Посещений:
ПРОГРАММА РАЗВИТИЯ ЗАРОДЫШЕВЫХ КЛЕТОК



Принципы раннего развития человека

Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems
• Toshihiro Kobayashi, • Haixin Zhang, • Walfred W. C. Tang et al.
Nature 546, 416–420 (15 June 2017) doi:10.1038/nature22812

Human primordial germ cells (hPGCs), the precursors of sperm and eggs, originate during weeks 2-3 of early post-implantation development1. Using in vitro models of hPGC induction2, 3, 4, recent studies have suggested that there are marked mechanistic differences in the specification of human and mouse PGCs5. This may be due in part to the divergence in their pluripotency networks and early post-implantation development6, 7,8. As early human embryos are not accessible for direct study, we considered alternatives including porcine embryos that, as in humans, develop as bilaminar embryonic discs. Here we show that porcine PGCs originate from the posterior pre-primitive-streak competent epiblast by sequential upregulation of SOX17 and BLIMP1 in response to WNT and BMP signalling. We use this model together with human and monkey in vitro models simulating peri-gastrulation development to show the conserved principles of epiblast development for competency for primordial germ cell fate. This process is followed by initiation of the epigenetic program9, 10, 11 and regulated by a balanced SOX17-BLIMP1gene dosage. Our combinatorial approach using human, porcine and monkey in vivo andin vitro models provides synthetic insights into early human development.

Мы впервые определили источних свиных PGCs (pPGCs) перед и вначале гаструляции у эмбрионов на 9.5-16 (E9.5-E16) день эмбриогенеза. Приблизительно на ст. E9.5-E10 выявляются ключевые маркеры плюрипотентности NANOG, OCT4 и SOX2 в эпибласте двухслойных эмбрионов (Fig. 1a). На ст. E11 будущей первичной полоски (pre-PS) эмбрионы обнаруживают становление передне-задней оси (Extended Data Fig. 1a), экспрессия BRACHYURY (известен также как T) обнаруживается в клетках задней части псевдостратифицированного эпибласта, вместе с NANOG и OCT4, но SOX2 подавляется (Fig. 1b).

Figure 1: Specification of PGCs in gastrulating porcine embryos.

Serial sections with immunostainings. a, Bilaminar disc embryo (~E9.5-E10). Arrowhead marks the epiblast/trophectoderm boundary. Scale bar, 20µm. b, Pre-primitive-streak embryo (pre-PS; ~E11). Scale bar, 10µm. c, Early primitive streak embryo (early-PS; ~E11.5-E12) with SOX17 and BLIMP1 expression. Close-up (dashed lines) shows four SOX17+BLIMP1+ cells (arrows). Dashed lines highlight SOX17+BLIMP+ cells. The hypoblast is SOX17+BLIMP1+. Scale bar, 10µm. d, Primitive streak embryo (PS; ~E12) with a pPGC cluster showing SOX17 and NANOG expression. Four SOX17+ cells without NANOG in the most anterior pPGC cluster (arrows in middle image). The rightmost image (arrows) shows five SOX17+BLIMP1? cells. Arrowheads show anterior primitive streak with SOX17+ definitive endoderm cells. Dashed lines highlight SOX17+BLIMP+ cells. Scale bar, 10??m. Inset shows the whole embryo. e, Late primitive streak embryo (late-PS; ~E12.5-E13.5) with a pPGC cluster (arrow) showing NANOG, SOX17, TFAP2C, BLIMP1, T and Sda/GM2 expression. Arrowheads, early migratory pPGCs. Scale bar, 25µm. A-P, anterior-posterior axis. f, Quantification of EdU incorporation in pPGCs and somatic cells. Numbers denote analysed cells (error bars, mean?±?s.e.m.). g, Sagittal section of E14.5 embryo immunostained for OCT4 and 5hmC, and the pPGC cluster (white square on the right). Arrows, migratory PGCs. Scale bar, 20µm. h, Quantification of 5hmC in analysed cells (boxes, mean and interquartile ranges; whiskers, maximum and minimum; Mann-Whitney U-test, *P<0.01). i, Immunostaining for UHRF1 in E14 embryos. Dashed line delimits the pPGC cluster. Scale bar, 20µm.


По средней линии эмбрионов ранней PS стадии (~E11.5-E12), мы обнаружили первый кластер клеток SOX17+ на заднем конце формирующейся первичной полоски (Fig. 1c, d, Extended Data Fig. 1b); большинство из них экспрессируют BLIMP1, за исключением тех, что на переднем конце (arrows in Fig.1c, d). Экспрессия SOX17 предшествует BLIMP1, а NANOG активируется в SOX17+BLIMP1+ pPGCs (Fig. 1d,Extended Data Fig. 1b). У эмбрионов на ст. E12.5-E13.5, pPGCs обнаруживают совместную экспрессию SOX17, BLIMP1, NANOG, TFAP2C, OCT4 и pPGC клеточного поверхностного маркера Sda/GM2 (ref. 12), но обнаруживаются низкие уровни экспрессии T (Fig. 1e, Extended Data Fig. 1c, d). Этот кластер pPGC приблизительно из 60 SOX17+BLIMP1+ клеток, расположенный на границе между эмбриональной и внеэмбриональной тканями у эмбрионов на ранней PS стадии (~E12), увеличивается более чем до 300 pPGCs на ст. E15.5 (Extended Data Fig. 2a-c). 6-час. пульсовое воздействие EdU мечения показало, что синтез ДНК прекращается вскоре после обнаружения эпитопа Sda/GM2 (Fig. 1f, Extended Data Fig.2d), указывая, что острое увеличение pPGCs возможно обусловлено дополнительным рекрутированием из T+ компетентных предшественников. После этого, наступает состояние покоя pPGCs и пауза перед миграцией как у мышей mice (13) (Fig. 1f, Extended Data Fig. 2c). Заметно, что экспрессия PRDM14 в pPGCs слабая и,по-видимому, цитоплазматическая (Extended Data Fig. 1f), тогда как SOX2 не обнаруживается (Extended Data Fig. 2e, f).
Инициация специфичной для зародышевой линии эпигенетической программы (9, 14) обнаруживается в зарождающихся pPGCs, при этом наблюдается глобальное снижение 5-methylcytosine (Extended Data Fig. 3b, c) и одновременное увеличение 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) (Fig. 1g, h). Постепенно UHRF1 подавляется (Fig. 1i), а TET1 усиливается (Extended Data Fig. 3a).Наблюдается также прогрессивное снижение экспрессии H3K9me2 и G9A (известен также как EHMT2) (Extended Data Fig. 3b, c), а глобальное деметилирование ДНК происходит по мере миграции pPGCs в направлении гонад (Extended Data Fig. 3d). pPGCs продолжают экспрессировать express SOX17, BLIMP1, TFAP2C, OCT4 и NANOG (arrowheads in Fig. 1e,Extended Data Fig. 2e, f), как видно на эквивалентах hPGCs in vivo (4, 9). Т.о., pPGCs, возникающие из эпибласта свиней перед и вначале гаструляции обнаруживают тесное сходство с hPGCs вследствие последовательной экспрессии SOX17 и BLIMP1 и начала эпигенетической программы (4, 9).
Чтобы определить, когда свиной эпибласт приобретает компетентность становиться pPGC, мы выделяли эпибластные диски из гипобласта и и трофэктодермы на разных ст. развития (Fig. 2a, b, d, e). Мы воздействовали на них цитокинами, включая или BMP2 или BMP4 (refs 2) (далее они будут упоминаться как цитокины ), на ст. 64 ч, чтобы индуцировать pPGCs ex vivo (Fig. 2f). Хотя не наблюдалось реакции ранее ст. E10.5-E11 в двух-слойном диске эпибласта, эффективная индукция pPGCs происходила в эпибластах со ст. E11.5 пре-PS эмбрионов, при этом наблюдалась одновременная экспрессия SOX17, BLIMP1, NANOG, OCT4 и TFAP2C (Fig. 2g, h,Extended Data Fig. 3e). Безусловно, вы выявляли строгий сигнал BMP2/4 в задней части pre-PS и у ранних PS эмбрионов свиней in vivo (15, 16) (Fig. 2a), при этом ядерные pSMAD1/5/8 обнаруживались в задней части эпибласта (Fig. 2c). BMP inhibitor (BMPi) устранял индукцию pPGC (Fig. 2g, Extended Data Fig. 3e). Компетентность приобретать судьбу pPGC снижалась во время ст. ранней PS одновременно с началом гаструляции и дифференцировки мезодермы (Fig. 1c). Передача сигналов WNT из задней части pre-PS эпибласта также важна (16) (Fig. 2a), что доказывается высокой пропорцие T+ клеток, нижестоящихмишеней для WNT17, во время индукции pPGC (Fig. 1b). WNT inhibitor (WNTi) снижает индукцию pPGC, но не на ранней PS стадии эпибласта, когда когда они уже комптентны приобретать судьбу pPGC (Fig. 2g, Extended Data Fig. 3e). Экспрессия T в ответ на WNT является общим свойством компетентности для выбора судьбы зародышевыми клетками (3, 4, 17).



Figure 2: Competence for pPGC specification.

a, Representation of porcine epiblasts and signalling for pPGC induction. b, Top-down views of epiblasts. Scale bar, 0.25 mm. c, Serial sections of a pre-PS embryo showing pSMAD1/5/8 and T. Close-up (dashed lines) of posterior epiblast cells (arrows) with nuclear pSMAD but no T. Scale bar, 20µ??m. d, Schematic for 64 h epiblast culture. e, Epiblasts prior to culture. Scale bar, 0.5 mm. f, Epiblasts after 64 h culture. g, Scatter plot for triple-positive pPGCs staining (median; Mann-Whitney U-test, P<0.05). h, Triple-immunostaining of epiblasts. Scale bar, 20µm. WNTi, WNT inhibitor; BMPi, BMP inhibitor.


Т.к. мы не смогли проверить непосредственно ранние эмбрионы человека поэтому мы стимулировали пери-гаструляционное развитие человека и обеспечивали выбор судьбы hPGC in vitro. Мы установили на модели in vitro плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSCs) при формировании мезодермы и окологаструляционного развития (18-20) (Fig. 3a). Эти hPSCs в срого определенной стандартной питательной среде (далее обозначаемые как conv-hPSCs) , по-видимому, эквивалентны презгаструляционноу эпибласту свиньи (21). Чтобы отследить избытокили потерю компетентности в отношении спецификации hPGC в ходе дифференцировки мезодермы, мы использовали клетки с чувствительностью к NANOS3-tdTomato репортеру (see Extended Data Fig. 4). После доказательства индукции hPGCs c помощью цитокинов в интервале в 6 ч (Fig. 3a), мы наблюдали пик компетентности приблизительно 12 ч во время дифференцировки мезодермы, после чего происходило снижение (Fig. 3b, d), проявляющееся в ступенчатообразном переходе клеточных состояний. PGC-компетентные клетки обнаруживали умеренное увеличение маркеров первичной полоски T, MIXL, GSC, EVX1 и EOMES, и незначительное снижение SOX2 (Fig. 3e,Extended Data Fig. 5a, b). Со ст. 18 ч наблюдалось усиление маркеров поздней первичной полоски TBX6, MESP1/2 и SNAI1/2, которые запускают эпителиально-мезанхимный переход, происходящий во время гаструляции (22) (Extended Data Fig. 5b). Реакция клеток на передачу сигналов также изменяется, т.к. BMP2/4 теперь индуцируют мезодермальные клетки (Extended Data Fig. 5b, e-h), тогда как activin A и BMP ингибитор эффенктивно индуцируют дефинитивную энтодерму (18) (Fig. 3c, d. Extended Data Fig. 5e-h). Т.о.. начиная примерно с ст. 12 ч, мезодермальные предшественники (pre-ME) оказываются компетентными к принятию судьбы PGC, но приблизительно со ст. 18 ч (mesendoderm), компетентность к выбору PGC снижается, при этом одновременно возрастает компетентность к выбору дефинитивной энтодермы и/или выбору судьбы мезодермы (Fig. 3a-c).



Figure 3: Simulation of human peri-gastrulation and hPGC competency.

a, Schematics showing progressive gain and loss of competency for hPGCs. b, Induction of hPGCs (percentage of NANOS3-tdTomato+ alkaline phosphatase (AP)+ cells) in day 4-5 embryoids. c, Induction of definitive endoderm (DE; percentage of CXCR4+ cells) during 12-24?h of mesendoderm differentiation.d, Immunostaining of hPGCs induced from pre-ME (12?h) and of definitive endoderm induced from mesendoderm (24?h). Dashed lines, SOX17+OCT4+ hPGCs. Scale bar, 50??m. e, Gene expression (reverse-transcription with quantitative PCR (RT-qPCR)) changes during mesendoderm induction. f, Induction of hPGCs (percentage of NANOS3-tdTomato+AP+ cells) from pre-ME (12?h) or mesendoderm (24?h). Pre-ME are competent for hPGCs in response to cytokines or SOX17, but mesendoderm is not. g, Immunostaining of day 4 embryoids from pre-ME (12?h) or mesendoderm (24?h). SOX17 in pre-ME induced OCT4+BLIMP1+ hPGCs (dashed line), but in mesendoderm, it induced definitive endoderm (BLIMP1+FOXA2+) cells. Scale bar, 50µm.


передача сигналов WNT и ACTIVIN/NODAL необходим а для возникновения компетентности становиться hPGCs в 12 ч pre-ME (Extended Data Fig. 5c). Подавление BMP во время дифференцировки мезэнтодермы заметно снижает эффективность индукции hPGC, подтверждая роль эндогенного BMP (Extended Data Fig. 5d). Добавление BMP во время pre-ME (12 ч), однако не влияет на компетентность становиться hPGC, но способствует дифференцировке в латеральную мезодерму на ст. 24 ч, которая возникает из средней и задней части первичной полоски (Extended Data Fig. 5e-h). Напротив, дифференцировка дефинитивной энтодермы происходит в передней части первичной полоски, как это наблюдается у свиных эмбрионров на ст. первичной полоски (arrowheads inFig. 1d, Extended Data Fig.1c), подтверждая, что BMP обеспечивает характеристики задней части первичной полоски после гаструляции (Extended Data Fig. 5i). Объединенные доказательства от эмбрионов свиней и воспроизведения in vitro c помощью conv-hPSCs, демонстрируют прогрессивное и временное приобретение компетентности в отношении hPGC, что сопровождается приобретением компетентности к дефинитивной энтодерме и/или мезодерме.
Чтобы проверить, действительно ли эта модель приложэима к не человеко-образным обезьянам, мы использовали cynomolgus monkey PSCs (cmPSCs), чтобы индуцироваать дифференцировку мезэнтодермы (Extended Data Fig. 6a, b). Удивительно, cmPSCs также обнаруживали временное повышение компетентности к приобретению судьбы cmPGC приблизительно на ст. 12 ч вво вр и после этого дефиенитивной энтодермы и мезодермы на ст. 24 ч (Extended Data Fig. 6c-f). Недавнее исследование подтвердило, что cmPGCs происходят из зарождающегося амниона, происходящего из эпибласта (23); двойное происхождение также возможно. Детальный молекулярный анaлиз амниона важен,т.к. SOX17 и BLIMP1 играют роли в нескольких местах, включая внеэмбриональные ткани (24, 25), которые обнаруживают значительное онтогенетическое разнообразие и имеют меньше онтогенетических ограничений, чем эпибласт (26). Необходим дальнейший in vivo анализ по отслеживанию эмбрионов не человекообразных приматов и потенциально человеческтх эмбрионов in vitro.
Затем мы исследовали комбинаторную роль ключевых транскрипционных факторов, принимая во внимание, что SOX17 является ключвевым регулятором как hPGCs, такк и дефинитивной энтодермы (4, 27) (Fig. 3d). Эктопическая экспрессия SOX17 в pre-ME на ст. 12 ч индуцирует hPGCs, приводя к возникновению клеток NANOS3-tdTomato+OCT4+BLIMP1+ , но в мезодерме на ст. 24 ч она эффектиуно индуцирует FOXA2+ (дефинитиывную энтодерму) (Fig. 3f, g). Во время индукции hPGCs в pre-ME c помощью BMP (Extended Data Fig. 7a, b), мы впервые обнаруживаем SOX17 на ст. 12 ч, и приблизительно 30-40% клеток экспрессируют также BLIMP1, но не TFAP2C (Extended Data Fig. 7c, d), как у эмбрионов свиней (Extended Data Fig. 1e). TFAP2C выявляется приблизительно на ст. 18 ч, когда количество SOX17+BLIMP1+TFAP2C+ увеличивается прогрессивно. Эти предполагаемые hPGCs в конечном итоге образуют кластер в середине эмбриоидов на ст. 48 ч (Extended Data Fig. 7b, c, e). Начиная со ст. 12 ч, экспрессия NANOG прогрессивно увеличивается в SOX17+BLIMP1+ клетках (Extended Data Fig. 7e, f). Однако в отличие от мышей (28), NANOG сам по себе не может индуцировать hPGCs (Extended Data Fig. 8a-c) , а экспрессия PRDM14 оказывается низкой (2, 4), и может быть цитоплазматической в E14 pPGCs (Extended Data Fig. 1f) и в in vivo гонадных hPGCs (9). PRDM14 является критическим для выбора судьбы PGC и эпигенентического репрограммирования у мышей (29), Но его роль, если таковая существует, в hPGCs и pPGCs нуждается в дальнейшем исследовании.
Затем мы тестировали роль SOX17, BLIMP1 и TFAP2C по отдельности и в комбинации в индукции hPGCs в само-обновляющихся PGC-компетентных hPSCs (comp-hPSCs)(4), используя NANOS3-tdTomato репортер и индуцибельные тансгены SOX17, BLIMP1 и TFAP2C (Extended Data Figs 4c-j, 8d-g, see Methods). BLIMP1 и TFAP2C индивидуально и вместе вызывают незначительную реакцию спустя два дня, тогда как SOX17 в отдельности продуцирует умеренную реакцию, с или без TFAP2C (Fig. 4a). В частности, SOX17 и BLIMP1 совместно продуцируют сильный ответ и большая пропорция клеток NANOS3-tdTomato+ (Fig. 4a), указывает на то, чтоони действуют синергично и быстро (в течение приблизительно 24 ч), по сравнению с 96 чеобходимыми цитокинам, чтобы индуцировать сходную реакцию (Fig. 4b, c). Такой реакции предшествует подавление SOX2 (ref. 30) и усиление активности 'naive' генов плюрипотентности, включая KLF4 и TFCP2L1, как и в hPGCs in vivo (9)(Fig. 4e, Extended Data Fig. 8h). Реакция на SOX17-BLIMP1 во всем остальном сходна с таковой, вызываемой цитокинами, как показывает глобальное секвенирование РНК (RNA-seq) (Fig. 4d, Extended Data Fig. 8i, j).

Figure 4: Induction of hPGCs by SOX17-BLIMP1 and combined representation of hPGC and pPGC specification.

a, Induction of hPGCs by transcription factors in comp-hPSCs; SOX17 and BLIMP1 induce hPGCs. b, Day 1-4 embryoids with NANOS3-tdTomato reporter respond to ectopic SOX17 and BLIMP1 with or without cytokines. c, Induction of hPGCs (percentage of NANOS3-tdTomato+AP+ cells) shown in b. d, t-SNE analysis of RNA-seq data. e, Heat map of representative gene expression includes previous data4.f, Day 4 embryoids induced by cytokines. Dashed line indicates positive signals. Arrowheads, OCT4+BLIMP1+ hPGCs expressing FOXA2. Scale bar, 50µm. g, SOX17 and BLIMP1 gene dosage is critical during hPGC specification: BLIMP1 represses SOX17-induced endodermal genes. h, Representation of human germ cell origin and program based on in vitro simulations from hPSCs and in vivo origin of pPGCs in porcine embryos.


Для получения дальнейшей механистической информации мы индуцировали эктопический SOX17 вместе или без экспрессии BLIMP1 в SOX17-нулевых comp-hPSCs4 (Extended Data Figs 9a, 10a, b). Хотя SOX17 инициирует выбор судьбы hPGC, обнаруживается также достоверное увеличение экспрессии FOXA2, энтодермального гена (Fig. 4f). соответственно, FACS-очищенные гены обнаруживали экспрессию FOXA1, FOXA2 и HNF1? также как PGC маркеры OCT4, NANOG, BLIMP1 и TFAP2C (Extended Data Fig. 9b), и маркер клеточной поверхности CXCR4, экспрессируемый как энтодермой (19). так и PGCs у людей (Extended Data Fig. 9c, d). Очевидно это происходит благодаря высокой дозе эктопического гена SOX17, превышеющего уровни, вызываемые c помощью BMP в дикого типа comp-hPSCs (Extended Data Fig. 9b, e-h), без пропорционального увеличения BLIMP1 (Extended Data Fig. 9i). Очевидно, BLIMP1 репрессирует энтодермальные гены во время спецификации hPGC (9). В самом деле, одновременно высокие уровни BLIMP1 и SOX17 индуцируют hPGCs мощно и быстро, в то время как супрессия энтодермальных генов (Fig. 4g, Extended Data Fig. 10c), а также инициация специфичной для зародышевой линии эпигенетической программы (9), после подавления DNMT3A, DNMT3B и UHRF1, и усиления активности TET2 (Extended Data Fig. 8k),как и в pPGCs (Fig. 1g-i, Extended Data Fig. 3a-d).
Эмбрионы свиней ex vivo на окологаструляционных стадиях и in vitro воспоизводят у человека и обезьян развитие, подтверждающее законсервированные принцыпы спецификации PGC в контексте развития эпибласта в плоском диске эмбрионов (Fig. 4h). Мы показали, что SOX17 , скорее всего, регулирует как PGCs, так и дефинитивную энтодерму. Мы также предпложили, что передача сигналов, сопровождаемая эпигенетической активацией регуляторных элементов, может обеспечивать компетентновть в выборе судьбы PGC, а значит и дефинитивной энтодермы и/или мезодермы, в качестве интегральной части программы развития эпибласта в направлении гаструляции. SOX17 и BLIMP1 необходимы и достаточны для индукции PGCs, и для инициации специфичной для зароодышевой линии ээпигенетической программы. Будучи специфицированными PGCs необратимо детерминируются, приобретая судьбу зародышевой линии (Extended Data Figs 2e, f, 10d, e). Очевидно, что наш интегри рованный подход предоставляет информацию о раннем развитии человека и выборе клетками судеб.