Посещений:
СПЛАЙСИНГ ПРЕ-мРНК



Гистон H2A.Z способствует сплайсингу слабых интронов

The histone variant H2A.Z promotes splicing of weak introns
Kelly E. Nissen, Christina M. Homer, Colm J. Ryan et al.
Genes & Dev. 2017. 31: 688-701

Multiple lines of evidence implicate chromatin in the regulation of premessenger RNA (pre-mRNA) splicing. However, the influence of chromatin factors on cotranscriptional splice site usage remains unclear. Here we investigated the function of the highly conserved histone variant H2A.Z in pre-mRNA splicing using the intron-rich model yeast Schizosaccharomyces pombe. Using epistatic miniarray profiles (EMAPs) to survey the genetic interaction landscape of the Swr1 nucleosome remodeling complex, which deposits H2A.Z, we uncovered evidence for functional interactions with components of the spliceosome. In support of these genetic connections, splicing-specific microarrays show that H2A.Z and the Swr1 ATPase are required during temperature stress for the efficient splicing of a subset of introns. Notably, affected introns are enriched for H2A.Z occupancy and more likely to contain nonconsensus splice sites. To test the significance of the latter correlation, we mutated the splice sites in an affected intron to consensus and found that this suppressed the requirement for H2A.Z in splicing of that intron. These data suggest that H2A.Z occupancy promotes cotranscriptional splicing of suboptimal introns that may otherwise be discarded via proofreading ATPases. Consistent with this model, we show that overexpression of splicing ATPase Prp16 suppresses both the growth and splicing defects seen in the absence of H2A.Z.
Функциональное общение между хроматином, транскрипцией и преобразованием мРНК хорошо известно (de Almeida and Carmo-Fonseca 2014). Многие линии доказательств подтверждают модель, согласно которой сплайсинг пре-мРНК преимущественно происходит во время транскрипции, а сплайсинг факторы рекрутируются на и действуют, когда синтезируемая РНК используется RNA polymerase II (RNAP II) комплексом (Merkhofer et al. 2014). Структура хроматина является важным фундаментом для координации сплайсинга и транскрипции, предоставляя обоим платформу для рекрутирования факторов как для путей, так и окружения, чтобы модулировать кинетику транскрипции, которая влияет на распознавание мест сплайсинга и кинетику сплайсинга (Gomez Acuna et al. 2013). Поэтому устранение хроматиновых факторов или изменение их распределения приводят к дефектам эффективности сплайсинга и изменениям паттерна альтернативного сплайсинга (Naftelberg et al. 2015). Однако, механизмы, с помощью которых хроматин влияет на выбор мест сплайсинга, всё ещё плохо изучены.
Сплайсинг, процесс удаления интронных последовательностей из пре-мРНК, осуществляется с помощью сплайсесом, высоко законсервированной макромолекулярной машины, очень сложным и ступенчато-образным способом (Supplemental Fig. S1; Wahl et al. 2009). С борка сплайсесом и катализ тонко регулируются, чтобы давать как канонические, так и альтернативные транскрипты из разных наборов cis-splicing последовательностей (Ast 2004). Эта сплайсинг реакция управляется с помощью ATPases, которые контролируют скорость перестройки сплайсесом, в то же время предоставляя возможность корректуры субстратов (Staley and Guthrie 1998; Koodathingal and Staley 2013). Корректирование позволяет сплайсесомам идентифицировать интроны с субоптимальными цис-сплайсируемыми последовательностями, которые иначе могут занять больше времени для обработки или отказа от неправильных субстратов (Staley and Guthrie 1998; Koodathingal and Staley 2013). У организмов со многими разнообразными интронными сигналами дополнительные сплайс-факторы имеют целью выбор места сплайсинга, но в точности, как действуют дополнительные факторы экспрессии генов, такие как хроматин, неизвестно (Chen and Manley 2009).
Распределение и модификации паттерна нуклеосом служат не только в качестве маркера границ гена, но и также предоставляют информацию о структуре гена во время экспрессии (Campos and Reinberg 2009). Нуклеосомы благодаря своей обогащенной оккупации экзонов, как полагают, играют роль в определении границ экзон-интрон, а дифференциальные модификации гистонов, как было установлено, влияют на эффективность сплайсинга и исходы альтернативного сплайсинга (Schwartz and Ast 2010). Реципрокно факторы сплайсинга и интрон/экзон архитектура, как было установлено, управляют модификациями и позиционированием гистонов (de Almeida et al. 2011; Kim et al. 2011; Bieberstein et al. 2012). Помимо модификаций гистонов, замещение канонических гистоновых белков гистоновыми вариантами является др. способом повышения специализации нуклеосом. H2A вариант H2A.Z законсервирован у 90% эукариот при 60% сходстве последовательностей (Zlatanova and Thakar 2008). Вклад H2A.Z/H2B димера в замену канонического H2A/H2B димера обеспечивается с помощью Swr1 комплекса (Krogan et al. 2003; Kobor et al. 2004; Mizuguchi et al. 2004) и обычно происходит на +1 и -1 нуклеосомах вокруг transcription start site (TSS) (Subramanian et al. 2015). Недавно H2A.Z был также наййден инкорпорированным в тело гена у метазоа (Weber et al. 2010; Tolstorukov et al. 2012). В частности, билизко родственные варианты гистона у Drosophila melanogaster (H2A.V) и Homo sapiens (H2A.Bbd) специфически обогащают границы интрон-экзон (Weber et al. 2010; Tolstorukov et al. 2012).
Первоначально мы попытались исследовать, как ландшафт хроматина влияет на сплайсинг у Saccharomyces cerevisiae (Wilmes et al. 2008). Хотя геномное картирование генных взаимодействий раскрывает множество соединений между сплайсингом и др. путями генной экспрессии, границы этого анализа ограничены фактически тем, что геном почкующихся дрожжей содержит лишь ~250 интронов и большинство связано со строгими консенсусами сигналов цис-сплайсинга. Чтобы расширить этот анализ на более подходящие системы метазоа, мы обратились к делящимся дрожжам Schizosaccharomyces pombe, геном которых кодирует более интронов, которые используют разнообразный набор cis-splicing сигналов и сплайсесомы, которые обладают большей консервативностью с др. метазоа (Wood et al. 2002; Kuhn and Kaufer 2003; Sridharan et al. 2011). Более того, субнабор делящихся дрожжей подвергается альтернативному сплайсингу в форме удержания интрона в ответ на определенные внешнесредовые условия (Awan et al. 2013; Bitton et al. 2015; Stepankiw et al. 2015). Т.о., используя систему делящихся дрожжей, мы можем лучше понять, как разнообразие силы интронов и принятие решения о сплайсинге могут испытывать влияние со стороны хроматина.
Базируясь на работе Patrick et al. (2015), в которой геномный генетический скрининг у S. pombe выявил обширные связи между сплайсингом и хроматиновыми факторами, здесь мы идентифицировали роль Swr1 хроматин ремоделирующего комплекса и гистонового варианта H2A.Z в сплайсинге слабых интронов у S. pombe. В частности, интроны с субоптимальной архитектурой и nonconsensus cis-splicing последовательностями нуждаются в H2A.Z для своего эффективного удаления. Величина этого эффекта усиливается еще больше по время температурного стресса. Наши данные показывают, что H2A.Z обогащен на генах, содержащих интрон, располагаясь преимущественно в +1 нуклеосоме, вблизи границ интрон/экзон слабых интронов. Избыточная экспрессия Prp16, сплайс-ATPase с корректирующей активностью, супрессирует дефект роста, зависимый от температуры, и дефект удерживания nonconsensus интрона в линиях, лишенных H2A.Z или Swr1 ATPase. Кроме того, мутантные nonconsensus места сплайсинга превращают интрон в консенсусную последовательность, достаточную, чтобы ослабить потребность в H2A.Z для обеспечения сплайсинга. Итак эти данные подтвердили критическую роль H2A.Z в маркировке слабых интронов, что делает возможной дополнительную проверку с помощью сплайсесом и предупреждает ложный сброс.

Discussion


Правильное распознавание и удаление интронов нуждается в регуляции количества ступеней. Как клетки интегрируют множественные сигналы, чтобы принять решение о сплайсинге во время транскрипции, всё ещё слабо изученная область. В данном исследовании мы продемонстрировали потребность в варианте гистона H2A.Z и в Swr1 нуклеосомы ремоделирующем комплексе для эффективного сплайсинга слабых интронов. Мы показали, что H2A.Z обогащен на границах интрон-экзон вблизи промоторов слабо экспрессирующихся генов. Кроме того, интроны, расположенные на 5' конце генов S. pombe, скорее всего, содержат nonconsensus cis-splicing сигналы. Корреляция между присутствием H2A.Z и nonconsensus интронами подтверждает, что гистоновый вариант сам по себе может маркировать интроны со слабыми сплайс-сигналами и способствовать их распознаванию и удалению. В согласии с этой идеей, мы показали, что избыточная экспрессия корректирующей ATPase, Prp16, устраняет дефекты роста и сплайсинга в отсутствие H2A.Z-содержащих нуклеосом. Мы предлагаем модель, согласно которой присутствие H2A.Z проксимальнее интрона изменяет кинетику распознавания интрона во время транскрипции и корректировку, способствуя тем самым сплайсингу интронов со слабыми местами сплайсинга.

H2A.Z promotes the recognition and removal of weak promoter-proximal introns


Геном S. pombe богат тысячами cis-splicing сигналами, которые не ограничены consensus последовательностью (Wood et al. 2002; Kuhn and Kaufer 2003). Такое разнообразие последовательностей указывает на необходимость нескольких уровней регуляции по каждому решению о сплайсинге. Здесь было показано строгое влияние H2A.Z и Swr1 комплекса на облегчение принятия подобного решения у делящихся дрожжей. Наши результаты согласуются с опубликованными исследованиями Pleiss группы (Larson et al. 2016) по S. pombe и Stevens группы (Sorenson and Stevens 2014) на S. cerevisiae, в которых множественные компоненты комплекса Swr1 были идентифицированы при геномном скрининге изменений в эффективности сплайсинга модельных генных конструкций.
Один из способов, с помощью которого комплекс Swr1 может способствовать сплайсингу, как полагают, является рекрутирование факторов сплайсинга на синтезируемую пре-мРНК во время сборки сплайсесом и/или катализа. Наша работа показала, что H2A.Z, кроме того, обогащен вокруг TSS, и также, скорее всего, находится в нуклеосомах, фланкирующих слабые интроны слабо экспрессируемых генов, пространственно коррелируя отложение H2A.Z и сплайсинг генов со слабыми сигналами генной экспрессии. У людей SF3B, как было установлено, слабо ко-иммунопреципитирует с H2A.Z, подтверждая, что д. быть физическое взаимодействие соотв. генов (Tolstorukov et al. 2012). Кроме того, эксперименты масс спектрометрии Swr1 комплекса S. pombe и S. cerevisiae показали, что др. ранние сплайс-факторы присутствуют на уровне субкомплекса, в частности, факторы сплайсинга которые вызывают сильные негативные генетические взаимодействия у S. pombe и S. cerevisiae EMAPs (Shevchenko et al. 2008; Wilmes et al. 2008; Kim et al. 2009). Необходимы дальнейшие исследования для проверки природы этих генетических взаимодействий.
Недавняя работа группы Johnson group (Neves et al. 2017) на S. cerevisiae показала, что в отсутствие H2A.Z, Ser2-P популяция RNAP II, представляющая удлиняющую RNAP II, накапливается на 5' концах тел генов. Они также наблюдали существенные изменения в ассоциации snRNP в интронах с nonconsensus BPs, подтверждая дефекты сборки, перестройки или удаления сплайсесом. Все эти наблюдения демонстрируют, что H2A.Z's влияет на транскрипцию, что коррелирует с его ролью в сплайсинге nonconsensus интронов, возможно путем изменений в кинетике перестройки сплайсесом. Наблюдения, сделанные относительно элонгации RNAP II у S. cerevisiaeare, скорее всего, приложимы и к системе делящихся дрожжей. Предыдущий анализ наших EMAPs показал, что компоненты комплекса Swr1 как группа обнаруживают высоко скоррелированные профили глобального генетического взаимодействия у S. pombe и S. cereviaise, подтверждая, что этот белковый комплекс играет одинаковые роли у двух видов дрожжей.

H2A.Z likely influences splicing fidelity


Реакция сплайсинга протекает сложным ступенчато-образным способом, управляемым с помощью ATPases, которые регулируют скорость перестройки сплайсесом, делая возможной корректировку субстратов (Staley and Guthrie 1998; Koodathingal and Staley 2013). Принимая во внимание наши наблюдения, что слабые, nonconsensus интроны чувствительны к потере H2A.Z, нам стало интересно, была ли экспрессия корректирующих АТФаз - бастионов точности сплайсинга - способна компенсировать потерю H2A.Z у интронов со слабыми и/или альтернативными цис-сплайсинговыми сигналами. В самом деле, мы наблюдали строгую супрессию дефектов сплайсинга, зависимого, от pht1Δ в клетках с избыточной экспрессией фактора точности сплайсинга DEAH-box ATPase Prp16. Эта потребность в дополнительном Prp16 занижается в наших экспериментах, осуществленных при 16°C, когда потеря pht1, скорее всего, вносила вклад в низкую и неэффективную элонгацию RNAP II, которая далее усиливалась при низкой температуре. В этих условиях избыточная экспрессия Prp16 может восстанавливать сплайсинг за счет усиления частоты ассоциации Prp16 со сплайсесомами, увеличивая тем самым вероятность, что Prp16 может пробовать и задействовать сигналы цис-сплайсинга от слабых проксимальных к промотору интронов (Fig. 7). Путем увеличения вероятности, что Prp16 будет доступен за счет увеличения его локальной концентрации, первая- и- вторая-ступень катализа могут быть продвинуты вперед даже в отсутствие H2A.Z, чтобы маркировать слабые интроны и координировать распознавание и удаление интронов одновременно с транскрипцией. Эта роль Prp16 согласуется с сообщением группы Cheng (Tseng et al. 2011), которая показала, что Prp16 обладает ATP-независимой ролью в обеспечении первой ступени катализа сплайсинга, и множественные сообщения от группы Staley (Koodathingal et al. 2010), которая охарактеризовала роли Prp16's в кинетической коррекции второй ступени и выявлении nonconsensus сайтов сплайсинга с помощью сплайсесом (Semlow et al. 2016)

Figure 7.

Model illustrating the effect of H2A.Z loss on splicing efficiency and suppression by overexpression of prp16 and exacerbation by overexpression of prp43. Cartoon depicting a gene with a weak intron near the +1 nucleosome. When H2A.Z is absent, splicing of this weak intron does not proceed efficiently. Overexpression of Prp16 ATPase recues this splicing efficiency defect, possibly through altering the kinetics of splicing catalysis. Through mass action, overexpressed Prp16 is more likely to be bound to the spliceosome, thereby preventing discard by Prp43, promoting weak splice site sampling, and/or driving splicing catalysis forward. Overexpression of Prp43, on the other hand, preferentially acts to discard the spliceosomes on the weak substrate, which are possibly stalled due to the absence of H2A.Z.

Такая модель предсказывает, что в клетках дикого типа сплайсинг субоптимального субстрата нуждается в дополнительном внимании со стороны сплайсесом, которое обеспечивается путем координации между H2A.Z и сплайсесомами. Путем предоставления сплайсесомам права на ошибку несколько раз на субоптимальных субстратах прежде, чем ступень катализа будет завершена, клетка может постараться не отказываться от субстрата со слабым сайтом сплайсинга. В согласии с этой идеей избыточная экспрессия Prp43 в pht1Δ линии вызывает синтетическую болезнь, возможно путем увеличения ассоциации Prp43, приводя к сбросу уже слабо сплайсированных, слабых интронов. Устранение дефектов роста и сплайсинга pht1Δ путем избыточной экспрессия Prp16 подтверждает, что H2A.Z играет роль в обеспечении сплайсинга слабых интронов, способствуя дополнительной проверке с помощью сплайсесом, предупреждая тем самым ложные удаления интронов, содержащих nonconsensus сайты сплайсинга. Эта модель подкрепляется нашим наблюдением, что мутантные интроны с nonconsensus 5' SS и BP последовательностями подавляют потребность в H2A.Z для обеспечения эффективного сплайсинга.
Итак, результаты группы Johnson (Neves et al. 2017), наши генетические и молекулярные данные указывают, что гистоновый вариант H2A.Z является сигналом, который маркирует слабые интроны, чтобы обеспечить их сплайсинг во время транскрипции. Поняв сложность влияния хроматина на точность и эффективность сплайсинга, мы начинаем задаваться вопросом, как нарушения эти скоординированных процессов могут приводить к клеточной дисфункции и болезни.