Ранние эмбрионы млекопитающих д. быть правильно специфицированы в отношении трех самостоятельных клонов: эпибласта (EPI), который дает собственно эмбрион, трофэктодермы (TE) и примитивной энтодермы (PE), формирующих важные поддерживающие структуры, плаценту и желточный мешок, соотв. На ст. 16 клеток эмбрион мыши имеет популяцию внешних и внутренних клеток, следующих разным судьбам. Внешние клетки дают TE, тогда как внутренние клетки д. сформировать плюрипотентную внутреннюю клеточную массу (ICM) бластоциста. PE и EPI происходят из ICM раннего бластоциста. Ранее исследователи установили, что ранний бластоцист содержит в ICM смешанную популяцию предшественников PE и EPI распределенных в виде паттерна 'соль-и-перец', которые затем рассортировываются в самостоятельные слои у бластоциста, готового к имплантации [день эмбриогенеза (E) 4.5)] благодаря активным перемещениям клеток (Chazaud et al., 2006; Kurimoto et al., 2006; Meilhac et al., 2009; Plusa et al., 2008). Хотя они и являются сначала смешанной популяцией индивидуальные клетки у раннего бластоциста достаточно отличны, чтобы формировать PE или EPI, но редко тот и др. (Morris et al., 2010). Показано, что предшественники EPI экспрессируют маркер плюрипотентности Nanog, секретируют Fgf4 лиганд в ICM, это может инициировать сигнальный каскад в Gata6-позитивных PE предшественниках, в которых рецептор Fgfr2 экспрессируется на высоком уровне на их мембранах (Frankenberg et al., 2011; Kurimoto et al., 2006; Morris et al., 2013; Ohnishi et al., 2014). Эта передача сигналов Fgf является критической для предотвращения c помощью Nanog ингибирования Gata6 и детерминации клеток к выбору судьбы PE (Frankenberg et al., 2011; Kang et al., 2013; Krawchuk et al., 2013; Schrode et al., 2014). В самом деле, когда передача сигналов Fgf подавлена, то все клетки ICM побуждаются к выбору судьбы Nanog-позитивных EPI клеток без образования PE, тогда как избыточная экспрессия приводит к противоположному фенотипу, когда все клетки превращаются в Gata6- и Sox17-позитивные PE (Chazaud et al., 2006; Feldman et al., 1995; Frankenberg et al., 2011; Nichols et al., 2009; Yamanaka et al., 2010). Хотя и описана роль передачи сигналов Fgf у эмбрионов, многое ещё остается неясным, как происходит выбор клеточной судьбы между PE и EPI .
Если исходить из уже имеющегося набора данных о генах, дифференциально экспрессирующихся в первых предшественниках ICM внутренние клетки) и TE (наружные клетки) на ст. 16 клеток (Graham et al., 2014), то внимание на себя обращает Satb1, модификатор хроматина, который в 3 раза сильнее экспрессируется в внутренних клетках по сравнению с внешними клетками, указывая на его потенциальную роль в ICM. Хотя Satb1 у ранних эмбрионов мыши неизвестен, как было установлено, он регулирует плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток мыши (mESCs; Savarese et al., 2009), регулируя самообновление и плюрипотентность гематопоэтических (Will et al., 2013) и трофобластных стволовых клеток (Asanoma et al., 2012), чтобы способствовать дифференцировке гематопоэтических стволовых клеток (Satoh et al., 2013).
DISCUSSION
Спецификация трех самостоятельных клонов клеток у эмбрионов мышей происходит во время двух событий выбора клетками судеб. В ходе первого выбора происходит физическое разделение популяции ICM и TE клеток.
Второй выбор клеточной судьбы далее специфицирует ICM на PE и EPI. Это является критическим, т.к. все три клона д. корректно специфицироваться, чтобы сформировать бластоцист, способный имплантироваться в матку и развиваться.
Предпринята попытка идентифицировать новые регуляторы, контролирующие выбор кленточной судьбы во врем предимплантационного развития. Было установлено, что модификатор хроматина Satb1 является важным игроком. Satb1 впервые был идентифицирован в тимоцитах, где он, как известно, регулирует экспрессию генов путем организациии структуры высшего порядка хроматина в петелобразные домены и путем действия как 'посадачная платформа' для энзимов, ремоделирующих хроматин (Cai et al., 2006; Yasui et al., 2002). В mESCs, Satb1, как было установлено, регулирует плюрипотентность путем непосредственной репрессии Nanog; Satb1 нокаутные mESCs сохраняют экспрессию Nanog даже, если помещены в среду дифференцировки (Savarese et al., 2009). Однако роль Satb1 у преимплантационных эмбрионов оставалась неизвестной.
Здесь мы установили, что экспрессия Satb1 специфически активируется на уровне мРНК и белка во внутренних клетках на ст. 16-клеточных эмбрионов, когда впервые специфицируется ICM, указывая тем самым на потенциальную роль в спецификации этих клеток. Далее мы установили, что Satb1 специфически активируется в предшественниках PE, подтверждая его потенциальную важность в спецификации PE. Мы подтвердили эту гипотезу путем подавления Satb1, которая приводила к уменьшению количества PE клеток и увеличению количества EPI клеток на ст. бластоциста. В соответствии с этим избыточная экспрессия Satb1 оказывала противоположные эффект на спецификацию клонов и способствовала клону PE в ICM.
Наши клональные нокдаун и с избыточной экспрессией эксперименты подтвердили эти находки, т.к. мы нашли, что бластомеры с пониженным уровнем Satb1 преимущественно дают EPI, а те что с повышенным уровнем Satb1
преимущественно дают PE. Мы установили, что Satb1 не оказывает эффекта га эмбрионы на ст. 16-32 клеток, когда инициируется спецификация PE . Скорее всего, он играет роль в детерминации клеток внутри бластоцистов клона PE. Мы также установили, что эти изменения в судьбе клеток объясняются модуляцией экспрессии серии клон-специфических генов, стоящих ниже передачи сигналов Fgf. Мы установили, что хотя модуляция экспрессии Satb1 четко влияет на детерминацию клеточных судеб у преимплантационных эмбрионов мыши, довольно редки результаты с полным отсутствием PE или EPI клонов. Это важно, если рассматривать в контексте нокаутных Satb1 мышей, которые выживают во время эмбриогенеза, но погибают в3-недельном возрасте (Alvarez et al., 2000). Если Satb1 важен для регуляции баланса между плюрипотентностью и дифференцировкой, то как это можно примирить с отсутствием преимплантационных фенотипических отклонений нокаутных мышей? Ранее было показано, что минимальной потребностью для успешного развития являются 3-4 плюрипотентные клетки к моменту имплантации (Morris et al., 2012; Soriano and Jaenisch, 1986). Если Satb1-/- эмбрионы имеют фенотипические отклонения, то они , скорее всего, будут иметь ICM с большим количеством клеток EPI и низким количеством PE клеток. Сходные фенотипы были обнаружены у Fgf4+/- и Gata6+/- эмбрионов и в обоих случаях были способны к восстановлению на ст. E4.5 (Bessonnard et al., 2014; Krawchuk et al., 2013). Следовательно, возможно, что хотя Satb1 помогает организовать и специфицировать нормальные количества PE и EPI клеток в ICM, он может быть не абсолютно необходим для жизнеспособности эмбрионов и может быть скомпенсирован в соответствии с высоко регулятивной природой развития млекопитающих.
Satb1 близкородственный с др. членом семейства, Satb2, это заставило нас исследовать, не может ли Satb2 также функционировать во время преимплантационного развития. Мы установили, хотя подавление активности Satb2 не оказывает эффекта на развитие, истощение обоих генов частично способно устранять Satb1 RNAi фенотип. Это согласуется с результатами на mESCs, поскольку нокдаун Satb1 и Satb2 устранял нарушение дифференцировки, характерное для Satb1-/- mESCs (Savarese et al., 2009). Наши результаты показали, что это, скорее всего, происходит из-за того, что нокдаун Satb2 снижает мРНК Nanog, противоположный эффект к снижению Satb1.
В согласии с этим, избыточная экспрессия Satb2 способна увеличивать уровень экспрессии Nanog, предоставляя доказательства, что Satb2 является позитивным регулятором Nanog. Satb1 и Satb2, следовательно, оказывают противоположные эффекты на экспрессию Nanog. Поэтому мы полагаем, что когда редуцирован только Satb1, то это приводит к репрессии Nanog и Satb2, и этого достаточно для выбора клетками судьбы EPI. Эта склонность подтверждается тем фактом, что Satb1 также действует как позитивный регулятор факторов дифференцировки PE Sox17 и Gata6. Нокдаун Satb1 и Satb2 устраняет как репрессию, так и активацию экспрессии Nanog, при этом суммарный эффект проявляется в нормализации уровней экспрессии Nanog. Представленные здесь результаты показывают, что эффект Satb2 на Nanog может помочь объяснить, почему невозможно получить Satb2-/- mESCs (Savarese et al., 2009), потому что без соотв. уровня экспрессии Nanog, будет невозможно получить функциональные ESC клоны.
Эффект Satb2 на экспрессию Nanog вызывает вопрос, почему снижение уровней Satb2 в эмбрионе не влияет на развитие в той же степени, что и модуляции Satb1. Единственным объяснением является то, что хотя Satb2 siRNA способна снижать уровни Nano, более чем 65% мРНК Nanog всё ещё присутствует после RNAi. Хотя Nanog является критическим фактором в детерминации судеб клеток в высоко регулятивном эмбрионе мыши 35% снижение уровней Nanog может быть недостоточным для изменения клеточных судеб. Кроме того, наши результаты подтвердили, что хотя Satb2 может влиять только на экспрессию Nanog у эмбрионов, Satb1 оказывает влияние на экспрессию множественных генов включая Cdx2, Gata6, Id2 и Sox17. Тот же самый паттерн хотя и с противоположными эффектами на экспрессию, отмечается для избыточной экспрессии Satb1 и Satb2. Комбинированные эффекты Satb1, на многочисленные гены достаточны, чтобы управлять изменением клеточной судьбы в ICM. Модулирование Satb2, однако, лишь слегка затрагивает Nanog. Это может также объяснить, почему двойной нокдаун Satb1 и Satb2 вызывает лишь частичное восстановление Satb1 siRNA фенотипа, поскольку хотя уровни экспрессии Nanog могут быть сохранены, эффекты на др. гены, регулируемые c помощью Satb1, нет.
Наконец, наши результаты показали, что ингибирование передачи сигналов Fgf подавляет экспрессию Satb1, которая может быть восстановлена путем добавления экзогенной мРНК Satb1. Мы также попытались устранить пертурбации в судьбах клеток, которые возникают после подавления передачи сигналов Fgf (Nichols et al., 2009; Schrode et al., 2014; Yamanaka et al., 2010) c помощью избыточной экспрессии мРНК Satb1, но мы оказались неспособны восстановить экспрессию маркеров PE на ст. бластоциста (data not shown). Мы полагаем, что это происходит из-за того, что путь передачи сигналов Fgf имеет широкое разнообразие мишеней в эмбрионе мыши и восстановление одного из нижестоящих путей недостаточно, чтобы преодолеть множественные эффекты подавления передачи сигналов Fgf. Соотв., репрессия передачи сигналов Fgf приводит к сходному, но более выраженному фенотипу по сравнению с подавлением Satb1, при этом все ICM клетки, экспрессируют EPI клональные маркеры (Frankenberg et al., 2011; Yamanaka et al., 2010). Это указывает на то, что Satb1 может быть одной из связей между передачей сигналов Fgf и её нижестоящими мишенями у ранних эмбрионов мыши. В соответствии с этим передачи сигналов Fgf и Satb1
способствуют поддержанию и пролиферации стволовых клеток и подавляют дифференцировку трофобластных стволовых клеток (Asanoma et al., 2012; Tanaka et al., 1998).
Итак, наши результаты подтверждают, что Satb1 может действовать как модификатор хроматина, модулирующий экспрессию нижестоящей передачи сигналов Fgf, подчеркивая критичность отсутствия ступени ремоделирования хроматина, которая может может служить становлению предшественников двух отдельных клонов внутри ICM. Мы полагаем, что Satb1 может в принципе действовать двумя способами, чтобы управлять судьбами клеток в ICMe. Во-первых, Satb1, как было установлено экспериментами по ко-иммунопреципитации, соединяется непосредственно с 5' фланкирующей последовательностью Nanоog в mESCs (Savarese et al., 2009), мы полагаем, что Satb1 должен также соединяться непосредственно с вышестоящей последовательностью Nanog, чтобы репрессировать его транскрипцию у эмбрионов мыши. Во-вторых, Satb1 может регулировать экспрессию многочисленных генов у эмбрионов мыши, мы полагаем, что это является функцией его способности действовать как 'landing platform', которая способна принимать хроматин-ремоделирующие энзимы, чтобы активировать или репрессировать экспрессию генов (Yasui et al., 2002).
Итак, можно предполагать, что клетки внутри ICM имеют разные уровни рецептора Fgf , Fgfr2, на своих мембранах (Guo et al., 2010; Krupa et al., 2014; Kurimoto et al., 2006; Morris et al., 2013; Ohnishi et al., 2014). Клетки с более высокими количествами рецепторов более чувствительнык Fgf лиганду (который секретируется внутренними клетками на этой стадии) и тем самым обладают более высокими уровнями Satb1 (Fig. 7). Более высокий уровень экспрессии
Satb1 д. приводить к подавлению факторов плюрипотентности Nanog и Satb2, это в свою очередь д. приводить к инициации дифференцировки в PE клон (Fig. 7). Клетки, которые менее чувствительны к передаче сигналов Fgf4, имеют пониженные уровни Satb1, это, в свою очередь, приводит к более высокой экспрессии Nanog и обусловливает склонность клеток становиться плюрипотентным EPI клоном. Кроме того, потеря Satb1 и Satb2 удаляет как активатор, так и репрессор Nanog, приводя к формированию нормальной ICM (Fig. 7). Эта гипотеза базируется на результатах, представленных здесь, помогая нашему пониманию механизма распределения, которые приводит к превращению распределения типа 'salt-and-pepper' Gata6- и Nanog-экспрессирующих предшественников внутри ICM.
Model for the role of Satb1 in ICM lineage segregation. A ‘salt-and-pepper’ distribution of Fgfr2 by the 64-cell stage means that different cells have different responses to Fgf4 signalling. Cells with lower levels of Fgfr2 are less susceptible to Fgf4 signalling and do not upregulate Satb1. Nanog is therefore more highly expressed, promoting the formation of EPI. When Satb1 is knocked down using a specific siRNA there is an increase in Nanog and therefore an increase in the number of EPI cells present in the embryo. Conversely, cells that are more susceptible to Fgf4 signalling have higher levels of Satb1. Higher expression of Satb1 leads to the inhibition of Nanog and Satb2. This in turn leads these cells to differentiate into PE. Overexpression of Satb1 with an mRNA is likewise able to bias cell fate towards the PE lineage. Reducing both Satb1 and Satb1 simultaneously is able to restore the balance in PE and EPI by removing both an activator and repressor of Nanog.
