Устранение рубцовой ткани после сердечных атак, чтобы получить здоровую сердечную мышцу: это должно стать сменой игры (game-changer) в области кардиологии и регенеративной медицины. Ученые установили, что это возможно путем изменения фибробластов (клеток рубцовой ткани) в кардиомиоциты (клетки сердечной мышцы).

Исследователи использовали технологию секвенирования РНК одиночных клеток в комбинации с математическим моделированием и генетическим и химическим подходами, чтобы выяснить шаг за шагом молекулярные изменения, происходящие во время превращения судеб клеток из фибробластов в кардиомиоциты. Ученые под руководством Li Qian из laboratory medicine at the UNC School of Medicine, не только успешно реконструировали пути в одиночной клетке, участвующие в этом процессе, но и также идентифицировали лежащие в основе молекулярные пути и ключевые регуляторы, важные для трансформации одного типа клеток в др.

"Мы использовали прямое кардиальное репрограммирование в качестве примера в данном исследовании," сказал Qian, "Но пути и методы, открытые нами могут быть использованы в любом др. процессе репрограммирования и в принципе в др. несинхронизированных и гетерогенных биологических процессах."

Когда мы были детьми, то эмбриональные стволовые клетки по всему нашему телу постепенно изменялись в разнообразные высоко специализированные типы клеток, такие как нейроны, клетки крови и клетки сердечных мышц. В течение длительного времени ученые полагали, что эти специфические типы клеток являются окончательными; что они не могут изменяться снова или ревертировать назад в состояние между эмбриональным и финальным состоянием дифференцировки. Недавние открытия показали, что возможно обратить окончательно дифференцированные соматические клетки в плюрипотентное состояние -- состояние "master" клетки, которая может самовоспроизводиться и в принципе превращаться в любого типа клетки тела. Ученые также установили, как превращать одного типа дифференцированные соматические клетки в др. тип без проведения их через плюрипотентное состояние или состояние оригинальных предшественников. Такие находки сдвинули парадигму клеточной иерархии и революционизировали исследования стволовых клеток и область регенеративной медицины. Теперь выясняется, как специфицируются подобные процессы, чтобы приблизить их к клинике.

Прямое кардиальное репрограммирование, многообещающий подход к кардиальной регенерации и моделированию болезней, которое впервые стали разрабатывать несколько лет тому назад в лаб. Qian, используя прямое превращение кардиальных не миоцитов в индуцируемые кардиомиоциты (iCMs), очень напоминающие эндогенные CMs. Подобно любому процессу репрограммирования многие клетки, которые оказываются репрограммироваными, не делают это в одно и то же время.

"Это 'асинхронный' процесс," говорит Qian. "Превращения происходят в разные инервалы времени. Так, что на любой стадии клеточная популяция всегда содержит оставшиеся прежними, частично репрограммированные и полностью репрограммированные клетки. Следовательно, клеточное репрограммирование является 'гетерогенным,' это затрудняет его изучение с использованием традиционных подходов."

В данном исследовании с помощью использования техники microfluidic single-cell RNA секвенирования, в Qian's лаб. обратились к двум основным вопросам 'асинхронного' программирования и гетерогенности клеточной популяции. Они анализировали изменения глобального транскриптома во время изменения судьбы из фибробластов в iCMs.

Используя математические алгоритмы они идентифицировали молекулярно отличающиеся субпопуляции клеток среди репрограммируемого насоса (pipeline). Затем они реконструировали пути формирования iCM, базируясь на моделировании и экспериментальном подтверждении. Эти маршруты предоставили им беспрецедентные дорожные карты высокого разрешения для дальнейшего изучения механизмов превращения клеток.

"Некоторые из них явились важными для клиники," говорит Qian, "Напр., мы узнали, что после сердечной атаки кардиальные фибробласты вокруг поврежденной области немедленно активируются и становятся высоко пролиферативными, но их способность к пролиферации снижается со временем. Как использовать преимущества состояния варьирования клеточного цикла фибробластов по мере прогрессирования сердечной атаки, их второй урожай д. определенно расширять использование клеточного репрограммирования у пациентов и оптимизировать исход."

Qian добавляет, "Мы продемонстрировали пути между клеточной пролиферацией и клеточным репрограммированием. Мы также получили экспериментальные подтверждения, что состояние клеточного цикла стартующих фибробластов д. изменять исход формирования новых миоцитов."

Её группа установила, что молекулярные характеристики субпопуляций фибробластов по-разному супрессируются во время репрограммирования, подтверждая, что чувствительность клеток к репрограммированию варьирует.

Интересно, что эта чувствительность совпадает со временем дифференцировки кардиомиоцитов во время развития сердца. Показатели в промежуточных популяциях, которые, по-видимому, появляются рано в развитии сердца, оказываются более устойчивыми к альтерациям. Это указывает на то, что недавняя эпигенетическая память клеток может быть легче стерта и такая субпопуляция фибробластов с такими эпигенетическими признаками может более легко конвертирована в кардиомиоциты.

"Манипуляции с эпигенетической памятью -- не только изменяют их современное эпигенетическое состояние -- могут оказаться критическими для изменения клеточных судеб в лечебно-профилактическом значении," говорит Qian.

При дальнейшем анализе изменений глобальной экспрессии генов во время репрограммирования, исследователи идентифицировали неожиданные факторы подавления регуляции, участвующие в процессинге и сплайсинге мРНК .

"Это стало для нас большим сюрпризом," сказал Qian. "Мы установили, что некоторые из базовых клеточных аппаратов (machinery) драматически изменяются, подобно аппарату по продукции, транспортировке и деградации белков и как мы установили в деталях -- аппарат сплайсинга мРНК."

Группа продолжает детальный функциональный анализ главных кандидатов -- фактора сплайсинга, наз. Ptbp1. Доказательства указывают на то, что он является критическим барьером на пути приобретения паттерна сплайсинга, специфичного для кардиомиоцитов в фибробластах. Показано, что истощение Ptbp1 способствует образованию большего числа iCMs.

"Новые знания, извлекаемые из наших механистических исследований о том, как один фактор сплайсинга регулирует превращения судеб фибробластов в кардиомиоциты действительно явился бонусом для нас," продолжает Qian. "Без этой беспристрастной природы этого подхода, мы не смогли бы получить такую свежую, ценную информацию о процессе репрограммирования. И это является самым прекрасным в нашей платформе."

Дополнительный количественный анализ выявил строгую корреляцию между экспрессией каждого фактора репрограммирования и прогрессом в индивидуальной клетке процесса репрограммирования и привел к открытию нового набора маркеров, обогащающих iCMs.

Qian заявляет, "Я верю междисциплинарные подходы, использованные в работе, являются очень продуктивными. Они помогли нам идентифицировать ранее не распознанные функции или механизмы, а также лучше понять природу клеток и течение болезни. В конечном итоге такой подход может оказаться пригодным не только у пациентов с болезнями сердца, но и у пациентов с раком, диабетом, нейрологическим болезнями и др. состояниями."