Мы идентифицировали новую регуляторную функцию Jmjd2c на ткане-специфичных энхансерах во время подготовки ESC к дифференцировке. мы показали, что Jmjd2c необходим для успешной мультиклональной дифференцировки, что подтверждается формированием EB. В отсутствие Jmjd2c, EBs были маленькими и неспособными к индукции экспрессии генов, ассоциированных с дифференцировкой, включая ранние маркеры трех мезодермального, энтодермального и эктодермального листков. Более того, мы установили, что дифференцировка ESC затрудняется или останавливается на ранней пост-имплантационной эпибласт-подобной стадии. В самом деле в то время как Jmjd2c-нокаутные ESCs могут переходить в само-обновляющиеся cEpiSCs, но failed эти клетки неспособны устанавливать функциональное primed состояние - мнение, которое было подкреплено здесь их неспособностью к дальнейшему прогрессу в предшественники мезодермы. Напротив, мы установили, что Jmjd2c-нокаутные ESCs могут легко дифференцироваться в похожие на производные примитивной энтодермы при подходящих условиях, т.к. это недавно было подтверждено на тройных Jmjd2abc-нокаутных моделях (Pedersen et al., 2016). Интересно, что среди трех членов семейства Jmjd2s, Jmjd2c уникально подавляется в примитивной энтодерме из развивающегося бластоциста, тогда как в он усиливает свою активность на ст. перед и после имплантации (Fig. S3) (Boroviak et al., 2015). Этот паттерн экспрессии in vivo наиболее тесно совпадает с первичной ролью Jmjd2c в эпибласте, в то время как он безразличен для формирования вне-эмбриональных тканей, как показывают исследования с использованием моделей ESC, EpiSC и XEN in vitro.

Мы подтвердили, что нокаут Jmjd2c не является вредным для пролиферации и поддержания недифференцированного фенотипа ESC после продолжительного культивирования (Pedersen et al., 2014), заключение распространяется и на, происходящие из ESC, EpiSCs. Эти результаты еще больше подтверждают выносливость самообновления стволовых клеток, что, скорее всего, отражает компенсаторные механизмы среди родственных транскрипционных регуляторов, включая членов семейства Jmjd2 (Pedersen et al., 2016). Эти результаты однако противоречат более ранним исследованиям, показавшими, что shRNA-обусловленное истощение Jmjd2c приводит к спонтанной дифференцировке ESC и/или дерепрессии многих клон-специфических маркеров (Das et al., 2014; Loh et al., 2007). Расхождения между этими отличающимися фенотипами могут быть связаны с различиями в генетическом фоне, в условиях культивирования и с использованием разных knockdown конструкций в противовес исследованиям моделей конституитивного нокаута ESC. Важно, что наше заключение о том, что истощенные по Jmjd2c ESCs само-обновляются нормально, но все же неспособны соотв. дифференцироваться в происходящие из эпибласта предшественники, базируется на на конкурентных функциональных характеристиках Jmjd2c-knockout и -knockdown моделях, тем самым исключаются эффекты вне мишеней, обычно связанные с shRNA подходами. Ранее опубликованные исследования о функции Jmjd2c в ESCs (Das et al., 2014; Loh et al., 2007; Pedersen et al., 2014) не исследовали влияние истощения Jmjd2c на способность к дифференцировке ESCs после формирования EB и клон специфичной индукции, которая устраняет дальнейшее сравнение.

Интересно, что эктопически экспрессируемый Jmjd2c в ESCs также приводит к подавлению дифференцировки в ответ на образование EB (data not shown). Эта находка вместе с тем, что Jmjd2c обчно подавляется во время этого процесса, подчеркивают важную роль этого белка на начало дифференцировки. Соотв. мы обнаружили, что Jmjd2c рекрутируется своевременно на клон-специфические энхансеры после понуждения ESC к дифференцировке. С помощью прямого сравнения Jmjd2c геномных ДНК-связывающих сайтов в 2i/LIF и serum/LIF, мы подтвердили, что Jmjd2c преимущественно соединяется с H3K4me3-бгатыми TSS регионами активных и ассоциированных с дифференцировкой генов в 2i/LIF. Поразительно, однако, что мы идентифицировали существенную фракцию serum/LIF-специфических Jmjd2c-связывающих сайтов, картируемых вне TSS регионов, перекрывающихся с H3K4me1/me2-богатыми энхансерными регионами в вблизи той же самой когорты генов мишеней. Хотя связывание Jmjd2c менее обильное на дистальных относительно TSS сайтах (Fig. S8 and Fig. S10), мы подтвердили, что Jmjd2c сходным образом рекрутируется, по крайней мере частично, на энхансеры и соотв. промоторы посредством Tudor доменов, скорее всего, путем распознавания H3K4me2/1 и H3K4me3, соотв. (Pedersen et al., 2014). Это согласуется с детекцией Jmjd2c в H3K4me3- и H3K4me1-coupled протеомных базах данных (Engelen et al., 2015). Принимая во внимание, что регуляторные регионы обеспечивают (nucleate) связывание многочисленных транскрипционных регуляторов и, ко-факторы содержащих, молекул, могут также вносить вклад в рекрутирование Jmjd2c посредством межбелковых взаимодействий на этих сайтах.

Удивительно, однако, Jmjd2c, как было установлено, обнаруживает сходную концентрацию на активных и pre-marked (poised) энхансерах в serum/LIF (Fig. 5), подтверждая, что Jmjd2c может действовать как молекулярная платформа для рекрутирования энхансерных составляющих. В частности, мы задались вопросом, действительно ли потеря Jmjd2c в ESCs может влиять на перераспределение Oct4 и p300 на вновь активированных (Fgf5) энхансерных сайтах после превращения ESC-в-EpiSC. Соединение Oct4, p300 и p300-обусловленное отложение H3K27ac, однако, сохранялись на Fgf5 в Jmjd2c-нокаутных cEpiSCs. Вместо этого мы установили, что Jmjd2c необходим для собственно связывания Med1 и Smc1a на активных (Fgf5) и poised энхансерах в эпибласт-подобных клетках (Fig. 6 and Fig. S12). Облегчающая роль Jmjd2c в сборке активированных энхансер-белок комплексов также было подтверждена способностью Jmjd2c физически взаимодействовать с G9a и Med1 в ESCs. Итак, эти находки подтверждают. что в отсутствие Jmjd2c, происходит неэффективная загрузка важных mediator-cohesin комплексов на клон-специфических энхансерах, нарушающая активацию скооперированных генов, что объясняет дефект дифференцировки, наблюдаемый в Jmjd2c-нокаутных клетках.

Принимая во внимание роль медиатора и когезина в соединении энхансеров и основных промоторов (Kagey et al., 2010), мы полагаем, что рекрутирование Jmjd2c на энхансеры может совпадать и/или вносить вклад в события петлеобразования ДНК перед активацией генов и спецификацией клонов (Fig. 7). В соответствии с этой моделью, мы установили, что Jmjd2c-связанные пики тесно согласуются с сайтами взаимодействия промотора с энхансером, как это обнаруживается по соседству с Foxa2 в ESCs (Fig. S13). Интересно, мы отметили, что стабильность всех Jmjd2c-связанных взаимодействий промотор-энхансер, наблюдаемых в геноме достоверно усиливается в serum/LIF по сравнению с 2i/LIF (CHiCAGO score analysis, P-value 2.446?10?12; O.J. and H.G.S., unpublished), это коррелирует с перераспределением Jmjd2c на poised энхансерах во время начала дифференцировки ESC. Однако, осталось неясным, действительно ли повышенное обнаружение Jmjd2c на энхансерах может быть причиной или результатом стабилизированных взаимодействий промотор-энхансер в serum/LIF.

Fig. 7. Proposed model: assembly of activating Jmjd2c-G9a centred enhancer-protein complexes. Jmjd2c and G9a co-occupy poised (lineage-specific) enhancers in primed ESCs where they stabilise the assembly of mediator-cohesin complexes (Kagey et al., 2010) that are necessary for the formation of DNA loops and for potent gene activation at the exit of pluripotency and upon differentiation.

Интригующей находкой является совместное рекрутирование H3K9-methyltransferase G9a на Jmjd2c-связанные дистальные пики в ESCs. В противовес канонической роли в замалчивание генов (Feldman et al., 2006; Mozzetta et al., 2014), наивысшие уровни совместного обогащения G9a неожиданно обнаруживались на ESC-специфических, Jmjd2c-связанных энхансерах, подтверждающие, что совместное обогащение G9a/Jmjd2c может совпадать с образованием активирующих комплексов. Более того, и подобно Oct4, p300, Med1 и Smc1a, G9a также присутствовал в клон-специфических, Jmjd2c-связанных энхансерах, хотя уровни в ESCs были редуцированы. В отсутствие Jmjd2c, связь с G9a дестабилизировалась, это демонстрировалось также в происходящих из ESC cEpiSCs вместе с Med1 и Smc1a. Интересно, что G9a , как было установлено, способен взаимодействовать с Jmjd2c, Med1 или CDYL, подтверждая. что G9a может формировать как активирующие, так и репрессирующие комплексы в ESCs (Fritsch et al., 2010). Это согласуется с предыдущими сообщениями, показавшими, что G9a рекрутируется совместно и взаимодействует или с ко-активатором Med1 или ко-репрессором Jarid1 взаимно исключающим способом на генах β-globin во время гематопоэза (Chaturvedi et al., 2012; Shankar et al., 2013). Удивительное и согласующееся с двойной ролью G9a в регуляции экспрессии генов, мы обнаружили, что Jmjd2c-G9a совместно связываемые мишени существенно обогащены среди дифференциально экспрессируемых генов в нокаутных по G9a ESCs (Mozzetta et al., 2014) и у E8.5 эмбрионов (Auclair et al., 2016), это четко подтверждает и усиление активности генов и подавление in vitro и in vivo (Fig. S14). Особенно гены, ассоциированные с онтогенетическими процессами, преимущественно подавляются у E8.5 эмбрионов в отсутствие G9a (Auclair et al., 2016; Mozzetta et al., 2014). Однако, механизмы, лежащие в основе действия G9a как репрессора и активатора в ESCs и др. клеточных контекстах (Chaturvedi et al., 2012; Shankar et al., 2013) остаются неизвестными.

Несмотря на глобальное увеличение уровней H3K9me2 в отсутствие Jmjd2c, мы не выявили какого-либо аберрантного приобретения H3K9 и метилирования ДНК Jmjd2c/G9a совместно связанных ассоциированных с клонами генов в Jmjd2c-нокаутных ESCs, в cEpiSCs или после клональной спецификации (Fig. 4; data not shown). Это говорит против роли Jmjd2c в постоянном удалении G9a-обусловленных отложений H3K9me2, подразумевая новые не зависимые от гистонов роли Jmjd2c и G9a в ткане-специфических энхансерах. Хотя точные молекулярные взаимодействия между двумя молекулами необходимо ещё полностью расшифровать, мы отметили, что авто-метилирование сайтов G9a закрепляет связывание репрессивных комплексов (Ruan et al., 2012), которые ранее были идентифицированы как потенциальные мишени для Jmjd2c-обеспечиваемого деметилирования (Ponnaluri et al., 2009). Осуществляемое деметилирование G9a с помощью Jmjd2c посредством его каталитического домена, действительно является предварительным условием для взаимодействия с активирующими комплексами, необходимо исследовать. Итак, дальнейшее выяснение того, как Jmjd2c и др. гистоновые деметилазы могут действовать в качестве ключевых пост-трансляционных регуляторов, чтобы способствовать сборке активирующих энхансер-белок комплексов, может предоставить важную информацию по регуляции активности энхансеров и экспрессии генов в стволовых клетках и в развитии.