Анализ иерархии стволвых клеток в раковых опухолях человека затруднен из-за невозможности идентифицировать или отслуживать популяции опухолевых клеток в интактных условиях. Чтобы преодолеть это ограничение мы предложили стратегию, базирующуюся на редактировании генома на происходящих от пациентов опухолевых органоидах, используя технологию CRISPR/Cas9, чтобы интегрировать репортерные кассеты в желаемые маркерные гены. Для проверки концепции, мы преобразовали человеческие colorectal cancer (CRC) органоиды, которые несут EGFP и клон-отслеживающие кассеты, подвергнутые нокауту в локусе
LGR5. Анализ of LGR5-EGFP+ клеток, выделенных из органоид-происходящих ксеногтрансплантатов, продемонстрировали, что эти клетки экспрессируют генетическую программу, сходную с таковой из нормальных стволовых клеток кишечника и что они размножают болезнь у реципиентных мышей очень эффективно. Эксперименты по отслеживанию клонов показали, что LGR5+ CRC клетки самообновляются и генерируют потомство в течение длительного периода времени , которые подвергаются дифференцировке в направлении mucosecreting- и absorptive-like фенотипов. Эти генетические эксперименты подтвердили, что человеческие CRCs воспринимают иерархическую организацию, напоминающую нормальный эпителий толстой кишки.
CRISPR/Cas9-обусловленное геномное редактирование облегчает интеграцию кассет маркерных генов в колоректальный рак (CRC) в происходящих от пациентов органоида (PDOs).
GFP репортер, интегрированный в локус LGR5, метит популяцию ocus ISC-подобных опухолевых клеток в CRCs человека.
Популяция клеток LGR5-GFP+ была обогащена в клетках, инициирующих опухоль.
Анализ отслеживаемых клонов с использованием CreERT2 knock-in PDOs продемонстрировал, что интактные опухолевые LGR5+ CRC клетки являются мультипотентными, длительно живущими и продуцируют клоны клеток, которые увеличиваются пропорционально росту опухоли.
Дважды отредактированные LGR5-GFP/Ki67-RFP PDOs обнаруживают существование пролиферирующих и покоящихся LGR5+ CRC клеток.
Discussion
Комбинация органоидов и технологии CRISPR/Cas9 позволяет исследовать опухоли человека с помощью генетических подходов, которые пока осуществимы только на модельных животных. Становится возможным проанализировать фенотипическое разнообразие клеточных популяций внутри рака, делая возможным мечение и отслеживание разных опухолевых клеток с помощью специфических генов маркеров, экспрессирующихся на клеточной поверхности. В противоположность их пригодность для изучения геномной гетерогенности ограничена. Поэтому опухоли, генерируемые из отредактированных органоидов, отражают поведение линии клеток из одиночной стволовой клетки на генетически гомогенном мутантном фоне. Чтобы гарантировать, что редактируемые органоиды являются хорошими суррогатами родительской популяции, мы отбирали такие, обладающие мутационным профилем, который перекрывается с таковым, происходящими из органоидов. Хотя и маловероятно, но мы не можем исключить немногие частные мутации, идентифицированные в этих моноклональных органоидах или в др. эпигенетические альтерации, которые могут наделять клетки дифференциальными свойствами. Несмотря на эти препятствия возможности экспериментов по картированию возникших клеточных судеб в раковыцх опухолях пациентов предоставляют существенные преимущества. Такой подход позволяетанализировать взаимоотношения клонов клеток в интактных опухолях и позволяет изучать, как разные клеточные популяции вносят вклад в рост, распространение и резистентность к терапии.
Стволовые клетки колоректального рака ранее были изолированы из проб от пациентов, используя разные маркеры клеточной поверхности, включая CD44, CD133 или EPHB2, которые концентрируются в популяциях опухоль-инициирующих клеток (O'Brien et al, 2007; Dalerba et al, 2007; Ricci?Vitiani et al, 2007; Merlos?Suarez et al, 2011). В обычной слизистой толстого кишечника эти маркеры широко экспрессируются в компартментах стволовых клеток и временно амплифицирующихся клеток (Zeilstra et al, 2008; Snippert et al, 2009; Jung et al, 2011). Напротив домен экспрессии LGR5 ограничен ISCs (Barker et al, 2007), пока анализ клеток, экспрессирующих LGR5 в CRCs человека не был возможен из-за отсутствия хороших реагентов. Мы показали, что клетки LGR5+ CRC, экспрессирующие генетическую программу нормальных ISCs, являются клоногенными ex vivo, и обладают мощной способностью иницииации опухоли. Мы осуществили впервые эксперименты по отслеживанию клонов в человеческом CRC, которые показали, что LGR5+ опухолевые клетки продуцируют потомство в течение длительного периода, которые подвергаются дифференцировке в определенные клоны. Следовательно, несмотря на накопление множественных альтераций генов, человеческие CRCs управляются с помощью клеточной иерархии, напоминающей ту, что присутствует в нормальном эпителии кишечника. Наши наблюдения выявили два интересных аспекта. Во-первых, кинетика дифференцировки опухолевых клеток в CRC, по-видимому, довольно медленный процесс по сравнению с нормальным эпителием, потомство LGR5+ISCs подвергается дифференцировке спустя 2-3 дня после того, как они покинут основание крипты (Clevers, 2013). Напротив, клоны, продуцируемые LGR5+ CRC клетками, были в основном лишены дифференцированных клеток, которые начинали накапливаться только спустя ~2 недели. Эта задержка дифференцировки хорошо согласуетя с наблюдением, что LGR5+ и KRT20+ опухолевые клетки располагаются в комплементарных компартментах скорее, чем перемешаны в одной и той же области. Во-вторых, в то время как огромное большинство нормальных ISCs остается в пролифыративном состоянии (Schepers et al,2012; Basak et al, 2014), существенная пропорция LGR5+ CRC клеток вносит вклад в небольшое потомство, согласно данным по отслеживанию клонов. Этот субнабор неактивных LGR5+ клеток, скорее всего, представлен клетками LGR5+/KI67- , идентифицируемыми при двойном-репортерном knock-in PDOs. Эти данные подтверждают, предыдущий клональный анализ CRC с использованием лентивирусов, маркирующих выборки от пациентов, которые выявили существование покоящихся клеток, которые могут быть реактиврованы после пассажей или химиотерапевтического лечения (Dieter et al, 2011; Kreso et al, 2013). Наконец, находка, что потомство LGR5+ опухолевых клеток соответствует (scales) общему количеству эпителиальных клеток, согласуется с гипотезой, что рост CRC является результатом активности многих LGR5+ опухолевых стволовых клеток. Но наши данные не исключают, что LGR5- клетки могут вносить равный вклад в рост опухоли. В нормальном кишечном эпителии дифференцированные клетки могут условно (opportunistically) зхамещать LGR5 + ISCs благодаря пластичности (van Es et al, 2012; Tetteh et al,2016), подразумевая, что ISC фенотип не закреплен жестко, а скорее индуцируется с помощью ниш. Поэтому возможно, что LGR5+ и LGR5- опухолевые фенотипы также являются пластичными. Наше наблюдение, что ксенотрансплантанты, генерируемые LGR5- клетками обнаруживают клеточные паттерны, эквивалентные тем, что продуцируются LGR5+ клетками, может указывать на взаимное превращение двух клеточных популяций. Для соотв. оценки пластичности необходимо кратировать судьбу LGR5- клеток в интактных опухолях.
