regenerative medicine and disease modeling. Using systematic and unbiased functional screening approaches, we discovered that the Id family of helix-loop-helix proteins is both necessary and sufficient to direct cardiac mesoderm formation in frog embryos and human embryonic stem cells. Mechanistically, Id proteins specify cardiac cell fate by repressing two inhibitors of cardiogenic mesoderm formation-Tcf3 and Foxa2-and activating inducers Evx1, Grrp1, and Mesp1. Most importantly, CRISPR/Cas9-mediated ablation of the entire Id (Id1-4) family in mouse embryos leads to failure of anterior cardiac progenitor specification and the development of heartless embryos. Thus, Id proteins play a central and evolutionarily conserved role during heart formation and provide a novel means to efficiently produce cardiovascular progenitors for regenerative medicine and drug discovery applications.
|
Образование сердца начинается во время гаструляции со спецификации кардиогенных мезодермальных предшественников (CMPs), которые мигрируют кпереди, чтобы сформировать зачаток сердца, который собирается в полностью сформированное сердце (Buckingham et al. 2005;Kelly et al. 2014; Meilhac et al. 2015). Исследования последних лет привели к идентификации внеклеточных сигналов, инициирующих кардиогенез (Schultheiss et al. 1997; Marvin et al. 2001; Schneider and Mercola 2001; Pandur et al. 2002; Collop et al. 2006; Kattman et al. 2006; Foley et al. 2007; Laflamme et al. 2007; Yang et al. 2008; Lian et al. 2013). Напротив, современные знания о внутриклеточных медиаторах, контролирующих этот процесс, очень фрагментарны. Открытие таких факторов может иметь важное значение (1) для определения, как инициируется кардиогенез в норме, т.к. эмбрионы, лишенные кардиальных предшественников, неспособны формировать сердце (Zhao et al. 2008), и (2) для получения информации для разработки технологий по регенерации и моделированию болезней (Mercola et al. 2013; Moretti et al. 2013).
Basic helix-loop-helix (bHLH) транскрипционные факторы Mesp1 и Mesp2 (Saga et al. 2000) под контролем T-box фактора Eomes (Costello et al. 2011) регулируют, по крайней мере, частично этот процесс в мезодермальных клетках путем управляющих экспрессией генов, участвующих в спецификации сердца (Hand2, Gata4, Nkx2.5 и Myocd), и клеточной миграции (Prickle1 и RasGRP3), тогда как активно репрессируемые гены, регулируют плюрипотентность (Oct4, Nanog, and Sox2) и судьбы ранней мезодермы (T) и энтодермы (Foxa2 and Sox17) (Bondue et al. 2008; Costello et al. 2011; Chiapparo et al. 2016). Хотя эти наблюдения подтверждают, что Mesp1/2 гены могут действовать как главные регуляторы мультипотентной сердечно-сосудистой спецификации, ретроспективный клональный анализ (Saga et al. 2000; Yoshida et al. 2008) и исследования дифференцировки in vitro (Chan et al. 2013) показали, что Mesp1-экспрессирующие клетки также вносят вклад в широкий круг не кардиальных производных, включая гематопоэтические предшественники, скелетно-мышечные клетки и головную мезенхиму.
Недавно мы сообщали, что ослабление передачи сигналов Acvr1b в мезодерме, отделяет кардиогенную мезодерму от энтодермы, тогда как сохранение передачи сигналов Acvr1b заставляет клетки формировать энтодерму (Colas et al. 2012). Плэтому мы предположили, что гены, индуцируемые в ответ на ингибирование передачи сигналов Acvr1b могут быть ключевыми детерминантами образования кардиогенной мезодермы. Мы разработали планомерный и беспристрастный подход, чтобы функционально тестировать необходимость и достаточность генов, модулируемых с помощью блокирования передачи сигналов Acvr1b. Неожиданно мы впервые идентифицировали Id1, HLH транскрипционный регулятор в качестве одиночного фактора, достаточного для контроля возникновения Kdr+ CMPs в эмбриональных стволовых клетках мышей и человека (mESCs и hESCs, соотв.). Механистически мы установили, что Id белки обнаруживают эволюционно законсервированную роль по активации экспрессии агонистов формирования кардиогенной мезодермы (Evx1, Grrp1 и Mesp1) и ингибированию активности антагонистов (Tcf3 и Foxa2). Наконец, CRISPR/Cas9-вызываемая делеция всех 4-х членов семейства Id у эмбрионов мышей блокирует формирование ранних кардиальных предшественников и дает эмбрионов без сердца. Такой фенотип отсутствия сердца является уникальным для четверного нокаута, указывая на компенсаторную или перекрывающуюся функцию Id белков в формировании кардиальной мезодермы. Эти находки выявили неожиданную роль Id белков как самых ранних детерминантов выбора кардиальной клеточной судьбы у позвоночных.
Figure 6.
Id genes are essential for early heart formation. (A) Schematic illustrating the generation and analysis of Id1-4 mutant embryos using CRISPR/Cas9 technology. Two sgRNAs per gene (targeting the translational start site and the HLH domain) were injected into single-cell mouse zygotes alongside Cas9mRNA. Zygotes were reimplanted and harvested at stages E7.5-E8.5. Resulting embryos were genotyped by DNA deep sequencing, and cardiac gene expression was assessed via whole-mount in situ hybridization. (B-U) In situ hybridization results from the most severe Id1-4 mutants-compared with wild type (individual mutants are marked by #)-plus one less-affected mutant (O); analysis of Smarcd3 at E7.75 (B-E), Tbx5at E8.0 (F-I), Nkx2.5 at E8.25 (J-M; plus transverse sections through the heart tube-forming region [K', M']), Nkx2.5 at E8.5 (N-Q), and Tbx5 at E8.5 (R-U). (Yellow arrowheads) Missing heart tube (or missing heart tube-forming region at cardiac crescent stages) in Id1-4 mutants; (white arrowhead) malformed heart tube; (black arrows) the plane of transverse sectioning through the heart tube-forming region; (black dashed arrows) posterior-lateral cardiac regions. See the Supplemental Material for detailed sequencing results of mutant embryos.
Discussion
Molecular control of cardiogenic mesoderm specification
Выяснение молекулярных механизмов, контролирующих спецификацию кардиогенной мезодермы является важным для понимания того, как формируется сердце в норме во время эмбрионального развития и как получать пригодные для развития кардиальные предшественники для терапии и моделирования кардиальных болезней. В данном исследовании было установлено, что спецификация кардиальной мезодермы регулируется бипотентными мезодермальными предшественниками путем антогонистического взаимодействия между Id белками и путем передачи сигналов Acvr1b. Высокий уровень передачи сигналов Acvr1b репрессирует экспрессию Id генов и склоняет мезэнтодермальные предшественники дифференцироваться в направлении энтодермы. Напротив, ослабление передачи сигналов Acvr1b в этих клетках снимает супрессию с транскрипции Id генов, это в свою очередь способствует спецификации кардиогенной мезодермы (Fig. 7).
Figure 7. Id genes orchestrate cardiogenic mesoderm differentiation in vertebrates. Idgenes control the activation of the cardiogenic mesoderm differentiation program in mesendoderm progenitors by inhibiting the activity of repressors (Tcf3 and Foxa2) while promoting the expression of activators of cardiogenic mesoderm differentiation (Evx1,Grrp1, and Mesp1). The Id-controlled network induces cardiogenic mesoderm (Mesp1 and Kdr) differentiation from pluripotent cells. Id1-induced CMPs generated from pluripotent stem cells are cryopreservable and spontaneously form contracting cardiomyocytes (?70%) as well as vascular endothelial cells, smooth muscle, and fibroblasts.
Центральная находка данного исследования - это способность Id белков преодолевать способствующие образованию энтодермы сигналы (индуцируемые при высоком уровне передачи сигналов Acvr1b), чтобы способствовать дифференцировке кардиогенной мезодермы. Функциональное доминирование Id белков над передачей сигналов Acvr1b также указывает на то, что молекулы, контролирующие пространственное и количественное распределение белков Id, скорее всего, являются критическими регуляторами формирования кардиогенной мезодермы. В соответствии с нашей моделью передача сигналов BMP непосредственно активирует транскрипцию Id1 (Hollnagel et al. 1999; Katagiri et al. 2002; Korchynskyi and ten Dijke 2002; Lopez-Rovira et al. 2002) и необходима и достаточна для индукции кардиогенной мезодермы (Beppu et al. 2000; Yang et al. 2008;Paige et al. 2012). Напротив, находка, что передача сигналов Acvr1b репрессирует экспрессию Id1/3 генов, согласуется со способностью малой молекулы ингибитора Nodal рецептора (SB431542) активировать транскрипцию Id1 в mESCs (Galvin et al. 2010) и подкрепляет роль передачи сигналов Acvr1b, противоположную приобретению судьбы кардиальных клеток во время гаструляции. Итак, высокие уровни Id белков в предшественниках мезэнтеродермы создают доминантный молекулярный сигнал, достаточный для запуска и контроля спецификации кардиогенной мезодермы у позвоночных.
Positioning Id genes in the context of Mesp1 procardiogenic activity
Некоторые транскрипционные факторы, как было установлено, важны для развития сердца (Olson 2006; Bruneau 2013). Среди них Mesp1 является самым ранним из экспрессируемых и достаточным для непосредственной кардиальной спецификации мезодермальных предшественников (Saga et al. 1996; Bondue et al. 2008; David et al. 2008; Chan et al. 2013). Важно, что наши эксперименты с избыточной функцией показали, что Id1/Xid2 достаточен, чтобы управлять экспрессией Mesp1/Xmespb в mESCs и hESCs, а также у эмбрионов Xenopus и в дальнейшем способствовать дифференцировке кардиогенной мезодермы. Эти наблюдения указывают на то, что Id белки осуществляют, по крайней мере, частично свой эффект, способствующий кардиогенезу, активируя Mesp гены. Поскольку Id белки не соединяются непосредственно с ДНК (Benezra et al. 1990; Roschger and Cabrele 2017), то мы предположили, что активация Mesp генов, скорее всего, связана с подавлением белков, которые репрессируют транскрипцию Mesp. В соответствии с нашей гипотезой, siRNA-обусловленный нокдаун двух транскрипционных факторов, Tcf3 и Foxa2, оказался достаточным, чтобы активировать экспрессию Mesp1 и способствовать формированию Kdr+ мезодермы. Механистически, Tcf3 является слабо охарактеризованной мишенью для Id белков (rev. Yang et al. 2014) и известен также тем, что взаимодействует с комплексом Smad/Foxh1, чтобы регулировать Smad2/3-зависимую транскрипцию в мезэнтодермальных предшественниках (Yoon et al. 2011; Wills and Baker 2015). В свою очередь, мощный энтодермальный детерминант Foxa2 (Stainier 2002; Viotti et al. 2014), экспрессируется в мезэнтодермальных предшественниках Smad2-зависимым способом в эмбрионах мыши (Vincent et al. 2003), подтверждая, что Tcf3 может кооперироваться с Smad2, чтобы регулировать Foxa2. Принимая во внимание эти функции, мы предположили, что Id-контролируемая блокада функции Tcf3 и Foxa2 управляет двумя сопутствующими процессами в мезэнтодермальных предшественниках: (1) предупреждает Acvr1b/Smad2-управляемую дифференцировку энтодермы и (2) активирует спецификацию кардиальной мезодермы посредством активации Mesp генов.
Id genes are essential for the specification of heart tube-forming progenitors
Формирование сердца у млекопитающих использует сложную последовательность решений по выбору клеточной судьбы и морфогенетические события, которые взаимозависимо вносят вклад в образование четырехкамерного сердца. Хотя м не можем полностью исключить возможный вклад морфогенетических дефектов энтодермы в отсутствие образования сердечной трубки у Id1-4 мутантных эмбрионов, некоторые линии доказательств подтверждают, что эти дефекты непосредственно возникают из-за нарушений спецификации кардиальной мезодермы в результате потери активности Id белков в мезэнтодермальных предшественниках: (1) Закрытая передняя кишка может обнаруживаться в наиболее передней части эмбриона, где обычно формируется сердечная трубка (Supplemental Fig. S7D), подтверждая, что энтодерма может формироваться и подвергаться морфогенезу. (2) Общее окрашивание маркерами кардиальной мезодермы (Smarcd3, Tbx5, and Nkx2.5) уменьшается у Id1-4 мутантных эмбрионов по сравнению с контролем (Fig. 6B-N), это указывает на то, что формируется меньше кардиальных предшественников. (3) siRNA-обусловленная потеря функции Id1 нарушает образование кардиальной мезодермы из mESCs (Fig. 1J,K), процесс, который фактически не зависит от морфогенеза энтодермы in vitro. (4) Эксперименты с избыточностью функции показали, что Id белки достаточны, чтобы управлять спецификацией кардиальной мезодермы в ESCs и у Xenopus и увеличивают кардиальный зачаток у эмбрионов Xenopus (Figs. 2, 3). Итак, эти наблюдения подтверждают, что Id белки необходимы для спецификации передней кардиальной мезодермы независимо от дифференцировки энтодермы и морфогенеза во время раннего образования сердца.
Хорошо известно, что большая часть сердечного миокарда у млекопитающих происходит из двух самостоятельных популяций кардиальных предшественников, обозначаемых как поля сердца (Kelly et al. 2001; Cai et al. 2003; Meilhac et al. 2004, 2015). Однако, неизвестно сходные или разные молекулярные механизмы регулируют кардиальную спецификацию этих двух популяций клеток. Результаты наших экспериментов с потерей функции показали, что эмбрионы, лишенные функциональных Id1-4 генов, неспособны экспрессировать маркеры кардиальной мезодермы (Smarcd3, Tbx5, and и Nkx2.5) в наиболее переднем регионе кардиального полумесяца на ст. E7.75 и затем развиваться без формирования сердечной трубки. Напротив, экспрессия этих генов поддерживается в задних регионах кардиального полумесяца внутри спланхнической кардиальной мезодермы (Supplemental Fig. S7A-E). Итак, эти наблюдения подтверждают, что только наиболее передний субнабор кардиальных предшественников нуждается в активности Id1-4 для своей спецификации. В соответствии с нашими находками, Lescroart et al. (2014) недавно показали, что ранние Mesp1-экспрессирующие мезодермальные предшественники (около E6.5), которые вносят вклад в производные первого поля сердца, экспрессируют высокие уровни Id1. Напротив, поздние Mesp1-экспрессирующие клетки (около E7.5), которые вносят вклад в производные второго поля сердца, экспрессируют низкие уровни Id1 (see the Supplemental Material of Lescroart et al. 2014). Более того, мы показали, что iMPs человека активируют маркеры первого поля сердца (HCN4 and TBX5) во время кардиальной дифференцировки, тогда как маркеры второго поля сердца, (ISL1 и SIX2) подавляются (Supplemental Fig. S8A-F). Поэтому мы предположили, что Id гены обычно специфицируют предшественники первого поля сердца , которые впоследствии формируют раннюю сердечную трубку. Эти находки также указывают, что спецификация кардиогенной мезодермы не является сингулярным процессом и может быть инициирована Id-зависимым (предшественники первого поля сердца ) или независимо от Id (задние кардиальные предшественники) во время эмбрионального развития.
Id1-induced CMPs: a promising new technology for cardiac regenerative medicine and disease modeling
Недавние исследования оценивали концепцию использования трансплантаций, происходящих из ESC, кардиальных предшественников, для улучшение функции сердца после повреждений у грызунов, овец и не-человекообразных приматов (Menasche et al. 2015). Хотя и обнадеживающее использование этих клеток для терапевтической регенерации, но не является успешным постоянно, в основном из-за проблем, вызываемых большими количествами определенных кардиальных предшественников, получаемых из стволовых клеток. Данное исследование показывает, что простая избыточная экспрессия Id1 в hESCs (или в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека [hiPSCs]) (data not shown) достаточна для генерации большого количества (более 108 клеток на партию) сохраняемых замороженными и bona fide CMPs с удивительной способностью спонтанно дифференцироваться в сокращающиеся кардиомиоциты (~70% эффективность). Эти комбинированные свойства позволяют создавать два основных подхода для Id1-программируемых предшественников: (1) как многообещающей готовой для трансплантаций популяции клеток для регенерации в сердце после миокардиальных нарушений и (2) в качестве нового источника клеток, делающим возможным продукцию больших количеств, происходящих из hESC- или hiPSC кардиомиоцитов, пригодных для изучения in vitro физиологии кардиомиоцитов.
|