Недавно была проведена генотерапия, которая продемонстрировала значительный прогресс в клинических испытаниях и обещает обеспечить эффективное лечение нескольких генетических и приобретенных заболеваний (Naldini, 2015). В основе этого успеха лежит разработка улучшенных векторов переноса генов (Kay, 2011; Mingozzi & High, 2011; Nathwani et al., 2014). Среди них лентивирусные векторы (LV) проявляются как универсальные транспортные средства с относительно большой емкостью для стабильной трансгенной интеграции в геноме клеток-мишеней. LV в настоящее время эксплуатируются как для генной терапии ex vivo, в которой клетки-мишени (такие как гемопоэтические стволовые клетки / клетки-предшественники, HSPC или Т-клетки) собираются у пациента, трансдуцируются, а затем повторно вводятся для in vivo генной терапии, в которых LV непосредственно вводят пациенту либо в кровоток, либо локально, например, в мозг (Palfi et al, 2014). В то время как несколько текущих клинических исследований подтверждают эффективность и безопасность лентивирусов для генной терапии ex vivo (Cartier et al, 2009; Cavazzana Calvoet al, 2010; Aiuti et al, 2013; Biffi et al, 2013; Maude et al, 2014) in vivo - направленная генотерапия с помощью лентивирусов остается более сложной. Действительно, частицы LV подвергаются сложной сборке с внешней оболочкой, происходящей от мембраны упаковочных клеток, поэтому содержат множество белков вместе с вирусными антигенами, которые могут действовать как иммунные триггеры при распознавании и фагоцитозе с помощью профессиональных антиген-представляющих клеток (APC; Annoniet al , 2013). Более того, текущее производство LV в основном зависит от временной трансфекции плазмиды, которая является интенсивной и плохо поддающейся масштабированию и стандартизации и приводит к значительному количеству примесей, включая остаточную плазмидную ДНК, что может еще более усугубить активацию APC. Кроме того, сообщаемая нестабильность глиопротеина вируса везикулярного стоматита гликопротеина G (VSV.G), псевдотипированные LV в человеческой сыворотке остается проблемой для in vivo - введения (DePolo et al, 2000; Croyle et al, 2004; Trobridge et al, 2010; Hwang & Schaffer, 2013). Ранее сообщалось, что при внутривенном введении LV позволяют стабильно переносить ген в печень при условии, что трансгенная экспрессия жестко нацелена на гепатоциты и показала терапевтическую эффективность дозы в мышиной и собачьей модели гемофилии В, нарушения коагуляции из-за мутаций в кодирующем гене фактора IX (FIX) (Brown et al, 2006; Matraiet al, 2011; Cantore et al, 2012, 2015). Несмотря на терапевтический потенциал, необходимо преодолеть некоторые препятствия, прежде чем рассматривать клинический перевод внутривенного введения LV, как, например, изготовление достаточно больших, непротиворечивых и высокоочищенных партий для доставки in vivo, устойчивого вектора в кровообращение и низкого риска острой токсичности и иммуногенности, вызванных компонентами частиц или загрязнителями. Здесь мы описываем индуцируемую масштабируемую компактную клеточную линию, которая поддерживает последовательную генерацию высокопроизводительных векторов LV, представляющих интерес, для целенаправленной интеграции. LV, продуцируемые этими клетками, достигают эквивалентных уровней переноса генов в печени и являются стабильными при концентрации и очистке как LV, продуцируемые обычной трансфекцией, но более устойчивы к инактивации в сыворотке крови человека и не содержат загрязнений плазмидной ДНК. Более того, путем дальнейшего редактирования генома клеток-продуцентов LV мы модифицировали белковый состав их плазматической мембраны и, в свою очередь, оболочку LV и получали новый LV с повышенной способностью избегать иммунного распознавания, которые лучше подходят для применения in vivo.

Здесь мы показали, что основные комплексы гистосовместимости класса I (MHC I), выделяемые продуцирующими клетками, оказываются на поверхности LV и вызывают аллогенные ответы Т-клеток. Разрушив же ген бета-2 микроглобулина в клетках-продуцентах, мы получили MHC-свободные LV с существенно уменьшенной иммуногенностью. Мы вводим этот целенаправленно отредактированный ген в новую стабильную линейную клеточную линию LV, несущую единичные компоненты, способные копировать индуцируемые векторы, которые могут быть воспроизводимо преобразованы в высокопродуктивные LV-продуценты на специфическую интеграцию интересующего генома LV. Эти LV эффективно переносят гены в соответствующие мишени и более устойчивы к опосредованной инактивации, опосредованной комплементами, из-за пониженного содержания гликопротеина вируса везикулярного стоматита по сравнению с векторами, полученными с помощью временной трансфекции. В целом, эти достижения поддерживают масштабируемое производство аллоантиген-свободных LV с более высокой чистотой и повышенной резистентностью к комплементам, которые лучше подходят для генной терапии in vivo.