Посещений: 
ОРИЕНТАЦИЯ МИТОТИЧЕСКОГО ВЕРЕТЕНА
Генетический контроль
Spindle orientation: a question of complex positioning. Bergstralh DT, Dawney NS, St Johnston D  | Development (2017) 144, 1137-1145 DOI: 10.1242/dev.140764
| |
|
Первый элемент - Mud у дрозофилы, NuMA (nuclear mitotic apparatus) у позвоночных; второй это Pins у дрозофилы, у C. elegans GPR1/2 (G-protein regulators 1 and 2) или у позвоночных LGN (leucine-glycine-asparagine); третий - это у Drosophila и позвоночных Gαi, который имеет два резервных ортолога у C. elegans, наз. GOA-1 и GPA-16 (Table 1). Вместе эти белки, как полагают, обеспечивают безопасность комплексу, состоящему из dynein/dynactin мотора в кортексе клеток и тем самым обеспечивающим локализацию сил, натягивающих астральные микротрубочки. Модель, описывающая их взаимодействие рассмотрена di Pietro et al., 2016. Вкратце, Gαi, который прикрепляется к плазматической мембране, закрепляет на ней Pins/LGN путем соединения с их C-концами (Du and Macara, 2004; Gotta and Ahringer, 2001; Kaushik et al., 2003; Nipper et al., 2007; Schaefer et al., 2000; Yu et al., 2003). Tetricopeptide repeats (TPRs) на др. конце Pins/LGN соединяются с Mud/NuMA, которые сами по себе соединяются с dynein (Bowman et al., 2006; Du et al., 2001; Izumi et al., 2006; Pecreaux et al., 2006; Siller et al., 2005; Yu et al., 2000). Важность этого аппарата подчеркивается исследованиями, связанными с нарушениями их регуляции, в частности в связи с возникновением раковых фенотипов. В самом деле, потеря ориентации веретена в ЦНС ассоциирует с гиперплазией, как у мух, так и кур (de Belle and Heisenberg, 1996; Morin et al., 2007; Yu et al., 2006). В крыловых имагинальных дисках дрозофилы baculoviral анти-апоптический белок в неправильно расположенных эпителиальных клетках способствует опухоле-образному избыточному росту (Guilgur et al., 2012; Nakajima et al., 2013).
Здесь мы обсудим ключевые аспекты канонический аппарат ориентации веретена и его функцию. Астральные микротубулярные плюс концы имеют важное значение для ориентации веретена. Недавнее исследование идентифицировало два белка - small kinetochore associated protein (SKAP) и Astrin - на астральных микротубулярных плюс концах (Kern et al., 2016). SKAP и Astrin формируют комплекс, который, как известно, играет роль в кинетохорах, которые обеспечивают связь между микротрубочками веретена и хромосомами (Dunsch et al., 2011; Schmidt et al., 2010). Локализация их астральных микротрубочек предопределяется, по-видимому, непосредственно c помощью SKAP, который содержит мотив end-binding protein 1 (EB-1), который необходим для локализации плюс концов (Kern et al., 2016). Интересно, что в одиночных клетках HeLa, мутации в EB-1-связывающем мотиве (дающие SKAPΔ EB-1) неправильное расположение веретена (Kern et al., 2016). Этот эффект вызывается не укорочением астральных микротрубочек; в отличие от нарушений самого EB-1, делеция SKAP EB-1 мотива не затрагивает длину астральных микротрубочек (Kern et al., 2016; Toyoshima and Nishida, 2007). Др. возможным объяснением неправильного расположения веретена, а именно того, что плюс кончики, несущие факторы ориентации веретена в кортекс, исключаются обнаружением, что кортикальный dynein всё ещё обнаруживается в SKAP ΔEB-1 клетках (Kern et al., 2016). Однако, необходимо учитывать дополнительную возможность, что комплекс Astrin/SKAP обеспечивает взаимодействие астральных микротрубочек с кортикальным аппаратом, подобно роли, выполняемой комплексом в кинетохорах. Эта модель подтверждается недавними доказательствами, что Astrin выступает в качестве партнера по связыванию белка стержневого аппарата NuMA, хотя это исследование было сконцентрировано на основном теле веретена (Chu et al., 2016). Функциональное значение ассоциации между плюс концами астральных микротрубочек и стержневым аппаратом пока ещё неясно но может быть связано с механизмом генерации сил. Изолированный регион NuMA (наз. NuMA-TIP) обнаруживает активность по связыванию кончиков микротрубочек, которая сохраняется даже во время деполимеризации микротрубочек (Seldin et al., 2016). Сродство NuMA-TIP с кончиками микротрубочек увеличивается при незначительных повреждениях, но снижается при стабилизации микротрубочек, указывая, что ээто связано преимущественно с усадкой (shrinking) микротрубочек (Seldin et al., 2016). В дополнение к обеспечиваемому dynein раскачиванию (reeling), натяжение может также вызываться посредством регуляции динамики микротрубочек.
in vitro предоставило доказательства принципа такого механизма и продемонстрировало, что он может обеспечиваться dynein (Laan et al., 2012). В комбинации с результатами, описанными выше, эти находки предоставляют возможность, что аппарат ориентации веретена регулирует сокращение (shrinkage) скорее, чем натяжение. Необходим дополнительный функциональный анализ для подтверждения этого мнения.
Fig. 1. Asymmetric and symmetric cell division. Directed cell division influences cell and tissue development. This is illustrated using examples from Drosophila melanogaster. The neuroblast (left) uses a cell-intrinsic mechanism for asymmetric cell division (ACD), relying on spindle orientation for unequal distribution of cell fate factors (orange). In the male germline stem cell (centre), ACD is cell-extrinsic, using directed division to ensure that, when germline stem cells divide, only one daughter cell remains in proximity to the somatic hub cells (light green) that comprise the niche, while the other daughter cell differentiates into a gonialblast. By contrast, cell division in the follicular epithelium (right) is symmetric. Cells in this tissue divide to simply expand the monolayer. Green, microtubules; red, spindle poles; blue, DNA.
The cycling of core machinery components
Хотя список факторов, участвующих в ориентации веретена постоянно расширяется, давно поставленные вопросы всё ещё остаются: как аппарат ориентации веретена ограничивается специфическими регионами кортекса? Исторически эта проблема прежде всего была рассмотрена в связи с сигналами, базирующимися на кортикальной полярности. Однако работы, предпринятые на изолированных культивируемых клетках, которые обычно были лишены этих сигналов и на нейробластах Drosophila выявили роль, выполняемую митотическим аппаратом (касательно веретена и хромосом) по регуляции аппарата ориентации веретена (Kiyomitsu and Cheeseman, 2012; Siegrist and Doe, 2005). Такая активность означает, что веретено может влиять на свое собственное положение в клетке (в одиночных клетках эта позиция определяется обычно относительно центра клетки скорее, чем вдоль оси полярности). Близость аппарата, ориентирующего веретено, относительно митотического аппарата уменьшает кортикальное натяжение, приводя к биполярному балансу сил. Это сопровождается передачей сигналов от хромосом и/или полюсов веретена, что редуцирует кортикальную локализацию и активность аппарата ориентации веретена, когда аппарат находится вблизи и/или хромосомы располагаются неправильно (Kiyomitsu and Cheeseman, 2012; Tame et al., 2016). Механизм динамической кортикальной локализации аппарата ориентации веретена в таких клетках может быть прояснен c помощью доказательства, что LGN и Gαi не приклеены к мембране во время митозов, а скорее циклически перемещаются взад и вперед между кортексом и полюсами веретена (Zheng et al., 2013). Их переход из кортекса к полюсам базируется на dynein и астральных микротрубочках (Zheng et al., 2013). Это указывает на то, что dynein не только действует, чтобы обеспечивать тянущие силы для ориентации веретена, но и также транспортирует Gαi-связанный LGN в качестве груза. Повторная доставка в кортекс также, по-видимому, нуждается в астральных микротрубочках, хотя механизм транспорта неизвестен (Tame et al., 2014; Zheng et al., 2013). Возможная регуляторная ступень для такого перемещения выявлена в работе с клетками человека, показавшей, что NuMA регулируется c помощью митотической киназы by Aurora A, которая фосфорилирует NuMA непосредственно по Ser1969 и тем самым способствует его перемещению от полюсов веретена к коретексу (Gallini et al., 2016; Kettenbach et al., 2011; Toughiri et al., 2013). Однако, две линии доказательств подтверждают, что этот механизм может быть не важным у животных помимо млекопитающих. Во-первых, S1969 остаток не обязательно законсервирован. Во-вторых, нокдаун гомолога Aurora A AIR-1 способствует скорее, чем уменьшает кортикальное натяжение микротрубочек у C. elegans (Kotak et al., 2016). Это противоположно тому, что ожидалось, если предполагать, что AIR-1-обеспечиваемое фосфорилирование белка стержневого аппарата LIN-5 заставляет его перемещаться от полюсов веретена к кортексу. Фосфорилирование LIN-5 по др. остаткам является критическим для его функции по обеспечению ориентации веретена. Напр., CDK1 фосфорилирует LIN-5 по его N-концу, чтобы обеспечить взаимодействие с dynein (Portegijs et al., 2016), тогда как последующее фосфорилирование на C-конце c помощью glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) и casein kinase 1 (CK-1) вызывает ассоциацию с GPR1/2 (Portegijs et al., 2016). Др. фосфорилирование C-конца c помощью aPKC гомолога PKC-3, оказывает ингибирующий эффект на кортикальное натяжение (Galli et al., 2011). Как и в случае AIR-1, некоторые из этих регуляторных модификаций могут быть не законсервированы помимо червей. В самом деле, хотя CDK1 фосфорилирует NuMA на C-конце в клетках позвоночных, эта ступень, как полагают, не затрагивает взаимодействие с dynein. Скорее всего, фосфорилирование действует как временное переключение активности; в анафазе, дефосфорилирование позволяет NuMA соединяться с мембраной непосредственно, где он ассоциирует с dynein, чтобы закрепить полюса веретена на противоположных сторонах, когда клетка удлиняется и делится (Kiyomitsu and Cheeseman, 2013; Kotak et al., 2013; Seldin et al., 2013; Zheng et al., 2014).
У Drosophila киназа Warts, как известно, фосфорилирует Mud, чтобы способствовать ассоциации с Pins (Dewey et al., 2015). Роли GSK-3 и CK-1 в регуляции Mud/NuMA пока не установлена, но некоторые исследования подтверждают роль aPKC в регуляции ориентации веретена. У рыбок данио в нейроэпителии сетчатки morpholino-обусловленное нарушение aPKCλ/ζ вызывает неправильную ориентацию делений (Cui et al., 2007; Strzyz et al., 2015). Это преимущественно обусловлено влиянием на веретено, хотя нарушения ориентации веретена не измерялись непосредственно в этой системе. Единственная возможность рассматривать, что aPKC не регулирует NuMA в этой ткани, а скорее LGN. В подтверждение этому, aPKC в клетках кист MDCK, как полагают, регулирует ориентацию веретена c помощью фосфорилирования LGN по законсервированному сериновому остатку (401 у млекопитающих, 436 у Drosophila), и тем самым исключает его из апикального кортекса (Hao et al., 2010). Однако роль aPKC в ориентации веретена не является универсальной, поскольку нарушение aPKC в клетках нейроэпителия кур, в фолликулярном эпителии у Drosophila follicular и в имаганальных крыловых дисках Drosophila не влияет на ориентацию веретена (Bergstralh et al., 2016, 2013; Peyre et al., 2011).
Fig. 2. A model for spindle orientation. (A) The canonical machinery comprising Mud/NuMA (blue), Pins/LGN (dark green) and Gαi (yellow) links the membrane with dynein (light green), which pulls spindles into alignment by 'walking' towards astral microtubule minus ends at the spindle poles. (B) Recent studies of additional proposed spindle-orientation factors (shown in various shades of grey) suggest an updated model for spindle orientation in epithelial cells. In this model, Discs large and Canoe (dark grey) provide positional information for the canonical machinery, while Discs large, in combination with other factors (e.g. Khc73, 14-3-3, NudE and unknown factors; shown in light grey), helps connect the dynein-mediated pulling force with a Khc73-mediated pushing/ capturing activity.
Is Gαi sufficient to anchor the core machinery?
Хотя Gαi был давно установлен как фактор ориентации веретена, находка, что он подобно LGN циклически перемещается между кортексом и полюсами веретена, ставит вопросы о его роли в этом процессе. Gαi, который регулируется c помощью guanine nucleotide exchange factor Ric-8, взаимодействует в своем GDP-связанном состоянии с C-терминальными Go Loco мотивами Pins/ LGN (Afshar et al., 2004, 2005; Couwenbergs et al., 2004; David et al., 2005; Hampoelz et al., 2005; Wang et al., 2005). Эти мотивы позволяют Pins/LGN действовать как guanine dissociation inhibitor (GDI), способствуя тем самым высвобождению GDP от Gαi (Jia et al., 2012; McCudden et al., 2005). Хотя активность GDI, как было установлено, негативно регулирует передачу сигналов с G-белком связанных рецепторов, предупреждая образование гетеротримеров c помощью удержания Gαi не связанным с from Gβγ , эта GDI активность Pins/LGN, как полагают, позитивно регулирует ориентацию веретена (Siderovski and Willard, 2005). Одна из предполагаемых функций Gαi, описанная выше, связана с закреплением на мембране кортикальных тянущих сил, действующих на астральные микротрубочки. В подтверждение этой роли было показано, что Gα белки могут подвергаться ковалентной липидной модификации, или palmitoylation, или myristoylation, и тем самым ассоциировать с плазматической мембраной непосредственно (rev. Chen and Manning, 2001). Т.о., липид, модифицирующий Gαi может связывать Pins/LGN чтобы расположить его вблизи мембраны. Однако, Gαi выполняет также и др. активирующую функцию. Pins/LGN принимает ауто-подавляющую конформацию в результате взаимодействия между его TPR и Go Loco доменами, а биохимический подход продемонстрировал, что ингибирование осуществляется за счет связывания Gαi с Go Loco доменами (Du and Macara, 2004; Nipper et al., 2007; Pan et al., 2013; Smith and Prehoda, 2011). Приняв свою открытую конформацию, Pins/LGN становится партнером для Mud/NuMA по связыванию высокого сродства (Du and Macara, 2004; Nipper et al., 2007), и затем собирается в комплекс, которы может действовать, чтобы ориентировать веретено посредством dynein. Очевидно, что Gαi осуществляет две роли: он активирует Pins/LGN (путем освобождения от ауто-ингибирования) и выступает в качестве мембранного якоря. Однако, его способность циклически появляться на центросомах показывает, что Gαi не просто прикреплен к мембране (Zheng et al., 2013). Более того, локализация Gαi оказывается более униформной в кортексе нейроэпителиальных клеток кур и в клетках HeLa, по сравнению с локализацией LGN или NuMA, хотя это наблюдение не объясняется разным состоянием нуклеотидов (Kiyomitsu and Cheeseman, 2012; Peyre et al., 2011). Эти находки показывают, что др. кортикальный фактор необходим для предоставления позиционной информации и в принципе для закрепления аппарата ориентации веретена, или в кооперации с Gαi или путем регуляции связывания нуклеотидов. Некоторые такие позиционные факторы были идентифицированы. У C. elegans, LET-99 служит для регуляции позиционирования комплекса, действуя как негативный регулятор GPR1/2 (Krueger et al., 2010; Tsou et al., 2002). Консервация этой функции у позвоночных, которые имеют гомологичные белки, не выявлена, и LET-99 не имеет ортолога у мух. Это означает. что Drosophila по меньшей мере д. использовать др. механизм для локализации тянущих сил.
Canoe/Afadin: linking adhesion to spindle orientation
Как упоминалось выше, эпителиальные клетки стремятся ориентировать свои деления так, чтобы обе дочерние клетки оказывались в плоскости ткани. Чтобы достичь такой ориентации кортикальные тянущие силы д. возникать в латеральных частях кортекса и избегать апикального и/или базального кортекса. В соответствии с этим, Pins/LGN обнаруживаются в латеральных частях кортекса во время митозов в MDCK клетках кист, в фолликулярных клетках Drosophila и в нейроэпителиальных клетках кур (Bergstralh et al., 2013; Hao et al., 2010; Peyre et al., 2011; Zheng et al., 2010). Механизм, с помощью которого достигается подобная локализация, неясен, хотя недавние исследования предоставляют некоторую информацию (Fig. 2B). Одним из кандидатов на роль локализации кортикальных тянущих сил является Drosophila Canoe, который наз. Afadin у позвоночных. Этот белок хорошо изучен в отношении его роли в слипчивых соединениях, где он связывает адгезивный белок Echinoid у Drosophila (ортолог семейства Nectin у позвоночных) с актиновым цитоскелетом (rev. Niessen and Gottardi, 2008). Canoe/Afadin взаимодействует также непосредственно с N-терминальными Pins/LGN TPRs (Carminati et al., 2016; Wee et al., 2011). Canoe/Afadin участвует в ориентации веретена в нескольких системах, но доказательства для единой функции не появились. В эмбриональном нейроэпителии Drosophila, Canoe обнаруживает свое характерное позиционирование слипчивых соединений (which derive from the neuroepithelium), которые локализуются в апикальном кортексе, где он действует, чтобы контролировать ориентацию веретена (Speicher et al., 2008). Изучение этой системы и культивируемых S2 клеток дрозофилы подтверждают , что Canoe действует как добавочный фактор, облегчающий взаимодействие между Pins и Mud (Speicher et al.,
Table 1. Key factors involved in spindle orientation.
2008; Wee et al., 2011). В этих исследованиях, Canoe, как полагают, функционирует на ступени, стоящей ниже локализации Pins. Напротив, исследования клеток HeLa показали, что кортикальная локализация LGN зависит от Afadin, и что Afadin конкурирует с NuMA за связывание LGN (Carminati et al., 2016). Поэтому было предположено, что это более вероятно, чем действие по рекрутированию NuMA, как это имеет место для Drosophila Canoe, Afadin помогает локализовать LGN путем соединения его с кортикальным актином. Это согласуется с более ранними исследованиями, показавшими, что кортикальный актин необходим для осуществления тянущих сил в эпителиальных клетках (Busson et al., 1998; Kaushik et al., 2003; Machicoane et al., 2014; Nakajima et al., 2013).
Дополнительная роль актина в ориентации веретена также недавно была предположена (rev. di Pietro et al., 2016). Влияние кортикального актина может быть также объяснено третьей предполагаемой функцией Canoe/Afadin, стоящей ниже белка планарной полярности Dishevelled (Dsh), в клетках предшественниках (pI) сенсорных органов дрозофилы. Эти клетки, которые обнаруживаются в нотуме куколок, делятся асимметрично, продуцируя различающиеся дочерние клетки - pIIa и pIIb (Gho and Schweisguth, 1998; Rhyu et al., 1994). Чтобы достичь этого веретено д. быть ориентировано строго определенным образом вдоль A-P оси клетки и под углом к A-B оси. Ориентация контролируется с помощью Wnt рецептора Frizzled и его внутриклеточного медиатора Dsh, оба располагаются в задней части кортекса (Bella?che et al., 2001; David et al., 2005). Отсюда, Dsh, как полагают, определяет локализацию Mud, и тем самым тянущие силы путем взаимодействия с ним непосредственно (S?galen et al., 2010). Работа с культивируемыми клетками показала, что Dsh может одновременно рекрутировать Canoe, 'nk, как полагают, усиливает действие кортикального актина посредством передачи сигналов Rho и тем самым способствует ориентации веретена (Johnston et al., 2013). Т.о., данные, полученные на мухах, не подтверждают роли Canoe в локализации тянущих сил. Вместо этого, они указывают на то, что Canoe действует как нижестоящий медиатор Dsh в pI клетках. Необходимо однако отметить, что Afadin, по-видимому, вносит вклад в позиционирование в кортексе LGN в клетках HeLa, хотя значение этого наблюдения для поляризованной ткани, в которой локализация Afadin ограничена слипчивыми соединениями, неопределенно (Carminati et al., 2016).
Недавнее сообщение (Gloerich et al., 2017) продемонстрировало, что др. белок слипчивых соединений, E-cadherin, также может соединяться непосредственно с LGN. В данном исследовании было показано, что E-cadherin рекрутирует LGN в межклеточные контакты и может служить в качестве инструктивного сигнала для ориентации веретена. Как и в случае с Afadin, LGN не может быть связан одновременно с E-cadherin и NuMA, это указывает на то, что LGN использует E-cadherin в качестве инициального позиционного сигнала, но закрепляется он с помощью Gαi во время митоза. Интересно, эти результаты подтверждают, что эпителий позвоночных и насекомых использует разные системы для локализации аппарата ориентации веретена, поскольку веретено не ориентируется с помощью слипчивых соединений у Drosophila (Bergstralh et al., 2013; Bosveld et al., 2016).
Discs large Discs large (Dlg) - это др. кандидат на роль фактора ориентации веретена в эпителиальных клетках. Подобно др. белкам семейства membrane-associated guanylate kinase (MAGUK), Dlg содержит N-терминальные PDZ домены, SH3 домен и каталитически неактивный guanylate kinase (GK ил GUK) домен на его C-конце, который соединяется с фосфорилированными партнерскими белками. В фолликулярном эпителии Drosophila, Dlg является важным для ориентации веретена в метафазе; веретена неправильно ориентированы в клетках, гомозиготных по мутантному аллелю dlg1P20, который кодирует укороченную форму Dlg, лишенную приблизительно трети GUK домена (Bella?che et al., 2001; Bergstralh et al., 2013). Эта роль довольно консервативна, поскольку RNAi-обусловленное истощение Dlg в нейроэпителии эмбрионов кур вызывает неправильную ориентацию веретен в метафазе и менее выраженную в анафазе (Saadaoui et al., 2014). Однако, в точности, как Dlg может функционировать во время ориентации веретена, неясно. Dlg может предоставлять кортикальный сигнал для Pins. Считается, что Dlg является очевидным кандидатом на роль предоставления пространственного сигнала для тянущих сил во время ориентации веретена (Bilder et al., 2000; St Johnston and Ahringer, 2010). Эксперименты in vitro показали, что GUK домен в Dlg и его гомологи у млекопитающих связывают Pins/LGN, если они фосфорилированы по консервативному сериновому остатку в его неструктуированном 'линкерном' регионе (Hao et al., 2010; Johnston et al., 2012; Sans et al., 2005; Zhu et al., 2011). Соотв, в фолликулярных клетках, мутантных по GUK домену dlg1P20, Pins не ограничивается латеральным кортексом, а скорее распространяется по всему кортексу (Bergstralh et al., 2013). Сходным образом исследования клеток MDCK показали, что фосфорилирование сайта (serine 401), который облегчает связывание между Dlg и LGN/Pins, необходимо для исключения кортикального LGN из апикального кортекса; когда S401 превращается в alanine, LGN не ограничивается латеральным положением, а распространяется по всему кортексу (Hao et al., 2010). Сходным образом, хотя и не в точности, превращение S401 в alanine предотвращает становление укороченного LGN (лишенного TPRs) полностью кортикальным в клетках нейроэпителия эмбрионов кур; укороченный белок вместо этого оказывается частично цитоплазматическим, подтверждая, что Dlg работает в кооперации с др. фактором локализации, возможно Gαi (Saadaoui et al., 2014). Итак, эти результаты подтверждают, что взаимодействие между фосфорилированными Pins и GUK доменами в Dlg помогает локализовать Pins в латеральном кортексе эпителиальных клеток во время митозов (Fig. 2B) и что эта локализация необходима для ориентации веретена.
Более того, недавние находки подтвердили, что фактор латеральной полярности Lethal (2) giant larvae (Lgl) участвует в регуляторной ступени, которая контролирует это взаимодействие. Подобно Pins, Lgl может соединяться с GUK доменом в Dlg in vitro (Zhu et al., 2014). В фолликулярном эпителии Drosophila и крыловых имагинальных дисках, Lgl располагается в кортексе во время интерфазы, но оказывается в цитоплазме во время митозов, это переключение запускается его фосфорилированием с помощью Aurora kinases (Bell et al., 2015; Carvalho et al., 2015). Поэтому было предположено, что Lgl контролирует расположение Pins путем физического предупреждения Pins от соединения с Dlg в латеральной части кортекса вплоть до митоза, когда Lgl высвобождается (Bell et al., 2015; Carvalho et al., 2015); однако, прямые доказательства этой модели пока не получены. Кроме того, Pins и Dlg в эпителии также участвуют в контроле ориентации веретена в асимметрично делящихся клетках. Напр., нейробласты Drosophila ориентируют свои веретена вдоль A-B оси, перпендикулярно плоскости ткани (Knoblich et al., 1995), и такая ориентация базируется на Pins и Gαi, которые рекрутируются белком, наз. Inscuteable, чтобы сформировать полумесяц в апикальном кортексе (Kraut et al., 1996; Yu et al., 2000). Dlg также концентрируется апикально в митотических нейробластах, но в присутствии Inscuteable нет необходимости в предоставлении позиционной информации для Pins; генетическое удаление Dlg из нейробластов нарушает клеточную полярность, но не влияет ни на образование полумесяца Pins , ни на ориентацию веретена (Albertson and Doe, 2003; Ohshiro et al., 2000; Peng et al., 2000; Yu et al., 2000). Однако, более недавнее исследование показало, что Dlg становится более важным, если удаляется Inscuteable: в inscuteable-нулевых мутантных нейробластах, Pins и Dlg всё ещё располагаются в кортикальном полумесяце во время митоза, хотя могут быть и не апикальной части, и этот полумесяц исчезает у большинства dlg1P20, inscuteable двойных мутантных нейробластов (Siegrist and Doe, 2005). Dlg , скорее всего, также участвует в ориентации веретена в pI клетках дрозофилы. В самом деле, в то время как Dsh контролирует ориентацию веретена вдоль плоскости ткани в этих клетках (as discussed above), ориентация веретена вдоль z-оси нуждается в Pins, который концентрируется вместе с Dlg в переднем/латеральном кортексе во время митоза (Bella?che et al., 2001; David et al., 2005). Такая концентрация сильно нарушается в dlg1P20 мутантных pI клетках (Bella?che et al., 2001). Итак, эти наблюдения согласуются с мнением, что Dlg может предоставлять позиционный сигнал для Pins в кортексе асимметрично делящихся клеток, как это происходит в эпителиальных клетках.
Dlg соединяется с Khc73 to regulate microtubule capture
Как подчеркивалось выше, Dlg, по-видимому, играет центральную роль в позиционировании Pins в кортексе. Но что тогда контролирует расположение Dlg? В inscuteable мутантных нейробластах и pI клетках, концентрация в кортексе Dlg и Pins взаимозависимы (Bella?che et al., 2001; Siegrist and Doe, 2005). Этого не происходит в случае фолликулярного эпителия, где Dlg обнаруживается в латеральных частях кортекса даже в отсутствие Pins (Bergstralh et al., 2013). Потенциальным объяснением этого различия является намек в экспериментах, показывающий, что кортикальный полумесяц из Dlg в мутантных inscuteable нейробластах базируется на астральных микротрубочках (Siegrist and Doe, 2005), подтверждая. что Dlg транспортируется вдоль этих микротрубочек. Одним из кандидатов на роль транспортера Dlg и Pins вдоль астральных микротрубочек в кортекс является направленный на плюс концы микротрубочек моторный белок kinesin heavy chain 73 (Khc73), который совместно иммунопреципитируется с Dlg из эмбрональных лизатов Drosophila (Siegrist and Doe, 2005). В нейробластах, лишенных Inscuteable, нокдаун Khc73 предупреждает образование кортикального полумесяца из Dlg и Pins (Siegrist and Doe, 2005). Более того, guanylate kinase-associated kinesin (GAKIN), который является ортологом у млекопитающих Khc73, был первоначально идентифицирован в происходящих из T-лимфоцитов клетках в качестве партнера по связыванию SAP97, который является одним из четырех гомологов Dlg у млекопитающих (Hanada et al., 2000). Последующие биохим. исследования подтвердили, что GAKIN ведет себя неактивно из-за внутримолекулярного ингибирования, которое облегчается за счет связывания с C-концом SAP97, и это позволяет двум молекулам перемещаться вместе вдоль микротрубочек (Asaba et al., 2003; Yamada et al., 2007). Полной длины SAP97 делает невозможной такую активность, это указывает на то, что участвует также др. фактор (Yamada et al., 2007). Можно предположить, что LGN/Pins является таким фактором. Эта модель, однако, осложняется, доказательством, что связь между SAP97 и GAKIN обеспечивается за счет guanylate kinase домена в GAKIN, который также обеспечивает связывание между SAP97/Dlg и LGN/Pins (Asaba et al., 2003; Hanada et al., 2000; Zhu et al., 2016). Поэтому пока неясно, как все три фактора могут переноситься вместе. Одним из объяснений является то, что Dlg может функционировать как олигомер, с индивидуальными единицами, связывающими или Pins, или Khc73. Необходимо также отметить, что Dlg не соединяется с мембраной непосредственно. Подобно своему гомологу у человека PSD-95, кортикальная локализация Dlg, следовательно, скорее всего, определяется взаимодействием между его PDZ доменами и, по крайней мере, с одним ассоциированным с мембраной белком (Kim and Sheng, 2004). Т.о., Dlg может лишь предоставлять позиционную информацию для Pins/LGN, действуя как адаптор для чего-то ещё. Идентификация этого закрепляющего фактора и механизма, с помощью которого он локализуется ещё предстоит. Дальнейшая возможность заключается в том, что Dlg является не только кортикальным сигналом, но и также может действовать как адапторный белок в комплексе, который связывает кортикальный Pins с Khc73, позволяя тем самым Pins осуществлять вторичный эффект на астральные микротрубочки посредством Khc73 (Fig. 2B). Снова, поскольку Dlg не может связывать и Khc73 и Pins одновременно, то эта модель указывает на множественные субъединицы Dlg внутри комплекса (Zhu et al., 2016). В соответствии с этой идеей было показано, что нокдаун Khc73 оказывает незначительный эффект на ориентацию веретена в нейробластах (Siegrist and Doe, 2005). Сходным образом, в системе культивируемых клеток Drosophila с индуцированной клеточной полярностью, Khc73 и Dlg могут кооперировать с GUK-связывающим линкерным доменом в Pins, чтобы частично ориентировать веретено (Johnston et al., 2009). Эта активность базируется на 14-3-3, который связывает фосфорилированные остатки и NudE, партнера по связыванию dynein (Lu and Prehoda, 2013). Итак, Pins, Dlg, 14-3-3 и NudE, как полагают, формируют мост между Khc73 на одной астральной микротрубочке и с dynein на др. (Fig. 2B). Это позволяет аппарату ориентации веретена не только осуществлять тянущие усилия на астральные микротрубочки (посредством Mud/ dynein), но и также проталкивать или, скорее всего, отлавливать микротрубочки (посредством Dlg/Khc73) (Johnston et al., 2009).
Итак, хотя и ясно, что Dlg помогает ориентировать веретена в эпителиальных тканях, в асимметрично делящихся клетках и в культивируемых клетках, унифицированная модель для понимания его участия еще не появилась и фактически может не существовать. Как в случае Canoe/Afadin, роль Dlg, по-видимому, варьирует в зависимости от типа клеток. Такая изменчивость базируется на основе того факта, что Dlg не существенен в каждой ткани; он необязателен для Inscuteable-обеспечиваемой ориентации веретена, а недавние работы показали, что хотя Mud-обеспечиваемое натяжение необходимо для ориентации веретена в крыловом диске личинок Drosophila и нотуме куколок, ни Pins, ни Dlg не нужны (Bergstralh et al., 2016; Bosveld et al., 2016).
Mud/NuMA: translating cell shape into spindle orientation
Крыло и нотум Drosophila, которые происходят из одного и того же имагинального диска, оказываются исключительно пригодными для изучения влияния кортикального натяжения на клеточное деление и ориентацию веретена. Предыдущие исследования продемонстрировали, что направление клеточного деления может быть предсказано по локальному напряжению на уровне ткани (Baena-L?pez et al., 2005; Mao et al., 2013; Wyatt et al., 2015). Это не является неожиданным; клетка под напряжением, как ожидается, должна удлиняться, а правило Hertwig's утверждает, что клетка с более длинной остью будет делиться поперек этой оси. Однако, это не согласуется с наблюдениями, что эпителиальные клетки стремятся округлиться во время митоза. Как же тогда интерфазная форма клетки транслируется через митоз? Аппарат ориентации веретена или, по крайней мере, часть его дает ответ. В нотуме куколок Drosophila и в личиночном крыле, Mud локализуется в соединениях из трех клеток (tricellular junctions (TCJs)), специализированных структурах из боле чем двух клеток (Bosveld et al., 2016). Молекулярная связь между TCJs, которые содержат мало известные компоненты, и Mud пока неизвестна. Однако, поскольку на форму клетки влияет тканевое натяжение, так и на распределение TCJs, и поскольку эти структуры сохраняются в течение всего клеточного цикла, то их распределение представляет механизм, гарантирующий, что интерфазная форма клетки, которая теряется при митотическом округлении, предопределяет угол планарного деления (planar division angle) (Fig. 3) (Bosveld et al., 2016). Уровень тканевого натяжения деформирует интерфазную клетку, приводя в результате к асимметричному распределению TCJs. Такое распределение, которое сохраняется после митотического округления, предопределяет ориентацию веретена благодаря локализации Mud в TCJs
Fig. 3. The role of tricellular junctions during spindle orientation. In the Drosophila wing disc and pupal notum, tissue tension governs spindle orientation. Mud (yellow) is enriched at tricellular junctions (TCJs) throughout the cell cycle. The distribution of TCJs, and thus of Mud/dynein, translates interphase cell shape into division orientation by producing an asymmetric pulling force on astral microtubules. Green red and blue structures?
Интересно, что локализация Mud в TCJs не зависит от Pins в личиночном крыле и нотуме куколки (Bosveld et al., 2016). Более того, Pins не нужен для ориентации веретена по A-B оси (Bergstralh et al., 2016; Bosveld et al., 2016; David et al., 2005). Развитие крыла и нотума, следовательно, первая эпителиальная ткань, в котороей ориентация веретена не зависит от Pins, хотя обнаруживаются и дпр. механизмы, независимые от Pins. В pI клетках (as discussed above), Mud может быть закреплен за счет взаимодействия с Dsh (David et al., 2005; S?galen et al., 2010). Интересно, что LGN не является необходимым для развития волосяных фолликулов у мышей, это подтверждает возможность, что работает сходный механизм (Byrd et al., 2016). Можно предположить, что эпителиальные ткани или, по крайней мере, в крыле и нотуме, могут использовать отличающуюся систему ориентации веретена. Однако, степень, с которой используется TCJ механизм в др. тканях всё ещё неизвестна. Ориентация веретена в фолликулярном эпителии Drosophila и в нейроэпителии кур, также, как и в происходящих из эпителия клетках, растущих в культуре, нуждается в Pins/LGN (Bergstralh et al., 2013; Du et al., 2001; Peyre et al., 2011). Как направление роста контролируется в таких тканях, неизвестно. Митотический фолликулярный эпителий, по крайней мере, охарактеризован с помощью 'незрелых' septate junctions; маркеры, такие как Dlg не сильно сфокусированы в одном регионе латеральных частей кортекса и TCJs отсутствуют (Goode and Perrimon, 1997). Более того, TCJ-обеспечиваемое распределение Mud/NuMA является не единственным механизмом для трансляции интерфазной формы в ориентацию делений в округлившихся клетках. В клетках HeLa cells, это, как полагают, сопровождается зависимым от caveolin 1 рекрутированием аппарата ориентации веретена на втягиваемый (retracting) край округлившейся клетки (Matsumura et al., 2016), хотя точный механизм, лежащий в основе, предстоит ещё выяснить.
Итак, эти исследования показали, что ориентация веретена в эпителиальных клетках не происходит в результате генерализованного механизма, как это представлялось в ранних работах, показавших, что канонические комплексы законсервированы к разных организмов и в разных типах тканей. Вместо этого разные типы клеток, даже в эпителиальной ткани у одно и того же организма (напр. Drosophila), обнаруживают разную потребность для локализации кортикальных сил.
Conclusions
Although the core components of the spindle-orientation machinery have been known for well over a decade, a number of questions concerning how this complex works still remain. The pulling force has generally been thought to rely on minus-end-directed dynein walking, but new findings suggest that regulated depolymerization of microtubules might also be involved. Questions about the localization of the machinery persist too. Work in Drosophila and in isolated cells shows that the spindle can help to determine its own position, probably by regulating the delivery of spindle-orienting machinery proteins to and from the spindle poles. This shows that the location of the machinery within the cell is more dynamic than anticipated. However, as both LGN and Gαi cycle between the cortex and the spindle poles, these findings also suggest a requirement for cortical polarity factors in anchoring. It is not yet clear that the candidates identified already, such as Canoe/Afadin, E-cadherin and Discs large, can fully explain how spindles are anchored to the cortex in some epithelial cell types, and it is now apparent that different types of epithelia use distinct mechanisms to position their mitotic spindles. A more complete understanding of how spindles are oriented will therefore require more extensive research, e.g. using CRISPR-based strategies to interrogate the proposed interactionsin vivo, into how the spindle-orienting machinery is localized and regulated in multiple systems.
|