Посещений: 
ИНИЦИАЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ ДНК
Молекулярные механизмы
From structure to mechanism—understanding initiation of DNA replication Alberto Riera, Marta Barbon, Yasunori Noguchi, L. Maximilian Reuter, Sarah Schneider and Christian Speck
 Genes & Dev. 2017. 31. 1073-1088
|
DNA replication results in the doubling of the genome prior to cell division. This process requires the assembly of 50 or more protein factors into a replication fork. Here, we review recent structural and biochemical insights that start to explain how specific proteins recognize DNA replication origins, load the replicative helicase on DNA, unwind DNA, synthesize new DNA strands, and reassemble chromatin. We focus on the minichromosome maintenance (MCM2-7) proteins, which form the core of the eukaryotic replication fork, as this complex undergoes major structural rearrangements in order to engage with DNA, regulate its DNA-unwinding activity, and maintain genome stability.
|
Инициация репликации ДНК - это многоступенчатая реакция, которая тщательно срежиссирована, чтобы помочь сборке репликативной вилки и регулировать запуск источников репликации (Costa et al. 2013; Riera et al. 2014; Tognetti et al. 2015; Bell and Labib 2016; Deegan and Diffley 2016; O'Donnell and Li 2016; Pellegrini and Costa 2016; Riera and Speck 2016; Bleichert et al. 2017). Более того, этот процесс тщательно контролируется, чтобы координировать синтез ДНК с клеточным циклом и энергетическим статусом клетки. КПП отслеживают путь и могут сдерживать синтез ДНК, чтобы преодолеть проблемы и защитить геном от повреждений (Alexander and Orr-Weaver 2016). Анализ in vivo идентифицировал большую часть ключевых игроков и большинство регуляторных принципов, но многие критические механизмы всё ещё остаются неизвестными. Недавняя реконструкция репликации ДНК у дрожжей с использованием очищенных белков открыла новые шансы детального механистического и структурного анализа инициации репликации ДНК и синтеза ДНК (Yeeles et al. 2015, 2017; Devbhandari et al. 2017).
Initiation of DNA replication
Геномные сайты, где инициируется репликация ДНК известны как источники репликации ДНК (DNA replication origins) (Marahrens and Stillman 1992; Hyrien 2016). У почкующихся дрожжей источники репликации имеют законсервированные последовательности ДНК и всегда содержат сайт связывания для комплекса распознающего источник origin recognition complex (ORC) (Fig. 1A; Bell and Stillman 1992). Этот комплекс состоит из 6 субъединиц и организован в C-образную форму, при этом ДНК вставляется в центральный расщеп, делая возможным множественные контакты белков с ДНК (Lee and Bell 1997; Speck et al. 2005; Sun et al. 2012; Yuan et al. 2017). Во время поздней M фазы клеточного цикла, Cdc6 соединяется с комплексом ORC/origin DNA и начинается процесс регулируемой сборки белков, достигающий свой кульминации в образовании репликационной вилки в S фазе (Fig. 1B; Donovan et al. 1997; Rowles and Blow 1997; Weinreich et al. 1999). Комплекс ORC/Cdc6 содержит 4 АТФ-связывающих белка: Cdc6, Orc1, Orc4 и Orc5. Связывание АТФ белками Orc1 и Cdc6 необходимо для формирования комплекса ORC/Cdc6/DNA (Weinreich et al. 1999; Gillespie et al. 2001; Klemm and Bell 2001; Speck et al. 2005; Randell et al. 2006; Speck and Stillman 2007). Важно, что этот комплекс ORC/Cdc6 важен для рекрутирования гептамера Cdt1/minichromosome maintenance 2-7 (MCM2-7) и загрузки MCM2-7 на двунитчатую ДНК (dsDNA) (Fig. 1C). MCM2-7 является стержнем репликативной ДНК геликазы и состоит из 6 субъединиц, которые имеют спиральное расположение с разрывом в месте Mcm2/5 (Costa et al. 2011; Ticau et al. 2017; Zhai et al. 2017). Во время загрузки геликазы, ORC, Cdc6 и Cdt1 вставляют ДНК посредством входа Mcm2/Mcm5 в комплекс и кольцо MCM2-7 замыкается частично вокруг dsDNA (Sun et al. 2013; Samel et al. 2014; Zhai et al. 2017). Критически важно, что процесс рекрутирования MCM2-7 зависит от взаимодействия Mcm6-Cdt1, которое облегчает аутоингибирующую активность Mcm6 C окончания (Fernandez-Cid et al. 2013). После формирования комплекса ORC/Cdc6/Cdt1/MCM2-7 (OCCM) гидролиз АТФ приводит к последовательному высвобождению Cdc6 и Cdt1 и формированию промежуточного образования ORC/MCM2-7 (OM) (Fernandez-Cid et al. 2013; Coster et al. 2014; Kang et al. 2014;Ticau et al. 2015). Интересно, что высвобождение Cdt1 связано со структурными изменениями, т.к. это способствует закрытию MCM2-7 кольца (Ticau et al. 2017). Вследствие рекрутирования второго Cdc6 формируется комплекс ORC/Cdc6/MCM2-7 (OCM) (Fig. 1D; Fernandez-Cid et al. 2013; Ticau et al. 2015, 2017). В противоположность OCCM и OM, комплекс OCM компетентен быстро рекрутировать второй MCM2-7 гексамер, который также появляется Cdt1-зависимым образом (Evrin et al. 2013, 2014; Fernandez-Cid et al. 2013; Sun et al. 2014; Ticau et al. 2015), возникающий в результате голова-к-голове MCM2-7 double hexamer (DH) заключает в кольцо dsDNA (Fig. 1E; Evrin et al. 2009; Remus et al. 2009; Gambus et al. 2011). Образование DH запускает высвобождение Cdc6, сопровождаемое одновременно высвобождением ORC и Cdt1 и закрытием второго MCM2-7 кольца вокруг ДНК, приводящее к возникновению high-salt-stable комплекса (Evrin et al. 2009; Remus et al. 2009; Ticau et al. 2015,2017). Загрузка DH завершается также как образование prereplication complex (pre-RC) или DNA licensing. Крупный MCM2-7 DH лишен гидролиза АТФ (Sun et al. 2014) и активности по раскручиванию ДНК (Evrin et al. 2009; Remus et al. 2009), но может скользить по dsDNA независимым от гидролиза АТФ способом (Evrin et al. 2009; Remus et al. 2009) , чтобы сместить DHs в регионы, не содержащие источника (Gros et al. 2015).
Figure 1.
Активация MCM2-7 DH, завершаемая образованием preinitiation complex (pre-IC), очень сложный процесс и интенсивно исследовался на почкующихся дрожжах. Он зависит от Dbf4-depedent kinase (DDK) Cdc7 и специфичной для S-фазы cyclin-dependent kinase (CDK) и большого количества активирующих факторов, включая Sld3, Cdc45, Sld2, Dpb11, GINS (от Japanese go-ichi-ni-san, означающего 5-1-2-3, после 4-х родственных субъединиц комплекса: Sld5, Psf1, Psf2 и Psf3), полимеразу ε и Mcm10 (Fig. 1F; Heller et al. 2011; Yeeles et al. 2015). Во время S фазы, MCM2-7 DHs оказывается эффективно фосфорилированным с помощью DDK (Sheu and Stillman 2006, 2010; Francis et al. 2009; Sun et al. 2014), это в свою очередь делает возможным рекрутирование Sld3/Sld7 и Cdc45 на источник репликации (Bruck et al. 2015; Herrera et al. 2015; Deegan et al. 2016; Fang et al. 2016). Более того, CDK фосфорилирует важные мишени, Sld2 и Sld3, что затем позволяет этим двум фосфо-белкам взаимодействовать с Dpb11 (Tanaka et al. 2007; Zegerman and Diffley 2007). Sld2, Dpb11, GINS и полимераза ε формируют плохо упакованный комплекс в клетке (Muramatsu et al. 2010) и соединяют с Cdc45/Sld3/MCM2-7. В результате Sld2, Sld3 и Dpb11 высвобождаются, формируя в результате Cdc45/MCM2-7/GINS (CMG) комплекс (Kanemaki and Labib 2006; Heller et al. 2011; Yeeles et al. 2015). Интересно, что Mcm10 соединение с CMG связано со структурными изменениями в CMG, что делает комплекс стабильным к высоким концентрациям солей (Looke et al. 2017) и способствует запуску (firing) источника (Kanke et al. 2012; van Deursen et al. 2012; Watase et al. 2012; Yeeles et al. 2015). Полностью собранный CMG комплекс оказывается высоко активным с помощью АТФ-гидролиза-управляемого раскручивания 3'-5' ДНК, и образует центр эукариотической репликационной вилки ДНК (Fig. 1G; Moyer et al. 2006; Ilves et al. 2010).
Важно, что во время активации геликазы MCM2-7 DH начинает экстенсивно перестраиваться: Cdc45 и GINS соединяются с MCM2-7; комплекс подразделяется на два индивидуальных гексамера, потенциально использующие Mcm10 (Quan et al. 2015); одна нить ДНК становится вытесненной из каждого гексамера; и в результате этого в двух CMG комплексах оказываются замкнутыми ssDNA (Costa et al. 2014; Georgescu et al. 2017). Важно, что механизмы, ведущие к этой реорганизации MCM2-7 во время инициации репликации ДНК в основном неизвестны. ДНК полимеразы, как известно, ассоциируют с CMG частично посредством Ctf4, чтобы сформировать ансамбль, связанный с раскручиванием ДНК и синтезом ДНК (Fig. 1G; Gambus et al. 2006; Simon et al. 2014; O'Donnell and Li 2016). Первоначальный запуск синтеза ДНК осуществляется с помощью ДНК полимеразы α, тогда как синтез ведущей и ведомой нити ДНК осуществляется в основном посредством polymerase ε (Pursell et al. 2007; Burgers et al. 2016) и polymerase δ (Nick McElhinny et al. 2008), соотв. Однако, существует некоторая пластичность, при этом polymerase δ также играет роль во время синтеза ведущей нити ДНК, особенно во время инициации репликации ДНК и в условиях репликативного стресса в почкующихся дрожжах (Pavlov et al. 2001; Devbhandari et al. 2017; Yeeles et al. 2017) и после зависимой от гомологичной рекомбинации повторного старта вилки у Schizosaccharomyces pombe (Miyabe et al. 2015). Mcm10 действует также во время элонгации, т.к. он перемещается с реплисомой (Ricke and Bielinsky 2004; Gambus et al. 2006; Pacek et al. 2006), а т.к. специфическая мутация на его C конце дает укороченный продукт репликации, не затрагивая источника инициации (origin firing) (Looke et al. 2017).
Синтез ДНК инициируется с сотен-тысяч источников репликации в крупных геномах эукариот (Cvetic and Walter 2005; Mechali 2010). В каждом источнике один или более MCM2-7 DHs загружаются, но только минимальное их число трансформируется в активные CMGs во время S фазы; при этом остающиеся MCM2-7 DHs служат в качестве "дремлющих источников," которые активируются только, если проксимальная часть репликационной вилки оказывается окончательно арестованной (Woodward et al. 2006; Ibarra et al. 2008).
Structural insights into key steps of DNA replication
В последние несколько лет наблюдается быстрый прогресс в структурной биологии, частично обусловленный революцией в крио-электроной микроскопии (cryo-EM) (Kuhlbrandt 2014; Egelman 2016), и это привело к важной информации по репликации ДНК. Кристаллография и cryo-EM предоставили почти атомное разрешение структур из некоторых крупных белковых комплексов, включая Drosophila melanogaster и Homo sapiens ORC (Bleichert et al. 2015; Tocilj et al. 2017); Saccharomyces cerevisiae MCM2-7 и MCM2-7/Cdt1 (Zhai et al. 2017), OCCM комплекса (Yuan et al. 2017) и MCM2-7 DH (Li et al. 2015); S. cerevisiae и D. melanogaster CMG (Abid Ali et al. 2016; Yuan et al. 2016; Georgescu et al. 2017); S. cerevisiae Ctf4 тример (Simon et al. 2014), polymerase ε (Hogg et al. 2014), и polymerase δ (Swan et al. 2009); и H. sapiens Mcm2-H3/H4 (Huang et al. 2015; Richet et al. 2015).
Origin recognition Сиквенс-специфическое распознавание источников репликации ДНК с помощью S. cerevisiae ORC составило биохимическую основу для открытия этого важного фактора репликации ДНК в 1992 (Bell and Stillman 1992), сейчас почти полностью реконструирована репликация ДНК у почкующихся дрожжей (Yeeles et al. 2015, 2017; Devbhandari et al. 2017). Состоящий из 6 субъединиц Orc1-6 комплекс прекрасно законсервирован от дрожжей до человека и эта гомология распространяется даже на archaea, где Orc мономеры или димеры участвуют в распознавании источников (Li and Stillman 2012). Orc1-5, но не Orc6, имеют консервативную белковую структуру, состоящую из одного N-терминального AAA+ домена и одного C-терминального winged helix domain (WHD) (Fig. 2A; Bleichert et al. 2015; Tocilj et al. 2017; Yuan et al. 2017). Структурный анализ показал, что H. sapiens Orc6 обладает гомологией с транскрипционным фактором TFIIB (Liu et al. 2011).
Figure 2.
S. cerevisiae ORC распознает специфические последовательности ДНК внутри источников репликации (Bell and Stillman 1992; Rao and Stillman 1995; Rowley et al. 1995; Dueber et al. 2007, 2011; Gaudier et al. 2007), в то время как структура ДНК и специфичные для ДНК модификации хроматина, по-видимому, более важны для спецификации источников у многоклеточных (Remus et al. 2004; Eaton et al. 2011; Beck et al. 2012; Kuo et al. 2012; Cayrou et al. 2015). Интересно, что Cdc6 также состоит из N-терминального AAA+ домена и C-терминального WHD, непосредственно соединяется с ORC, и усиливает сродство и специфичность последовательностей ORC почкующихся дрожжей (Speck et al. 2005; Speck and Stillman 2007).
Однако, структурная основа распознавания источников у эукариот была неизвестна длительное время. Первоначально кристалические структуры archaeal ORC/DNA комплексов показали, что как β-hairpin wing, так и helix-turn-helix (HTH) мотив, принадлежащие домену WHD, глубоко внедрены в борозды ДНК источников. Кроме того, initiator-specific motif (ISM) внутри домена AAA+ контактирует с ДНК (Fig. 2A; Dueber et al. 2007; Gaudier et al. 2007). Как ISM, так и WHD вызывают изгибание ДНК, тогда как ISM играет также роль в распознавании последовательности ДНК (Dueber et al. 2007, 2011; Gaudier et al. 2007). Недавно первая высокого разрешения cryo-EM структура ДНК, связанной с ORC/Cdc6 в комплекс с Cdt1/MCM2-7, показала. что S. cerevisiae Orc1-5 опоясывает ДНК (Yuan et al. 2017). При этом C-образная структура Orc1-5 белков располагается в последовательности Orc1-Orc4-Orc5-Orc3-Orc2, а Cdc6 заполняет пробел между Orc1 и Orc2, это согласуется с ранее установленной структурой высокого разрешения S. cerevisiae ORC/Cdc6 (Chen et al. 2008) и D. melanogaster кристаллической структурой ORC (Fig. 2B; Bleichert et al. 2013). В такой конформации ДНК осуществляет множественные контакты с ORC/Cdc6 и топологически захватывается кольце-образным комплексом (Speck et al. 2005; Bleichert et al. 2015). Хотя Orc6 недостаточно изучен, консервативная C-терминальная α спираль, как было установлено, взаимодействует с Orc3 (Fig. 2B). Удивительно, эта спираль Orc6 мутантная при синдроме Meier-Gorlin. В самом деле, эта болезнь приводит к изначальной карликовости у людей, которая вызывается также мутациями в Orc1, Orc4, Cdt1 и Cdc6 (Bicknell et al. 2011; Tocilj et al. 2017). Соответственно в случае Orc6, мутация приводит к дефектному взаимодействию с Orc3, которое в свою очередь уменьшает загрузку MCM2-7 у Drosophila (Bleichert et al. 2013).
В структуре OCCM домены AAA+ и WHDs в Orc1-5/Cdc6 формируют центральный канал. В этом контексте, Orc2, Orc4 и Cdc6 осуществляют непосредственные контакты с ДНК, тогда как Orc1, Orc3 и Orc5 не касаются ДНК (Fig. 2B; Yuan et al. 2017). В белке Orc2 только ISM из домена AAA+ взаимодействует с ДНК, контактируя главным образом с фосфатным остовом (Fig. 2C). По сравнению с большинством др. видов, у почкующихся дрожжей Orc4 содержит α-спиральную вставку, которая непосредственно используется для взаимодействия с ДНК. В отличие от др. Orc/Cdc6 белков, Orc4, по-видимому, ответственен за сиквенс-специфические взаимодействия с ДНК в OCCM, т.к. он уникальным образом осуществляет контакты со специфическими основаниями в большой борозде ДНК (Fig. 2D; Yuan et al. 2017). Однако, функциональное значение этих взаимодействий всё ещё остается неразрешенным. Более того, сайт-специфическое связывание ДНК с S. pombe ORC также определяется с помощью той же самой субъединицы Orc (Chuang and Kelly 1999; Kong and DePamphilis 2001). Здесь множественные AT-hook домены на N конце S. pombe Orc4 используются для соединения с последовательностями источника репликации, подчеркивая, что белок Orc4 является наиболее важным модулем для сиквенс-специфического распознавания ДНК у дрожжей. Напротив, у D. melanogaster Orc4 и у H. sapiens Orc4 лишены вставки α-спирали и AT-hook доменов. Интересно, что источники репликации у многоклеточных не обладают общей последовательностью ДНК (Cayrou et al. 2015; Hyrien 2015). Однако, H. sapiens Orc1 обнаруживает сродство к G-quadruplex ssDNA (Hoshina et al. 2013), и действует как мотив позиционирования источника (Valton et al. 2014), тогда как топология ДНК, как было установлено, является важным детерминантом для взаимодействий у Drosophila ORC-DNA (Remus et al. 2004). Более того, эпигенетические модификации, в особенности диметилирование и триметилирование H4K20, способствуют рекрутированию на хроматин H. sapiens ORC посредством Orc1 домена bromo-adjacent homology (BAH) и лицензирования ДНК (Beck et al. 2012; Kuo et al. 2012).
Помимо S. cerevisiae, Cdc6 играет также роль в связывании ДНК в OCCM (Yuan et al. 2017), при этом его ISM и WHD осуществляют выдающиеся контакты с фосфатным остовом (Fig. 2A,C). В отличие от archaeal ORC/Cdc6, у S. cerevisiae Cdc6 использует только WHD β-hairpin wing, чтобы контактировать с ДНК. По существу, S. cerevisiae Cdc6 вносит вклад в связывание ДНК на двух уровнях: S. cerevisiae Cdc6 взаимодействие с S. cerevisiae ORC залавливает ДНК в центральный канал и, кроме того, его две поврехности для связывания нуклеиновых кислот контактируют непосредственно с ДНК, предоставляя структурное объяснение, почему у S. cerevisiae Cdc6 обнаруживает повышенное сродство к S. cerevisiae ORC для ДНК (Mizushima et al. 2000). Однако, как зависимая от АТФ-азы регуляция сиквенс-специфичности Cdc6 работает (Speck and Stillman 2007) всё ещё неизвестно. Кристаллическая структура у D. melanogaster стержня ORC показывает, что у D. melanogaster Orc3-4-5 имеет конфигурацию, сходную с таковой у S. cerevisiae и H. sapiens Orc3-4-5, но вся структура принимает автоматически подавляемую конформацию, которая несовместима со связыванием ДНК с Cdc6 (Bleichert et al. 2015; Tocilj et al. 2017; Yuan et al. 2017). Сравнение D. melanogaster ORC структуры со структурой S. cerevisiae ORC показало, что D. melanogaster Orc1 AAA+ домен и D. melanogaster Orc2 WHD покрывают центральный канал ORC для прохождения ДНК (Fig. 2E; Bleichert et al. 2015; Yuan et al. 2017). Т.о., конформационные изменения этих регионов д. быть существенны для взаимодействия с ДНК и необходимы также для Cdc6 контакта с Orc1 и Orc2 у дрозофилы. Соединение Orc1, Orc4 и Orc5 с АТФ и соединение АТФ с Orc1, важное для образования комплекса ORC/Cdc6/DNA (Weinreich et al. 1999; Gillespie et al. 2001;Klemm and Bell 2001; Speck et al. 2005; Randell et al. 2006; Speck and Stillman 2007), это, по-видимому, делает возможным то, что взаимодействие с АТФ может приводить к сильным конформационным изменениям в D. melanogaster Orc1 AAA+ домене и в D. melanogaster Orc2 WHD.
Итак, недавняя структурная информация выявила снижение специфичности последовательностей ДНК в ходе эволюции. Archaeal ORC/Cdc6 белки образуют множественные сиквенс-специфические контакты с ДНК , а у S. cerevisiae Orc/Cdc6 белки осуществляют их меньше, в основном с фосфатным остовом, и некоторые специфичные для оснований контакты с ДНК , тогда как H. sapiens ORC лишен мотивов сиквенс-специфического распознавания ДНК, обнаруживаемых у дрожжей. Структурная основа специфичного для топологии распознавания ДНК в D. melanogaster ORC и G-quadruplex-специфического связывания ssDNA в ORC H. sapiens всё ещё непонятна и нуждается в дальнейшей информации по определению источников репликации у многоклеточных.
General organization of MCM
Белки MCM2-7 очень консервативны от дрожжей до человека, в то время как у archaea, существуют очень схожие гомологи, которые собираются в гомо-гексамерные комплексы. 6 отличающихся субъединиц, которые образуют MCM2-7, доминируют за счет своей состоящей из двух частей доменовой структуры
(Fig. 3A-C): (1) N-терминальный взаимодействующий с белком и ДНК-связывающий домен и (2) сильно законсервированный C-терминальный AAA+ АТФазный моторный домен (Fig. 3A,B; Costa and Onesti 2009). Два домена образуют форму, с характерным силуэтом гантели субъединиц Mcm, генерируя двойную кольцевую структуру в контексте MCM2-7 гексамера (Fig. 3B,D).
Figure 3.
N-терминальный домен (NTD) может быть грубо подразделен на два субдомена. (1) α спирали в регуляторном субдомене A образуют компактный пучок вне геликазного кольца. Этот домен, как полагают, регулирует активность MCM геликазы и функционирует как переключатель конформации у archaea (Slaymaker and Chen 2012; Miller and Enemark 2015). Его роль у эукариот менее ясна. (2) Второй субдомен обладает олигонуклеотиды связывающей (OB) складкой. Эта складка участвует в создании контактов с ssDNA, как это наблюдается в случае Pyrococcus furious MCM, с потенциальной ролью в инициальном разворачивании ДНК во время активации DH (Froelich et al. 2014). Кроме того, этот домен также вносит вклад посредством гидрофобных взаимодействий в олигомеризацию MCM2-7 в характерную гексамерную структуру (Bochman and Schwacha 2009). OB-складка прерывается с помощью ДНК-связывающей N-terminal hairpin (NtHp) и цинкового пальчика (ZF). Одной из главных функций ZFs является образование интерфейса DH, это придает чрезвычайную устойчивость к солям комплекса (Li et al. 2015; Zhai et al. 2017). N-терминальные расширения (NTEs) (Fig. 3C) отличают эукариотические Mcms от их аналогов у archae. Крупные NTEs в Mcm2, Mcm4 и Mcm6 в основном неупорядочены и регулируют как инициацию, так и прогресс репликационной вилки DDK-зависимым способом (Sheu and Stillman 2006, 2010; Randell et al. 2010; Sheu et al. 2014, 2016), тогда как Mcm2 NTE также является важным для связанной с репликацией сборки хроматина (Huang et al. 2015; Richet et al. 2015).
C-терминальный домен (CTD) белков Mcm содержит мотор геликазы, обладающий несколькими ключевыми свойствами: АТФ-связывающий мотив Walker A (WA) и мотив гидролиза АТФ Walker B (WB) и аргининовый пальчик (RF), при этом последний располагается на каждой из взаимодействующих сторон между субъединицами. Кроме того, CTD вносит вклад в связывание ДНК, используя связанный с ДНК presensor-1 (PS1) и helix 2 insertion (H2i) β-hairpin петли, которые выпячиваются во внутрь канала. Более того, большинство Mcm белков, включая позади АТФазного домена C-терминальное расширение (CTEs) (Fig. 3C), которое состоит из WHDs и дополнительных последовательностей, представляющих мотивы белковых взаимодействий с разными функциями во время репликации ДНК (Li et al. 2015; Abid Ali et al. 2016; Yuan et al. 2016, 2017).
MCM2-7 conformations in the OCCM, DH, and CMG reveal MCM2-7 ring-opening mechanisms
Хотя MCM2-7 является сутью репликационной вилки, этот комплекс неспособен раскручивать или даже ассоциировать с собственно dsDNA. Вместо этого MCM2-7 нуждается в разных наборах ко-факторов, чтобы осуществлять каждую из этих реакций (Takeda et al. 2005; Evrin et al. 2009; Remus et al. 2009; Fernandez-Cid et al. 2013; Frigola et al. 2013). В самом деле, MCM2-7, как известно, формирует комплексы с разными факторами на разных ст. инициации репликации ДНК и синтеза ДНК (Fig. 1). Три из комплексов, представляющих важные стадии репликации ДНК, были структурно охарактеризованы с помощью cryo-EM с высоким разрешением: OCCM, MCM2-7 DH и CMG (Fig. 4A-C; Costa et al. 2011, 2014; Sun et al. 2013,2014; Li et al. 2015; Yuan et al. 2016, 2017; Georgescu et al. 2017). Интересно, что конформации субъединиц Mcm отличаются в этих трех комплексах, отражая разные функциональные состояния. Чтобы сделать заметными эти различия мы осуществили структурное выравнивание CTDs из каждой Mcm субъединицы трех комплексов. Здесь мы представили преимущество самой нормальной конформации Mcm наблюдаемой в 6 субъединицах в MCM2-7 DH. Т.о., DH служит в качестве уникальной точки отсчета (Fig. 4D; labeled with a green dot), чтобы понять альтернативные конформации Mcm, присутствующие в OCCM и CMG. Этот анализ показал, что в OCCM, все MCM2-7 NTDs являются лево-закрученными в разной степени, тогда как в CMG, половина гексамера имеет лево-закрученные NTDs (Mcm2/3/5), а др. половина имеет право-закрученные NTDs (Mcm4/6/7).
Figure 4. Комплекс OCCM представлен сильно преходящими промежуточными образованиями перед формированием с помощью АТФ-гидролиза управляемого MCM2-7 DH (Fig. 4A). В OCCM, геликаза ассоциирована со своим загрузчиком на ДНК (ORC/Cdc6), а dsDNA уже находится внутри центрального канала MCM2-7, хотя место проникновения ДНК между Mcm2 и Mcm5 , обращенными др. к др. всё ещё частично открыто (Sun et al. 2013; Yuan et al. 2017). Поскольку в MCM2-7/Cdt1 предшественнике 6 белков Mcm расположены в виде спиральной структуры, то в OCCM комплексе они расположены в плоскости, как в MCM2-7 DH и CMG (Yuan et al. 2017; Zhai et al. 2017). Важно, что Cdt1, который обязателен для ассоциации в ORC/Cdc6 и MCM2-7, взаимодействует как со стержневой геликазой, так и с загрузчиком ДНК (Chen et al. 2007; Fernandez-Cid et al. 2013; Sun et al. 2013; Ticau et al. 2015; Yuan et al. 2017). Удивительно, в OCCM субъединицы Mcm обнаруживают очень отличающуюся конформацию по сравнению с DH или CMG. Здесь, Mcm2 NTD драматически закручен влево и выступает в соседние субъединицы Mcm6 и Mcm4 в меньшей степени закручены влево Mcm3, Mcm5 и Mcm7 (Fig. 4D). Это, скорее всего, обусловлено присутствием Cdt1 и сетью взаимодействий между WHDs из MCM2-7 и ORC/Cdc6 (Yuan et al. 2017). Значительная конформация позволяет Cdt1 осуществлять множественные контакты с MCM2-7. Его N-терминальный регион связан с Mcm2 NTD, непосредственно соприкасаясь с закрученным доменом Mcm2. Длинные петли соединяют Cdt1 N-терминальный регион с его C-терминальным регионом. Этот C-терминальный регион сам по себе взаимодействует с Mcm6, а также с Mcm4 NTD. Следовательно, Cdt1 обнимает половину гексамера (Mcm2, Mcm4 и Mcm6). Интересно, что большинство из этих Cdt1-MCM2-7 взаимодействий наблюдается также в случае Cdt1-MCM2-7 комплекса, за исключением высоко консервативного взаимодействия Cdt1-Mcm6 CTD (Wei et al. 2010; Liu et al. 2012; Fernandez-Cid et al. 2013; Yuan et al. 2017; Zhai et al. 2017), подтверждая, что эти взаимодействия выполняют важную роль в формировании OCCM и могут вносить вклад в структурные изменения в Mcm NTDs (Fig. 4D). Было предположено, что Cdt1 действует, чтобы стабилизировать Mcm2, Mcm4 и Mcm6, потенциально позволяя движения др. половины (Mcm5, Mcm3 и Mcm7) (Yuan et al. 2017). В саом деле, высвобождение Cdt1 из OCCM связано с замыканием кольца MCM2-7 (Ticau et al. 2017). Итак, эти данные подтверждают концепцию, что Cdt1 важна для ремоделирования MCM2-7 и закрытия скрученного Cdt1/MCM2-7 кольца во время формирования OCCM, но необходимы прямые доказательства.
MCM2-7 DH представляет собой очень стабильное промежуточное образование при репликации ДНК. В этом комплексе Mcm2/5 проход прочно закрыт и никакой активности по разворачиванию ДНК не может быть обнаружено до тех пор, пока DH не окажется активированным во время G1/S перехода. В самом деле, два гексамера MCM2-7 оказываются сложенными посредством NTDs за счет взаимодействия в основном их ZFs. Эти сильные взаимодействия стабилизируют два гексамера и препятствуют открытию кольца MCM2-7 (Sun et al. 2014). Более того, в этой голова-к-голове конфигурации способы взаимодействия каждого из 6 ZFs полностью отличаются, вызывая видимый наклон и закручивание двух гексамеров комплекса (Remus et al. 2009; Sun et al. 2014; Li et al. 2015). Хотя функциональное значение несовершенной укладки двух гексамеров неизвестно, оно может играть роль в процесса активации геликазы (Li et al. 2015). Интересно, что внутри DH, индивидуальные субъединицы Mcm скручены между NTD и CTD колец (Sun et al. 2014; Li et al. 2015). Фактически NTDs всех 6 субъединиц обнаруживают правостороннюю закрученность в разной степени, если сравнивать с конформацией в OCCM (Fig. 4D). Такое закручивание может представлять собой дополнительный механизм запечатывания слабого Mcm2/5 интерфейса (Samel et al. 2014;Sun et al. 2014). Более того, расстояния между соседними CTDs разные, при этом три сильно (Mcm4/7, Mcm7/3 и Mcm5/2) и три слабо (Mcm6/4, Mcm3/5 и Mcm2/6) упакованные пары (Li et al. 2015). Опять же функциональное значение неизвестно, но возможно, что слабо упакованные субъединицы могут участвовать в открытии MCM2-7 кольца во время активации геликазы.
Наконец, CMG является активной формой репликативной геликазы (Fig. 4C). Этот комплекс представлен центром репликативной вилки и активно раскручивает dsDNA, открывая одиночные нити ДНК для полимераз и делая возможной их репликацию (Langston et al. 2014). В этой конфигурации ведущая нить проходит через MCM2-7 кольцо в 3'-5' направлении, тогда как ведомая нить исключается из него и проходит между Mcm2 и Mcm5, запечатывая их с помощью сильных взаимодействий с GINS и Cdc45 (Costa et al. 2011; Georgescu et al. 2017). Когда MCM2-7 DH превращается в CMG, то NTDs реорганизуются (Fig. 4D). При этом NTDs половины кольца MCM2-7 (Mcm3, Mcm5 и Mcm2) закручиваются влево, тогда как NTDs в др. половине (Mcm6, Mcm4 и Mcm7) закручены вправо (Fig. 4D). Этот процесс использует ряд сложных перестроек в трех пространственных измерениях и мы полагаем, что эти структурные изменения изменяют конфигурацию центрального канала геликазы, чтобы позволить ей взаимодействовать с ssDNA.
MCM2-7 ATP hydrolysis activities of the OCCM, DH, and CMG
MCM2-7 использует связывание и гидролиз АТФ, чтобы разворачивать dsDNA во время репликации ДНК. Гидролиз АТФ является скоординированным процессом и нуждается в гексамерном кольце, чтобы находиться в закрытой циркулярной конформации (Schwacha and Bell 2001). Сайты активных АТФаз располагаются внутри интерфейсов димеров Mcm и сформированы из законсервированных мотивов соседних субъединиц; т. е. остатки обоих фланкирующих промоторов координируют связывание и гидролиз АТФ (Davey et al. 2003). Межсубъединичная природа активных сайтов АТФаз делает возможными кооперативные взаимодействия, которые могут передаваться посредством MCM2-7 кольца. В самом деле, включение одиночного АТФазного мутанта в MCM2-7 кольца может приводить к заметному снижению активности гидролиза АТФ во всем комплексе (Schwacha and Bell 2001; Davey et al. 2003; Ilves et al. 2010). Однако, некоторые субъединицы, такие как Mcm4, Mcm5 и Mcm7, по-видимому, вносят больший вклад в общий гидролиз АТФ в MCM2-7, чем др., т.к. мутации в их WB мотивах вызывают более сильные дефекты гидролиза АТФ (Bochman et al. 2008; Bochman and Schwacha 2010; Bell and Botchan 2013). Многие др. кольцеобразные гексамерные моторы обнаруживают высокую кооперацию между активными сайтами и последовательной организацией гидролиза АТФ (гидролиз АТФ в одной субъединице по времени соответствует порядку в кольце) (Abrahams et al. 1994; Liao et al. 2005; Adelman et al. 2006; Thomsen and Berger 2008; Eckert et al. 2012), но не для всех из них. Напр., изучение гексамерного белка unfoldase ClpX показало, что гидролиз АТФ в гексамере вероятностный. В ClpX гидролиз АТФ в каждой данной субъединице зависит от нуклеотида, связывающего соседнюю субъединицу, от структурных ограничений и взаимодействий с субстратом, но не полагается на межсубъединичное общение (Martin et al. 2005). Т.о., гидролиз АТФ в ClpX не происходит в регулярной последовательности в 6 субъединицах, но тонко контролируется их специфической функцией в раскручивании белков. В контексте MCM2-7, данные подтверждают кооперативную модель гидролиза АТФ. Однако, следует ли MCM2-7-зависимое раскручивание ДНК в репликативной вилке чисто в порятке последовательного гидролиза АТФ, неясно.
MCM2-7 гидролиз АТФ во время загрузки геликазы был проанализирован in vitro с реконструированием реакций с использованием ряда мутантов связывания АТФ и гидролиза АТФ и с помощью ограниченного количества прямых методов гидролиза АТФ (Fernandez-Cid et al. 2013;Coster et al. 2014; Kang et al. 2014). Благодаря cryo-EM структурам и данным fluorescence resonance energy transfer (FRET) мы знаем, что MCM2-7 спираль трансформируется в почти замкнутое плоскостное кольцо во время формирования OCCM, которое затем становится замкнутым во время образования OCM (Ticau et al. 2017; Yuan et al. 2017;Zhai et al. 2017). Важно учесть, что трансформация спирали в кольцо вносит напряжение в комплекс, это позволяет комплексу MCM2-7 при серьезных растяжениях однажды достичь стадии OCCM/OM/OCM stages. Соотв., мутации, затрагивающие геометрию межсубъединичного интерфейса, могут блокировать закрытие кольца, это в свою очередь может повлиять на (1) зависимое от гидролиза АТФ высвобождение Cdt1 , (2) заключение ДНК в MCM2-7 кольцо или (3) способность комплекса устанавливать правильно интерфейс hexamer-hexamer. Интересно, что MCM2-7 мутанты связывания АТФ, как известно, нарушают стабильность комплекса в присутствии низкой концентрации соли и повышенной температуры и обнаруживают сильные дефекты в переходе OCCM-к-DH (Coster et al. 2014; Kang et al. 2014). Мы полагаем, что лежащие в основе дефекты формирования pre-RC у Mcm ATP-binding мутантов, обусловлены снижением стабильности комплекса, особенно во время перехода от спирали к кольцу.
Более того, субъединицы Mcm взаимосвязанные с помощью RF мутантов, которые влияют как на стабильность комплекса, так и гидролиз (Coster et al. 2014). Два исследования показали, что мутации законсервированного Mcm аргинина влияют на загрузку геликазы, особенно, если затрагивают Mcm5 и Mcm6, но также и в Mcm2, Mcm3 и Mcm7 (Coster et al. 2014; Kang et al. 2014). Более того, мутации аргинина в Mcm2 и Mcm5 специфически влияют на высвобождение Cdt1. Т.к. высвобождение Cdt1 является характерным признаком pre-RC гидролиза АТФ, то было предположено, что MCM2-7 гидролиз АТФ является существенным для формирования pre-RC. Интересно, что разные исследования показали, что RF мутации в Mcm3 не оказывают влияния на величину гидролиза АТФ во время формирования pre-RC (Fernandez-Cid et al. 2013). Прямые измереня гидролиза АТФ у Mcm2 и Mcm5 RF мутантов всё ещё невозможны; поэтому пока не совсем ясно, действительно ли эти мутации затрагивают только Mcm гидролиз АТФ (Coster et al. 2014; Kang et al. 2014) или могут затрагивать геометрию между субъединиц, а значит косвенно нарушать закрытие Mcm2-7 кольца и/или высвобождение Cdt1.
Cryo-EM анализ OCCM предоставил дальнейшую информацию о роли MCM2-7 связывания и гидролиза АТФ во время загрузки геликазы. Здесь было показано, что АТФ является интерфейсом Mcm3/7, Mcm7/4, Mcm4/6 и Mcm6/2, где он возможно помогает стабилизировать взаимодействия между субъединицами. Не было обнаружено нуклеотидов на интерфейсах Mcm3/5 или Mcm5/2, что согласуется с наблюдениями, что интерфейс Mcm5/2 разомкнут (Yuan et al. 2017). Принимая во внимание кооперативную модель гидролиза АТФ в MCM2-7, данные д. предполагать, что АТФазная активность в MCM2-7 блокирована или сильно снижена в OCCM (Fig. 4E). Однако, Orc1 и Cdc6 связаны с АТФ внутри OCCM и, по-видимому, готовы к гидролизу АТФ (Fig. 4F;Yuan et al. 2017). В самом деле, Cdc6 строго участвует в зависимом от гидролиза АТФ удалении неудачных промежуточных образований загрузки геликазы. Хотя механизм удаления пока не идентифицирован, активность Cdc6 АТФазы, как известно, индуцируется во время образования pre-RC (Fernandez-Cid et al. 2013), и Cdc6 АТФазные мутанты затрагивают высвобождение Mcm3 (Coster et al. 2014) у MCM2-7 мутантов связывания и гидролиза АТФ, которые вызывают формирование дефектных pre-RC (Coster et al. 2014;Kang et al. 2014), и нарушают загрузку MCM2-7 с помощью Orc1-5 (отсутствует Orc6) (Coster et al. 2014).
Роль Orc1гидролиза АТФ во время формирования pre-RC более сложная. S. cerevisiae Orc4 RF мутант (Orc4R), который блокирует ORC АТФ гидролиз (Bowers et al. 2004; Fernandez-Cid et al. 2013), не обнаруживает влияния на гидролиз АТФ во время формирования pre-RC (Fernandez-Cid et al. 2013) или на формирование MCM2-7 DH (Fernandez-Cid et al. 2013; Coster et al. 2014; Kang et al. 2014) но является летальным in vivo и делает возможным лишь один раунд загрузки геликазы (Bowers et al. 2004). Более того, Orc1 WB мутант (ORC-d1), который обладает дефектом связывания и гидролиза АТФ (Klemm and Bell 2001), был проанализирован в условиях насыщающих концентраций АТФ, чтобы протестировать роль Orc1 АТФ гидролиза во время формирования pre-RC. Было установлено, что этот мутант снижает загрузку геликазы, высвобождение Cdt1 и зависимый от pre-RC гидролиз АТФ (Fernandez-Cid et al. 2013), подтверждая, что Orc1 АТФ гидролиз действует независимым от ORC4R способом во время формирования pre-RC. Итак, роль гидролиза АТФ во время формирования pre-RC сложная, т.к. ни один из тщательно изученных мутантов не вызывает тот же самый тип ареста в формировании комплекса, как это наблюдалось со слабо гидролизуемым АТФ, аналогом ATPγS.
Как утверждалось выше загрузка множественных DHs на многие источники репликации является способом хранить большие количества неактивных репликативных геликаз, прежде чем будет происходить синтез ДНК (Alver et al. 2014). В соответствии с этим DH являются очень стабильными даже в присутствии высоких концентраций солей. Cryo-EM анализ показал, что АТФ может быть обнаружен во всех интерфейсах между Mcm субъединицами (Fig. 4E; Li et al. 2015). Однако, сильно измененная конформация MCM2-7 субъединиц приводит к структурным изменениям в критических мотивах гидролиза АТФ, в особенности RFs, локализованных на интерфейсах между субъединицами. Соотв., DH обнаруживают наличие минимальной активности АТФаз (Sun et al. 2014). самом деле, блокирование MCM2-7 АТФ гидролиза представляет собой мощный механизм ограничения активности MCM2-7 геликазы в G1 профазе, перед её активацией в S фазе (Sun et al. 2015).
Недавно был достигнут прогресс в понимании организации вилки (Abid Ali et al. 2016; Yuan et al. 2016; Georgescu et al. 2017). Самые первые cryo-EM структуры S. cerevisiae CMG в комплексе с ДНК вилки позволили Georgescu et al. (2017) предложить новую модель архитектуры реплисом, создавая улучшенную основу для понимания синтеза ДНК. Было установлено, что в S. cerevisiae CMG, NTD находится на ведущем крае разворачивания ДНК (Georgescu et al. 2017). противоположность предыдущей модели было предположено, что CTD находится на фронте, это базируется на FRET экспериментах с archaeal Mcm на ДНК вилки и на cryo-EM структуре D. melanogaster CMG в комплексе с ssDNA (McGeoch et al. 2005; Costa et al. 2014). Новая модель с NTD вблизи вилки имеет смысл, поскольку она помещает полимеразы ведущей и ведомой нитей в правильное место для синтеза ДНК, но необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить эти данные и полностью понять путь ДНК через репликативную вилку (Sun et al. 2015; Miller and Costa 2017). Чтобы раскрутить ДНК, необходимо, чтобы ssDNA активно перемещалась по центральному каналу в CMG в процессе, который нуждается в гидролизе АТФ (Moyer et al. 2006). Неожиданно, у S. cerevisiae, CMG АТФ связывание было выявлено только в трех из 6 интерфейсов Mcm; а именно, Mcm3/5, Mcm5/2 и Mcm2/6 (Fig. 4E). Два из них (Mcm3/5 и Mcm5/2) соответствуют интерфейсам, которые наиболее важны для активности геликазы, как установлено при анализе влияния АТФазных мутаций в контексте D. melanogaster CMG (Ilves et al. 2010). Следовательно, эти исследования предполагают разный вклад субъединиц Mcm в отношении гидролиза АТФ и активности геликазы из CMG, при этом Mcm3, Mcm5 и Mcm2 оказываются ключевыми игроками. Это указывает на то, что MCM2-7 АТФ гидролиз не следует rotary модели, как наблюдается в E1 геликазе или F1 АТФазе (Enemark and Joshua-Tor 2008; Junge and Nelson 2015), но может иметь субстрат-специфичную активность, сходную с таковой в ClpX (Stinson et al. 2015).
Evolutionary conservation of the MCM helicase DNA channel
Mcms гидролизуют АТФ, чтобы транслоцироваться на ДНК, при этом 6 субъединиц формируют строго позитивно заряженный ДНК канал (Kumar and Remus 2016). Все белки Mcm законсервированы в ходе эволюции и очень сходны по своей трехмерной структуре, особенно по ключевым остаткам, которые необходимы для связывания или транслокации ДНК через центральный канал (see Fig. 5A). Совмещение опубликованных структур Mcms из archaea ( Sulfolobus solfataricus) и эукариот ( S. cerevisiae) подчеркнуло их структурное сходство (Brewster et al. 2008; Yuan et al. 2016). Это особенно верно в регионах, таких как N-терминальные ZF, PS1 петля, H2i петля и NtHp (Fig. 5A), которые важны для связывания ДНК и разворачивания dsDNA. В самом деле, archaeal Mcm мутанты, которые лишены мотивов или PS1 петли, или H2i петли всё ещё оказываются компетентными связывать ДНК, но лишены способности разворачивать dsDNA (McGeoch and Bell 2005; Jenkinson and Chong 2006). Хотя может возникнуть гибкость в этих петлях и структурах, но общая структура и позиция в геликазе прекрасно сохраняются (Fig. 5A), подтверждая универсальный способ связывания и путь ДНК. Более того, структура archaeal Mcm PS1 петлди сходна с соотв. петлями, обнаруженными в вирусных геликазах, таких как E1 или SV40 T-антиген, намекая на универсальный механизм раскручивания ДНК (Li et al. 2003; Abbate et al. 2004).
Figure 5.
Models for ORC-dependent MCM loading
Критические взаимодействия MCM2-7 ДНК происходят во время ORC-зависимой загрузки геликазы, генерируя критические топологические связи между ДНК и геликазой. Предыдущие исследования наблюдали MCM2-7 в разных конформациях: S. cerevisiae MCM2-7 гексамер был описан как замкнутое кольцо, как это наблюдалось в низкого разрешения негативно окрашенных выборках (Bochman and Schwacha 2007; Samel et al. 2014), это было также верно для их archaeal и бактериальных гомологов (Enemark and Joshua-Tor 2008; Miller et al. 2014). С др. стороны, гексамеры от Drosophila и microsporidian паразита Encephalitozoon cuniculi , как было установлено, принимают спиральную форму или конформацию открытого кольца (Costa et al. 2011; Lyubimov et al. 2012). Однако, недавнее исследование показало, что S. cerevisiae MCM2-7 образует левозакрученную спиральную форму со разрывом в 10-15 ангстрем между Mcm2 и Mcm5, который слишком узок для проникновения ДНК (Zhai et al. 2017). Кроме того, было установлено, что центральный канал MCM2-7 частично закупорен с помощью CTEs из Mcm5 и Mcm6. Этот полуоткрытый комплекс стабилизируется с помощью связывания Cdt1 с N-терминальными регионами Mcm2, Mcm4 и Mcm6 (Zhai et al. 2017). Т.к. MCM2-7 в этой конформации не позволяет проникать ДНК, то это указывает на то, что инициальный контакт Cdt1/MCM2-7 с ORC/Cdc6 необходим, чтобы расширить Mcm2/5 проход и позволить проникнуть ДНК. В контексте OCCM, кольцо MCM2-7 остается частично открытым (Sun et al. 2013; Yuan et al. 2017). Запечатывание прохода Mcm2/5 нуждается в гидролизе АТФ и удалении Cdt1 (Ticau et al. 2017), но необходимые структурные перестройки всё ещё неизвестны. Хорошо бы установить молекулярные механизмы, позволяющие контролировать открытие MCM2-7 кольца, проникновение ДНК и закрытие кольца.
A ssDNA path through the budding yeast MCM DNA channel
Как уже обсуждалось, наиболее очевидный путь ДНК через S. cerevisiae CMG комплекс наблюдался с использованием искусственного субстрата для ДНК вилки (Georgescu et al. 2017). При этом S. cerevisiae MCM2-7 геликаза перемещается в соответствии с полярностью 3'-5' c N-терминальными звеньями впереди C-терминальных звеньев (Rothenberg et al. 2007; Costa et al. 2014; Sun et al. 2015; Georgescu et al. 2017). Эти данные позволяют нам понять, как ДНК проходит через CMG (Fig. 5B): dsDNA вступает в N-терминальные звенья геликазы и находится в размотанном состоянии. Исследователи полагают, что ведомая нить покидает геликазу, сложенную сэндвичем между ZFs и NtHps на N-терминальной поверхности MCM2-7, где полимераза α может непосредственно запускать синтез отстающей нити (Georgescu et al. 2017).
После разделения нитей ведущая нить затем проходит через позитивно заряженный центральный канал, где она взаимодействует с PS1 петлей или H2i петлей из Mcm2/3/5/6 и принимает право-закрученную спиральную форму B-DNA , прежде чем подвергнуться воздействию полимеразы ε для синтеза ведущей нити (Georgescu et al. 2017). Интересно, что более ранние структурные исследования на archaea позволили предположить, что ssDNA соединяется в плоскости кольца скорее, чем перпендикулярно ему (Froelich et al. 2014). Было бы интересно исследовать, действительно ли новые структурные данные по CMG комплексу с искусственной репликативной вилкой (Georgescu et al. 2017) будут подтверждены с помощью дополнительных биохимических исследований или данными in vivo, чтобы подтвердить направление транслокации ДНК в CMG. Более того, дополнительные структуры из промежуточных образований репликативной вилки должные захватываться в комплекс с ДНК, что пока остается неуловимым, но важно для полного понимания прохождения dsDNA и ssDNA через CMG.
MCM and DNA channel flexibility during DNA replication
Если сравнить структуры, которые отображают разные состояния MCM2-7 при инициации репликации ДНК в порядке их появления (OCCM -> DH -> CMG) (Fig. 5C), то отмечаются некоторые отличия. Несмотря на в целом неповрежденные структуры двухярусной MCM2-7 геликазы, все же происходят внутренние перестройки. В OCCM, после загрузки первой MCM2-, ДНК наклоняется ~25° в интерфейсе ORC-MCM2-7 гексамера, это может отражать механизм вставки ДНК (Yuan et al. 2017). Загрузка второго гексамера и диссоциация ORC приводят к формированию MCM2-7 DH, в котором гексамеры наклонены на 14°, это может иметь значение для инициального разворачивания ДНК (Li et al. 2015). Наконец, диссоциация DH и ассоциация Cdc45 и GINS с MCM2-7 кольцами приводят к сборке CMG. После активации этот комплекс непрерывно разворачивает dsDNA , чтобы подготовить её для репликации. Благодаря этому нить из dsDNA наклоняется опять на ~28° к правой вертикальной оси (Georgescu et al. 2017). Этот загиб необходим для эффективного разворачивания довольно ригидной dsDNA. Назначенная быть ведомой нить, как полагают, покидает CMG на поверхности интерфейса Mcm3/Mcm5 (Georgescu et al. 2017).
Protein interactions remodel MCM2-7 during different stages of DNA replication initiation
В отличие от бактерий эукариоты координируют свой синтез ДНК с клеточным циклом и организуют свои реплисомы вокруг репликативной геликазы (Stillman 2005). Очевидно, что MCM2-7 белки существенно боле развиты по сравнению со своими прокариотическими предшественниками и приобретают дополнительные регуляторные и функциональные свойства. Межбелковые взаимодействия являются сутью этой новой функциональности.
Two centers of the MCM2-7 interactome: the C-terminal and N-terminal protein-binding hubs
C-terminal interactions
Cryo-EM структуры комплекса OCCM (Sun et al. 2013; Yuan et al. 2017) и биохимические эксперименты (Fernandez-Cid et al. 2013; Frigola et al. 2013) показали важную роль Mcm C окончаний в формировании pre-RC (Fig. 6A). В самом деле, Cdt1, важный для связывания MCM2-7 с хроматином (Maiorano et al. 2000; Nishitani et al. 2000), взаимодействует с Mcm6 C окончанием (Jee et al. 2010; Wei et al. 2010). Анализ Nuclear magnetic resonance (NMR) белков человека и почкующихся дрожжей идентифицировал структуру этой важной поверхности взаимодействия, подчеркнув значение Mcm6 WHD для связывания Cdt1 (Wei et al. 2010; Liu et al. 2012). Мутации законсервированных аминокислот в этом домене затрагивают клетки двумя способами, блокируя импорт в ядро MCM2-7 и синтез ДНК (Liu et al. 2012). Анализ in vitro показал, что Mcm6 WHD принимает аутоингибирующую конформацию, которая блокирует связывание MCM2-7 с ORC/Cdc6 (Fernandez-Cid et al. 2013). Структурная основа аутоингибиции Mcm6 WHD обнаружена недавно (Yuan et al. 2017; Zhai et al. 2017). В отсутствие Cdt1, взаимодействие ORC/Cdc6 с MCM2-7 блокируется благодаря столкновению между Orc4 и Mcm6 WHD. Cdt1 преодолевает этот блок путем реорганизации Mcm6 WHD, что предотвращает стерическое столкновение и делает возможным крепкие взаимодействия ORC/Cdc6 с Cdt1/MCM2-7. Др. исследования сообщают, что консервативный C конец S. cerevisiae Mcm3 также важен для инициального привлечения Cdt1/MCM2-7 к ORC/Cdc6 (Frigola et al. 2013; Sun et al. 2013). Более того, в том же исследовании наблюдалось, что Mcm3 взаимодействует непосредственно с Cdc6 и что Mcm3 C конец вызывает ORC/Cdc6 АТФ гидролиз с целью контроля качества сборки комплекса. Наконец, Mcm3 C-терминальный регион также содержит WHD, взаимодействующий с Cdc6 и Orc2, но функция этого взаимодействия неищвестна (Yuan et al. 2017).
Figure 6. В S. cerevisiae Mcm2, в отличие от др. субъединиц, отсутствует CTE (Fig. 3C). Интересно, что Mcm2 у высших эукариот содержит C-терминальный WHD. Более того, эти эукариоты обладают также geminin, критическим ингибитором образования pre-RC (Lee et al. 2004). Интересно, что N-терминальная часть H. sapiens Cdt1 взаимодействует с geminin; благодаря этой близости, geminin оказывается расположенным так, чтобы взаимодействовать с Mcm2 CTE. Мы полагаем, что Mcm2 WHD может эволюционировать одновременно, т.к. дополнительная точка закрепления geminin и таким образом может блокировать образование pre-RC путем вмешательства непосредственно во взаимодействия Cdt1-MCM2-7.
Внутри MCM2-7/Cdt1-ORC/Cdc6 интерфейса (Yuan et al. 2017), два комплекса закреплены вместе, используя гибкие связи. Эти соединения собираются из Mcm CTEs и содержат гибкие линкеры и Mcm WHD, который запирает ORC/Cdc6. Кроме того, CTDs из Mcm2, Mcm6 и Mcm4 соединены непосредственно с WHDs из Orc5, Orc4 и Orc1, соотв., сцепляя одну половину комплекса более сильно с ORC/Cdc6, тогда как др. половина остается более мобильной. Хотя функциональное значение этих взаимодействий не до конца ясно, они обеспечиваю гибкость, важную для процесса загрузки ДНК (Yuan et al. 2017).
В противоположность OCCM, Mcm CTEs, по-видимому, наиболее гибкие в MCM2-7 DH (Li et al. 2015). Однако, в CMG, CTEs из Mcm4, Mcm5 и Mcm6 более ригидные. Две CMG cryo-EM структуры - Apo формы и варианта, связанного с вилкой ДНК - подчеркивают. что CTEs могут принимать разные конформации. Без ДНК, CTEs из Mcm5 и Mcm6 частично закупоривают ДНК канал, но в контексте репликативной вилки, они меняют свою позицию, позволяя проходить ssDNA через геликазу, при этом Mcm4 CTE касается самой ДНК, подтверждая сложный механизм ощущения ДНК (Georgescu et al. 2017). Кроме того, Mcm6 CTE осуществляет контакты с Mcm10, но это не существенно для рекрутирования Mcm10 или инициации репликации ДНК (Fig. 6B; Douglas and Diffley 2016). На C-терминальной стороне CMG выталкивает ssDNA из центрального канала. Недавно было установлено, что полимераза ε располагается в этой позиции, контактируя с CTDs из Mcm2 и Mcm6, располагаясь идеально, чтобы осуществлять синтез на ведущей нити ДНК (Fig. 6B; Sun et al. 2015). Итак, MCM2-7 C-терминальная сторона выполняет главную роль в загрузке MCM2-7, активации геликазы и в синтезе с ведущей нити ДНК (Fig. 6C).
N-terminal interactions
Во время образования MCM2-7 DH N-терминальные стороны двух гексаморов связаны др. с др., приводя к образованию высоко стабильного комплекса. Внутри этого комплекса длинные NTEs из Mcm2, Mcm4 и Mcm6, скорее всего, принимают очень гибкую конформацию, т.к. они недостаточно хорошо различимы в cryo-EM структуре (Li et al. 2015). Как только клетка вступает в S фазу, DDK фосфорилирует MCM2-7 DH (Sun et al. 2014), чтобы способствовать образованию CMG и сборке репликативной вилки. В частности, Mcm2, Mcm4 и Mcm6 NTEs являются главными сайтами DDK фосфорилирования и служат как сайты связывания для Sld3 (Fig. 6B; Sheu and Stillman 2006; 2010; Randell et al. 2010; Bruck and Kaplan 2015; Herrera et al. 2015; Deegan et al. 2016; Fang et al. 2016). В CMG cryo-EM структурах NTEs единственные плохо различимые, что снова указывает на гибкость конформации (Yuan et al. 2016; Georgescu et al. 2017). Однако, после взаимодействия со специфическим партнерами, эти гибкие NTEs, скорее всего, принимают специфическую структуру. В случае Mcm2, секция NTE кристаллизуется совместно с H3/H4 димером и предположительно указывает на определенную структуру, окружающую гистоны. В соответствии с этим было предположено, что Mcm2 NTE играет важную роль в рециклинге нуклеосом (Huang et al. 2015; Richet et al. 2015). Внутри CMG, NTDs удерживаются в стабильной кольцевой конформации за счет множественных взаимодействий с Cdc45 и GINS. При этом Cdc45 взаимодействует с NTDs из Mcm2 и Mcm5 (Costa et al. 2011; Abid Ali et al. 2016; Simon et al. 2016). Cdc45 также тесно взаимодействует с 4 белками, которые составляют комплекс GINS, который, в свою очередь, соединяется с NTDs из Mcm3 и Mcm5. Эта широкая система взаимодействий между GINS, Cdc45, Mcm2, Mcm3 и Mcm5, как полагают, служит в качестве механизма удерживания прохода Mcm2/5 в закрытом состоянии (Fig. 6B; Costa et al. 2011). Сходным образом, Cdt1 может контактировать с Mcm2, Mcm6 и Mcm4, благодаря своей широкой конформации (Fig. 6A). эта альтернативная сеть взаимодействий, вызываемая Cdt1, как было предположено выполняет разные функции, потенциально удерживая открытым или закрытым проход Mcm2/5 во время образования OCCM (Ticau et al. 2017; Yuan et al. 2017; Zhai et al. 2017). Интересно, что хотя Cdc45 и Cdt1 соединяются с Mcm2 NTD, они контактируют взаимно исключающие с поверхностью Mcm2, при этом Cdc45 соединяется с проксимальной частью Mcm5, тогда как Cdt1 контактирует с проксимальной частью Mcm6. Следовательно, два белка могут влиять на Mcm2 альтернативными способами, при этом Cdc45 закрывает проход, чтобы поддержать активность геликазы, а Cdt1 позволяет открываться и закрываться проходу во время загрузки MCM2-7. Более того, Mcm10 может влиять на эти поверхности, также как и контактировать с Mcm2 NTD (Apger et al. 2010; Lee et al. 2010; Looke et al. 2017), чтобы стабилизировать комплекс CMG (Looke et al. 2017). При сборке in vitro репликативной вилки, ssDNA выходит с N-терминальной стороны MCM2-7 во время разворачивания ДНК (Georgescu et al. 2017). Эта ssDNA прекрасно расположена, чтобы служить в качестве матрицы для синтеза с отстающей нити ДНК. В самом деле, ДНК полимераза α/primase и Ctf4 располагаются совместно на N-терминальной стороне MCM2-7 в ЭМ исследовании с низким разрешением негативной линии (Fig. 3B; Sun et al. 2015). Ctf4 является гомотримером, который действует как ступица (hub) для белковых взаимодействий, связывая несколько факторов, участвующих в синтеза ДНК, ремоделировании хроматина, стабильности rDNA, рекомбинации ДНК и слипания сестринских хроматид с CMG (Simon et al. 2014; Villa et al. 2016), тогда как полимераза α запускает синтез ДНК ещё до вытягивания с помощью processive ДНК полимераз (Zhang and O'Donnell 2016). Эти недавние структурные находки начинают формировать картину процесса сборки реплисом эукариот как целое; а именно, N-терминальная сторона MCM2-7 выполняет главную роль в организации и стабильности DH, активации геликазы, контролируемого открытия и закрытия прохода Mcm2/5 и синтеза отстающей нити ДНК
(Fig. 6C).
Outlook
Structural biology has provided major biological insights into replisome assembly and function from the architectural point of view and also by providing detailed mechanistic insights. In the future, these data will stimulate the design of sophisticated biochemical and single-molecule experiments, facilitating the measurement of novel activities and revealing specific mechanisms and their dynamics. The replisome consists of 50 or more factors and many more associated factors; the integration of these into a structural and functional network will be an exciting task for the years to come. Translating this knowledge into the context of disease has already started (for example, in the case of Meier-Gorlin syndrome), but thousands of mutations, as observed in the context of cancer, have not yet been analyzed. Importantly, the structural and mechanistic insight into DNA replication initiation will help the development of novel inhibitors, which are aimed to block DNA replication before it even starts (Shreeram et al. 2002; Blow and Gillespie 2008). However, as the focus of drug development is considerably directed toward enzymes, it may still take some years before major progress is achieved.
|