Посещений:
ГЕМАТОПОЭТИЧЕСКИЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ



Выбор клональных клеточных судеб

From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes
• Elisa Laurenti • & Berthold Gottgens
• Nature volume553, pages418–426 (25 January 2018) • doi:10.1038/nature25022

The development of mature blood cells from haematopoietic stem cells has long served as a model for stem-cell research, with the haematopoietic differentiation tree being widely used as a model for the maintenance of hierarchically organized tissues. Recent results and new technologies have challenged the demarcations between stem and progenitor cell populations, the timing of cell-fate choices and the contribution of stem and multipotent progenitor cells to the maintenance of steady-state blood production. These evolving views of haematopoiesis have broad implications for our understanding of the functions of adult stem cells, as well as the development of new therapies for malignant and non-malignant haematopoietic diseases.
Когда Ernst Haeckel впервые использовал слово стволовые клетки ('Stammzelle') в 1868, как и Darwin он использовал его для обозначения примордиального одноклеточного организма, от которого произошли все многоклеточные1. Эта стволовая клетка, следовательно, располагалась в корне ветвящегося семейного древа, в данном случае обозначаемого как ствол древа ('Stammbaum', meaning a tree that shows where things stem from). Вскоре после этого биогенетический закон Haeckel's, согласно которому онтогенез воспроизводит филогенез, позволило ему использовать термин стволовая клетка для описания оплодотворенного яйца. Гистопатологи впоследствии применили эту концепцию стволовой клетки к нормальному и лейкемическому гематопоэзу, толкуя далее концепцию общего предшественника клеток красной и белой крови2 а также общего предшественника для миелоидных и лимфоидных лейкемических клеток3. Концепция стволовых клеток т. о., была оформлена в виде древообразной модели, в которой мультипотентные стволовые клетки давали свое потомство посредством упорядоченных серий из ступеней ветвления.
Первый in vivo метод по выявлению функции стволовых клеток базировался на восстановлении от летального облучения трансплантаций костного мозга4, что впервые сопровождалось определением количества стволовых клеток путем подсчета гематопоэтических колоний в селезенке трансплантированных мышей. Это не только позволило подсчитать частоты колонии-формирующих единиц в селезенке как 1 на 10000 клеток костного мозга5, но и получить первый дефинитивный пул in vivo мультипотентных клеток предшественников для определения их функции, базируясь на цитогенетических аномалиях внутри индивидуальной колонию формирующей единицы в селезенке6. Флюоресценцией активированная сортировка клеток затем облегчила очистку пригодных к трансплантации гематопоэтических стволовых клеток (HSCs)7, что продемонстрировало пригодность позитивной и негативной селекции. HSCs исторически были определены на базе двух основных свойств: самообновления и мультипотентности. Операционно это определялось посредством трансплантации. Напротив, , по-видимому, и определялись по отсутствию широкого самообновления и ограничению способности клональной дифференцировки (часто ограниченной би- или униклональностью), так что они обычно терялись в течение первых 2-3 недель после трансплантации8.
Приблизительно в 2000 году характеризация популяций предшественников, стоящих ниже HSCs, привела к созданию модели древа гематопоэтической дифференцировки, которая всё ещё присутствует во многих учебниках (Fig. 1a). Согласно этой модели первой точкой ветвления, отделяющей лимфоидный потенциал от всех остальных клонов (миелоидного, эритроидного и мегакариоцитарного), сопровождается несколькими дальнейшими ступенями ветвления на какого-либо из сторон древа, переходя от мульти- к би- и мультипотентным клеткам предшественникам. А последующем использование др. поверхностных маркеров выявило несколько модификаций этого классического древа, включая лимфоидные и миелоидные судьбы, остающиеся в ассоциации вплоть до самых дальних ветвлений древа8-10, это раннее ответвление мегакариоцитов11,12, а также подразделение компартмента мультипотентных предшественников на разные субпопуляции13,14 (Fig. 1b). Более того, картина в дальнейшем стала ещё сложнее, поскольку сам пул HSC оказался функционально и молекулярно гетерогенным11-20. Эти исследования оказались наиболее успешными на мышиных системах, в которых мы сегодня обнаруживаем изумительные количества разных структур гематопоэтического древа. Хотя очевидно, что все эти структуры отражают действительные аспекты дифференцировки HSC, но все вместе их трудно втиснуть в единое, негнущееся ветвящееся древо. Необходим новый подход.



Figure 1: Timeline of hierarchical models of haematopoiesis.

a, Visualization based on cutting-edge research around the year 2000: HSCs are represented as a homogeneous population, downstream of which the first lineage bifurcation separates the myeloid and lymphoid branches via the common myeloid progenitor (CLP) and common lymphoid progenitor (CLP) populations. DCs, dendritic cells; EoBP, eosinophil-basophil progenitor; GMP, granulocyte-monocyte progenitors; LT, long-term; ILCs, innate lymphoid cells; MEP, megakaryocyte-erythrocyte progenitors; NK, natural killer cells; ST, short-term.b, During the years 2005-2015, this visualization incorporates new findings: the HSC pool is now accepted to be more heterogeneous both in terms of self-renewal (vertical axis) and differentiation properties (horizontal axis), the myeloid and lymphoid branches remain associated further down in the hierarchy via the lymphoid-primed multipotential progenitor (LMPP) population, the GMP compartment is shown to be fairly heterogeneous142. c, From 2016 onwards, single-cell transcriptomic snapshots indicate a continuum of differentiation. Each red dot represents a single cell and its localization along a differentiation trajectory.



Stem cell and progenitor boundaries


Defining the HSC state


На клеточном уровне переключение с самообновления совпадает с включением программ клонирования. Выглядит правдоподобным это и на молекулярном уровне и концепция мультклональной основы была предположена рано, как лежащий в основе молекулярный механизм, с помощью которого HSCs поддерживают множественный потенциал21 (Box 1). Однако, появившиеся геномные технологии14,22-25 вместе с генетическими исследованиями на мышах продемонстрировали, что программы транскрипции HSC определяются коллекцией уникальных метаболических и клеточных свойств, которые не могут быть непосредственно связаны с мультипотентностью. Приблизительно 70% всех изменений экспрессии между HSCs и ранними предшественниками происходят независимо от клонального выбора24, что сопровождается сходной дихотомией также на уровнях метилирования26-29 и доступности хроматина30. Соотв., HSCs остаются молчащими19,20,31,32, зависимыми от аутофагии33,34 и гликолитического35,36 состояния, характеризуясь низкой митохондриальной активностью37,38 и тонко контролируемыми уровнями синтеза белка, более низкими, чем у большинства др. типов гематопоэтических клеток39. Специфичные для стволовых клеток стрессовые реакции и механизмы контроля качества делают возможной сохранность целостности компартмента HSC после воздействия повреждений ДНК40,41 и белка42,43 или метаболических стрессов33,34. Напротив, предшественники являются высоко пролиферативными и метаболически активными клетками, которые зависят от оксидативного метаболизма и функции митохондрий.

Box 1: Mechanistic underpinnings of cell-fate choice Выбор клеточной судьбы влечет за собой альтернативные программы генной экспрессии, обычно выполняемые с помощью транскрипционных и эпигенетических регуляторов в ответ на внеклеточные сигналы. Транскрипционные факторы соединяются со специфическими последовательностями мотивами внутри регионов промотора, энхансера или сайленсеров. Специфичная для типа клеток экспрессия достигается посредством комбинаторных взаимодействий транскрипционных факторов, которые формируют ключевые строительные блоки более широкой регуляторной сети. Комплексы транскрипционных факторов привлекают эпигенетические регуляторы, чтобы модулировать статус активации генного локуса, это может быть передано последующим клеточным поколениям как 'эпигенетическая память'. Важно, что клетки предшественники могут становиться primed путем открытия регуляторных элементов, ассоциированных с генами, которые направляют дифференцировку на специфический зрелый клон144.
Мультипотентные клетки, как полагают, обладают мультиклональными детонаторами (priming), которые обеспечивают одновременную, низкого уровня активацию программ экспрессии для альтернативных клонов. Клональный выбор затем делает одну из программ 'победительницей', тогда как альтернативные программы гасятся. Перекрестный антагонизм между парами клон-детерминирующих транскрипционных факторов представляет собой привлекательную механистическую модель, которая первоначально была сфокусирована на эритроидном регуляторе GATA1 и миелоидном регуляторе PU.1. Недавно столо возможным получение time-lapse изображений с одиночных клеток, однако, остался открытым вопрос, действительно ли выбор эритроидной или миелоидной судьбы в самом деле управляется перекрестным антагонизмом между GATA1 и PU.1145. Доказательства клонального выбора (priming) и его свершение с помощью перекрестного антагонизма было описано с разрешением в одну клетку для другой пары транскрипционных факторов, таких как выбор судьбы нейтрофилов или макрофагов под контролем GFI1 и IRF889.
Инструктивная и стохастическая модель были предложены в качестве механизмов запуска активации одной клональной программы по сравнению с др. Стохастическая модель в целом означает случайное, неравномерное распределение молекул после деления клетки. Инструктивные модели означают, что низкого уровня экспрессия цитокинового рецептора достаточна для клетки, чтобы стать чувствительной ко внешним сигналам, как это показано для некоторых миелоидных цитокинов146. Авторегулирование и feed-forward петли также выполняют важные роли в выборе решений по клеточной судьбе. Напр., позитивная авторегуляция GATA1 стабилизирует эритроидную судьбу147, позитивная авторегуляция PU.1 стабилизирует миелоидные качественные особенности148, а сильно связанная триада GATA2, TAL1 (известен также как SCL) и FLI1, как полагают, стабилизирует состояние стволовых клеток и предшественников149,150. В feed-forward петлях вышестоящий регулятор индуцирует свою мишень непосредственно, также как и посредством промежуточного регулятора151. Feed-forward мотивы могут отфильтровывать временные сигналы и если они связаны с авторегуляцией, то могут генерировать forward momentum.


Важно, что т. наз. HSC-специфические характеристики не являются абсолютными: HSCs иногда делятся во время гомеостаза и активируются в ответ на стресс и поэтому временно проходят через пролиферативное состояние. Следует также отметить, что ранние лимфоидные предшественники (мышиные lymphoid-primed мультипотентные предшественники9 или человеческие миелоидно-лимфоидные предшественники8) обладают общими транскрипционными сетями с HSCs24, которые прежде всего склоняются в направлении B клеточной дифференцировки24, при этом в последних подавляется самообновление44,45. Хотя индукция клон-специфических транскрипционных программ может происходить в основном независимо от потери характеристик стволовых клеток, регуляторы, такие как RUNX1 могут участвовать в обеих46, подтверждая, что много tot предстоит понять о том, как клональные решения координируются с изменениями в состоянии клеток.

HSC self-renewal and cell cycle interplay


Является ли вариабельность в HSC исходах внутренне присущим свойством системы, отражением стохастического поведения, средовых влияний, изменчивостью, связанной с техникой, или комбинацией всех из них, остается спорной. Тем не менее в последние 10-15 лет, такая гетерогенность в поведении не была существенно формализована и теперь считается, что HSCs являются гетерогенными в терминах продолжительности приживления после трансплантации, свойств клеточного цикла и дифференцировки (Table 1).

Table 1: Phenotypic or functionally defined HSC subsets Full size table

HSCs, прежде всего, все отличаются по степени, с которой они само-обновляются, оценивается по количеству симметричных делений, которые HSC могут осуществлять в течение своей жизни. Операционно, сегодня у мышей и людей HSCs, которые повторно используются более 16 недель в первичных трансплантациях и, по крайней мере, во втором раунде трансплантаций, рассматриваются как долговременные HSCs17,47-50. Если клетки могут продуцировать все дифференцированные типы клеток и приживляться временно в первичных (и в некоторых случаях и вторичных) трансплантатах, то они обозначаются как промежуточные HSCs16, кратковременные HSCs или мультипотентные предшественники (MPPs)13,14,47, в зависимости от продолжительности и живучести продуцируемых трансплантатов.
Гетерогенность в отношении способности к самообновлению, по-видимому, непосредственно коррелирует со временем пребывания в покое HSCs. Исследования по сохранению метки продемонстрировали, что наиболее дремлющие HSCs (которые сохраняют метку более месяцев в покоящемся состоянии) обладают наиболее мощной и продолжительной способностью к репопуляции19,20,51-53. Параметры двух клеточных циклов обратным образом коррелируют с репопуляционной способностью: частота делений (продолжительность интервала между делениями), а также время, необходимое одиночной HSC, чтобы выйти из покоящегося состояния in vitro16,54. Конечно, уровень пред-существующей мРНК CDK6 и белка CDK6 в покоящихся HSCs прямо предопределяет кинетику выхода из покоя54, и может тем самым служить маркером состояния покоя32,54 (чем меньше CDK6 тем дольше состояние покоя). Состояние покоя ассоциирует также с высокими уровнями витамина А посредством передачи сигналов ретиноевой кислоты32, с высокими уровнями p5732,55, низкими уровнями синтеза белка32, низкой активностью MYC32,56, и может существовать как непрерывное распределение состояние молчания между наиболее покоящимися HSCs и их активированными аналогами32. Хотя покоящиеся HSCs подвергаются активации при сигналах стресса, они могут возвращаться к покою19,51, Bernitz et al. подсчитали, что четырех делений достаточно у взрослых для необратимой потери способности само-обновляться53.
Разработано несколько подходов, позволяющих выделять HSCs, базируясь на их истории делений19,20,32,51-53,57. Основным ограничением всех исследований с сохранением метки является то, что скорость симметричных делений выводится или косвенно измеряется на массовом уровне. Однако, прямые экспериментальные измерения асимметричных в противовес симметричным делениям с растворением метки необходимы, чтобы понять динамику игры внутри компартмента HSC. Новые инструменты, действующие на уровне одиночной клетки, будут разработаны для решения этой задачи. Но уже сейчас очевидно, что различия в свойствах клеточного цикла внутри пула HSC интимно связаны с функцией HSC. Связь с широкими пределами в частотах делений (в зависимости от субнабора HSC, от одного раза в мес. до двух раз в год у мышей19,51,53,58), означает, что д. существовать значительные вариации в распределении определенных субнаборов HSC для формирования крови.

Heterogeneity in HSC lineage output


Способность давать все дифференцированные типы клеток крови является фундаментальным аспектом того, что составляет HSC. Однако, сегодня считается, существует отличающееся поведение в отношении дифференцировки внутри HSC и MPP13,14 компартментов (Table 1, Fig. 1b). Используя анализ ограничения дилюции и трансплантации одиночных клеток, группы Müller-Sieburg и Eaves описали HSCs, которые отличаются своими относительными миелоидными и лимфоидными выходами15,59. Затем Jacobsen и Nakauchi группы идентифицировали HSCs, которые преимущественно дифференцируются в мегакариоциты и тромбоциты (platelet-biased)11,12. Последующие эксперименты по трансплантации подчеркнули, что одиночные HSCs обладают лишь ограниченным репертуаром выбора клональных судеб и единственными долговременными одно-клональными результатами, наблюдаемыми в этом исследовании, были тромбоциты60. Обнаруживаются ограничения и для трансплантаций одиночных, в частности, очень низкие вклады в определенные клоны клеток могут отсутствовать. Более того, клетки, дающие единственный клон, могут сохранять потенциал давать др. клоны при продолжительном воздействии в др. условиях. HSCs со склонностью давать тромбоциты при нормальном гематопоэзе, приобретают более широкий потенциал после трансплантации61, и сходные HSCs со склонностью давать тромбоциты, после трансплантации могут продуцировать миелоидные и лимфоидные клетки in vitro60. Наконец, склонные давать тромбоциты HSCs и долгоживущие предшественники тромбоцитов11,62,63 могут сосуществовать и их трудно различить.
Важно, что гетерогенность HSC является не просто стохастической, т.к. она может накапливаться в серии трансплантаций15,18,64,65, указывая на внутренне присущее программирование, молекулярная основа которого остается неясной. Эти находки имеют важное концептуальное значение, поскольку они задают вопрос, на какой клеточной стадии происходит выбор клона. Недавние доказательства подтверждают, что общая картина может быть даже более сложной с учётом разных метаболических нужд66 и способности к клональной экспансии HSCs. Имеются примеры, когда HSCs с высокой способностью к клональной генерировали субнаборы с низкой встречаемостью67, но имелись также случаи, когда HSCs с очень умеренной клональной экспансией во время первой трансплантации генерировали более мощные трансплантаты после серии трансплантаций68,69.

Rethinking blood lineage relationships


Недавние исследования на уровне одиночных клеток встали перед вопросом о путях, с помощью которых происходит дифференцировка клонов.

Single-cell assays to study potential


Выбор клеточной судьбы (Box 1) осуществляется на уровне индивидуальных одиночных клеток. Чтобы понять их регуляцию необходимы биологические подходы для тестирования клеточный функций, а также биохимические методы, исследующие молекулярные профили с разрешением уровня единичной клетки. Хотя большинство успехов достигнуто на мышах, метод трансплантации in vivo был и остается фундаментальным для нашего понимания биологии HSC в качетве единственного подхода, определяющего самообновление HSC. Последние 10 лет стали примером коллективных усилий по определению клонального потенциала одиночных клеток предшественников человека путем использования точно выверенных in vitro моделей, которые могут поддерживать дифференцировку большинства зрелых типов клеток крови. Работы групп Dick и Vyas вместе с исследованиями на мышах группы Jacobsen, подтвердили, что первое ограничение клонального потенциала не связано с разделением на лимфоидный и миелоидный потенциал, как предполагалось моделью общего миелоидного и лимфоидной предшественника (Fig. 1a), но что эти потенциалы оставались связанными в lymphoid-primed мультипотентным предшественником9,10 и с компартментами миелоид-лимфоидных предшественников (Fig. 1b). Многие др. субпопуляции, большинство с би- или одно-клональной способностью, были с тех пор обнаружены как в лимфо-миелоидной ветви70, так и в миело-эритроидно-мегакариотической ветви71-75. Но кажется, что немногие одиночные клетки обладают множественным потенциалом в компартменте предшественников. Имеются, однако, некоторые предостережения от таких интерпретаций, поскольку сильные инструктивные сигналы, предоставляемые культурам in vitro, или потенциально высокие уровни стресса, которым подвергаются HSCs во время трансплантаций одиночных клеток, могут способствовать возникновению одного и того же клона. Более того, принимая во внимание, что клетки могут быть с двойным потенциалом, исходя из их молекулярного состояния, но если происходит выбор клона до деления клетки, то будет происходить считывание (read-out) одного потенциала при функциональном испытании. Подтверждается, что выбор клона происходит раньше, чем думали прежде, и как недавно было показано на дендритных клетках76, возможно столь рано, что происходит это внутри фенотипических популяций HSC.

Single-cell transcriptional landscapes


Анализ экспрессии в одиночных клетках РНК впервые был описан 25 лет тому назад77, но оставалась очень низкой продуктивность для ряда генов и клеток вплоть появления microfluidic подходов. Эти исследования сообщают об экспрессии десятков генов в сотнях одиночных HSCs и haematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs)78, и предоставляют новую информацию об основных регуляторных системах79, новых популяциях предшественников72,73, клеточных иерархиях при нормальном и трансформированном гематопоэзе80, различии между потенциалом самообновления и программами активации клонов81, и молекулярном перекрывании между популяциями HSC, очищенных с помощью 4-х разных стратегий клеточной сортировки82. Практически невозможно выявить более 200 генов на одиночную клетку с помощью базирующихся на PCR методах, и эти гены необходимы для предопределения, тем самым ограничивается возможность новых открытий. Настоящий прорыв, с другой стороны, возможен с помощью технических инноваций, которые теперь делают возможным определение в транскриптоме RNA секвенирования (RNA-seq) в тысячах одиночных клеток.
После описания транскриптомов более чем 2600 одиночных миело-эритроидных клеток предшественников мыши83, в последующем сообщении говорится о 1600 транскриптомов в пределах от настоящих долговременных HSCs до предшественников всех основных клонов, концентрируясь на функциях, общих (generic) стволовым клеткам, таких как метаболизм и состояние клеточного цикла84. Было разработано несколько алгоритмов85-89, исходя из идеи, что транскриптомы одиночных клеток представляют собой снимок одиночной клетки, когда она пересекает ландшафт дифференцировки (Fig. 1c). Недавнее исследование гематопоэза костного мозга человека вразумительно представило компартмент HSPC90. Компьютерные предсказания подтвердили раннее клональное ограничение, установленное методом культивирования in vitro одиночных клеток, это привело авт. к модели, согласно которой приобретение клон-специфической судьбы является непрерывным процессом и лежащее в основе ограничение клеток возникает непосредственно из континуума low-primed недифференцированных HSPCs, без какого-либо главного перехода через мультипотентное и бипотентное состояния. Это подтверждается др. исследованиями71,83,87, которые подчеркивают обилие предшественников с единичным потенциалом внутри компартментов, которые на уровне популяции являются мультипотентными.
Существуют, однако, предостережения, против этой новой модели и её трудного базирования на RNA-seq одиночных клеток (scRNA-seq). Основной загадкой здесь является то, что комбинации поверхностных маркеров может быть готовой к подразделению компартмента HSPC на функционально отличающиеся субпопуляции, включая также пространство внутри предполагаемого континуума low-primed клеток при анализ с помощью scRNA-seq. Единственным возможным объяснением является то, что имеется расхождение между уровнями устойчивой экспрессии мРНК и белка. Контр-аргументом является то, что multiomics анализ высоко очищенных больших популяций HSPC обнаруживает прекрасное соответствие между мРНК и белком для большинства генов14. Возможно также, что функциональная гетерогенность HSCs, прежде всего, предопределяется на эпигенетическом уровне. Будущие измерения доступности хроматина и гистоновых меток, идеальные для разрешения на уровне одиночных клеток, могут выявить такие механизмы. Третье возможное объяснение заключается в том, что даже при очистке клеток, базирующейся белковых маркерах, сопровождаемое функциональными подходами, подтверждает четкое разделение на самостоятельные типы клеток с разными биологическими функциями, и что изменения в биологической функциональности в реальности являются значительно более постепенными, отсутствуют бинарные биологические отличия, напр., между долговременными HSCs и MPPs, а вместо этого любая индивидуальная клетка располагается неким образом вдоль непрерывного спектра. Четвертое возможное объяснение заключается в том, что современные данные методов анализа scRNA-seq не являются эффективными в определении различий между близко родственными типами клеток, поскольку многие из них обладают общими биологическими процессами (такими как клеточный цикл, метаболизм, подвижность), создавая значительную гетерогенность, которая может превосходить количества дифференциально экспрессирующихся генов между близко родственными стадиями гематопоэтического созревания. Степень, с которой ранний гематопоэз характеризуется континуумом в противовес отличающимся популяциям , следовательно, остается нерешенным вопросом.

New representations of haematopoiesis


Важной задачей является, как недавние находки могут быть приспособлены к новой графической модели, которая описывает иерархическую организацию гематопоэза. кажется ясным, что древо, в котором каждый кружочек означает каждое последующее ограничение потенциала и каждый кружок соединен с немногими другими с помощью стрелок, всё это чрезвычайное упрощение. Во-первых, кружок интуитивно рассматривается как набор гомогенных клеток со специфическими характеристиками, эта точка зрения несовместима в значительной степени с наблюдаемой экспериментально гетерогенностью. Во-вторых, эти древа указывают на ограничение набора возможных переходов между кружками, это, по-видимому, недооценка возможных ходов дифференцировки in vivo. Поскольку маркеры клеточной поверхности могут быть сильно обогащены для определенных поведений (дифференцировки, самообновления или исхода пролиферации), модель, согласно которой все клональные ветви исходят непосредственно из компартмента HSC, также, по-видимому, нереалистична (Fig. 1c). Поэтому мы полагаем альтернативное решение (Fig. 2a), согласно которому траектории дифференцировки картируются по областям, которые давно были представлены как круги, подчеркивая разнообразие возможных маршрутов и превалирование раннего выбора клона. Кроме того, важно помнить, что одна HSC должна продуцировать очень больше количество потомков, которые увеличиваются экспоненциально с каждым делением, элемент который обычно игнорируется при графическом представлении гематопоэза (including Fig. 2a). Историю делений трудно измерить и, скорее всего, они гетерогенны, но д. тем не менее быть включены в будущий экспериментальный и компьютерный анализ, что может привести к новому графическому представлению системы крови (Fig. 2b).



Figure 2: Trajectory-based visualizations of the haematopoietic hierarchy.

a, Two-dimensional visualization of early haematopoiesis. Continuous lines denote trajectories of differentiation for different types of single cells present in the phenotypic HSC compartment (grey shaded area). Along these trajectories, cells and their progeny pass through progenitor compartments commonly defined by specific combinations of cell surface markers (shaded areas). Horizontal lines represent snapshots of the lineage potential of the cells present in each phenotypic compartment (single-colour circles denote unilineage cells; two-colour circles denote bilineage cells; three-colours circles denote trilineage cells; black circles denote multipotent cells). In most progenitor compartments, the number of unilineage cells outnumbers that of bi- or trilineage cells. The figure illustrates differentiation trajectories reported in the literature so far, but their proportions may not reflect the in vivo situation. b, Three-dimensional visualization of the progeny of a single HSC. Pink, blue and grey represent the erythroid, myeloid and lymphoid lineages, respectively. Cell history, division and progenitor expansion should all be considered when modelling the differentiation journey of one HSC and all of its progeny. In an adult human, there are an estimated 3,000-10,000 HSCs, which probably divide from only once every 3 months to once every 3 years58. Humans produce an estimated 1.4 x 1014 mature blood cells per year143. The amplification from a few thousand HSCs is therefore staggering, and must include a strong contribution from a transient-amplifying compartment. Also, because there are many more terminally differentiated erythroid cells than myeloid cells, and even less lymphoid cells, all with different turnover rates, the flux into each compartment must be highly regulated.



Making blood at steady state and under stress


Помимо определения маршрутов клональной дифференцировки, ещё один важный вопрос нуждается в понимании количественного вклада HSCs и предшественников в ежедневный и непредвиденный гематопоэз.

Studying unperturbed haematopoiesis


Хотя древо гематопоэтической дифференцировки широко используется в качестве модели иерархической организации ткани, важно помнить, что это древо в основном происходит из экспериментов, которые измеряли клеточный потенциал в колонии или трансплантационном исследовании скорее, чем кагда клеточная судьба определялась во время устойчивого состояния дифференцировки. Однако, теперь благодаря одиночным клеткам, дающим два клона с использованием колоний, это не значит, что одна и та же клетка, когда она оказывается одна в не нарушенном окружении костного мозга, будет делать то же самое. Чтобы понять динамику формирования крови, клетки д. быть индивидуально мечены (напр.. с помощью retro- или lentiviral инсерций или штрих=кодов) и трансплантированы в мышей реципиентов, чтобы измерить вклад каждого клона со временем. Всё более чувствительные методы используются на мышах, приматах и людях91-95, коллективно подтверждая клональные предпочтения и/или ограничения, наблюдаемые при трансплантациях одиночных клеток. Важно, что лишь ограниченное количество HSCs продуцирует огромное большинство дифференцированных клеток при трансплантациях в соответствии с исследованиями истории делений HSCs19,20,51-53,57, которые продемонстрировали, что только очень редкие сильно дремлющие HSC могут позволить осуществить длиной в жизнь реконституцию после трансплантации.
Значительное возбуждение было вызвано новыми технологиями по выявлению клональных результатов (output) индивидуальных стволовых клеток и клеток предшественников при ненарушенном гематопоэзе96. Doxycycline-индуцированная мобилизация спящих прекрасных транспозонов в стволовых клетках и клетках предшественниках было использовано для генерации уникальных событий интеграции, которые послужили в качестве штрих-кода, который может быть отслежен с помощью секвенирования. В результате сравнение штрих=кодов в зрелых клонах после анализа быстро обменивающегося мечения позволило сделать реконструкцию поведения одиночной клетки при нативном не нарушенном гематопоэзе. В противоположность трансплантационным подходам, анализ ненарушенного гематопоэза подтвердил, что (i) MPPs вносят вклад преимущественно в миелоидный клон во время устойчивого состояния, и (ii) клетки, функционирующие как HSCs при трансплантации, не играют заметной роли в стационарном режиме гематопоэза, который вместо этого, по-видимому, управляется почти целиком клетками из компартмента MPP.
Альтернативная система генетического мечения судеб, базирующаяся на Cre-loxP-индуцированной рекомбинации кассеты транс-генного штрих-кода, недавно достигла контролируемой во времени индукции штрих=кода в одиночных клетках и продемонстрировала, что когда HSCs метятся на стадии печени плода, их производные у взрослых будут в основном вносить вклад во многие клоны97. Однако, судьба мегакариоцитов не была проанализирован и когда анализ был повторен во взрослом костном мозге, то немногие штрих-коды обнаруживались в HSCs, как и в зрелом потомстве. Принимая во внимание, что каждая из печени плода HSC делится и, следовательно, дает несколько HSCs у взрослых, то вывод о клональном вкладе индивидуальных взрослых HSCs, следовательно, остается преждевременным. Др. исследование группы Camargo61, посвященное этому вопросу, оказалось более вразумительным при использовании 30-недельного эксперимента по вытеснению метки (pulse-chase) у взрослых мышей со спящей системой штрих=кодов. 133 штрих-кода было выявлено в HSCs и, по крайней мере, в одном из четырех зрелых клонов (мегакариоциты, эритроидные, гранулоциты или B клетки). Интересно, что более половины из этих 133 HSC штрих-кодов присутствовало только в мегакариоцитах и лишь незначительное меньшинство оставшихся штрих-кодов присутствовало в более чем одном зрелом клоне. Вместе с анализом более коротких интервалов pulse-chase и всесторонним анализом RNA-seq одиночных клеток, это исследование привело к заключению, что во время гомеостатического ненарушенного гематопоэза, мегакариоциты могут возникать независимо от др. клонов и от фенотипически долговременной популяции HSC, как показывает метод трансплантаций, активно вносящий вклад в исход в виде мегакариоцитов.
В компартменте HSC транспозоновая метка может часто присутствовать как раз в одной или двух клетках, поскольку клоны HSC редко амплифицируются во время ненарушенного гематопоэза, поэтому обнаружение штрих-кода оказывается менее надежным. Поэтому примечательно, что группы Rodewald и Reizis groups98,99 установили, что компартмент HSC вносит вклад больше в продукцию мультиклональной крови, чем было определено при подходе с транспозоном. Busch et al. также подсчитали кинетику, с которой клетки проходят транзитом по своим траекториям дифференцировки. Интересно, что приток в лимфоидную ветвь в 180-раз меньше, чем в миелоидную ветвь. Приток в эритроидный клон не был оценен, но, скорее всего, он даже выше, чем в миелоидный клон (Fig. 2b). Анализ притока также выявил значительную способность к самообновлению в кратковременном HSC/MPP компартменте, что согласуется с недавним сообщением о долговременном нормальном гематопоэзе у мышей, у которых компартмент HSPC был устранен на 90%100.
Будущие подходы, скорее всего, будут использовать штрих-коды, которые экспрессируются под контролем сильного промотора и поэтому могут быть реально обнаружены с помощью scRNA-seq. Это позволит представить настоящее разрешение для анализа клональных взаимоотношений и транскриптомов одиночных клеток, предоставляя невероятную возможность определять нативную иерархию agnostic стратегий сортировки, которые были разработаны с использованием трансплантации. Др. относящийся к делу вопрос это, до какой степени лабораторные мыши будут сохраняться в стерильных, свободных от патогенов условиях, будут пригодны для моделирования гематопоэза у человека, который постоянно подвергается воздействию инфекционных агентов и функционирует дольше, чем продолжительность жизни. Долговременное наблюдение за пациентами, подвергшимися аутологичным трансплантациям, уже показали прежде неизвестные функциональные аспекты гематопоэза человека, такие как количество, стабильность и динамика индивидуальных HSCs в течение многих лет101. Фоновые соматические мутации представляют собой уникальный штрих-код, который может быть использован для реконструкции взаимоотношений клонов102,103 и может таким образом представить др. подход для изучения динамики одиночных HSPCs человека в течение продолжительного периода времени.

Haematopoiesis is flexible in space and time


Продукция крови д. быть гибкой, чтобы адаптироваться к резким изменениям в потребностях, имеются доказательства, что свойства и поведение HSC могут приспосабливаться. Гематологическое развитие эмбриона сложное104, сопровождается серией временных гематопоэтических волн в нескольких органах (Fig. 3). Важно, что плодные и у взрослых HSCs фундаментально отличаются регуляцией и поведением (rev. 105). У мышей происходит переключение с пролиферативного на покоящееся состояние в возрасте между 3 и 4 неделями, это совпадает со снижением самообновления106. У людей время перехода от плодного ко взрослому гематопоэзу отличается. Если сравнивать костный мозг взрослых, то HSCs человека в пуповинной крови новорожденных обнаруживают повышенный пролиферативный потенциал (как и у мышей), но свойства их клеточного цикла уже напоминают конфигурацию у взрослых54. Постепенно длина теломер в гранулоцитах в качестве оценки скорости делений HSCs, быстро снижается в течение первого года жизни человека107. Имеются также доказательства, что окончательно дифференцированные клетки продуцируются по-разному во время плодного и взрослого гематопоэза, поскольку значительно больше одиночных клеток предшественников из печени плода человека продуцируют два клона или более в отличие от костного мозга взрослых71. Интересно, что относительная пропорция субнаборов HSC также изменяется со временем, при этом сбалансированные HSC превалируют в печени плода, тогда как неспособные давать лимфоидный клон (известны также как склонные к миелоидным клонам) HSCs накапливаются во время старения108. Эффекты старения на HSCs и вообще продукцию крови многочисленны109. Изменения в композиции пула HSC108,110,111 , а также в молекулярных связях (circuitry) индивидуальных HSCs34,112-114 могут быть обусловлены или внешними или внутренними свойствами, включая альтерации в микроокружении, пролиферативной истории и накоплении мутаций.



Figure 3: The composition of the HSPC compartment changes in space and time.

HSPCs are found in many organs in the body across a lifetime. Cells of different colours represent distinct HSPC subsets. It is unclear whether all HSPC subsets and differentiation trajectories are present in the same proportions in each of the organs. Current evidence suggests that age-related changes result from a combination of shifts in the composition of the HSPC pool, as well as phenotypic changes in particular cell types driven by intrinsic genetic or epigenetic changes and systemic alterations of the microenvironment. AGM, aorta gonad mesonephros.

Ниша для HSC чрезвычайно сложная экосистема, которая поддерживает функцию HSC, в частности, способствует жизнеспособности и долговременному хранению пула HSC115. Как взаимодействия с нишей влияют на форму активности разных субнаборов HSC и пути дифференцировки HSCs, остается неясным. Трансплантации одиночных клеток анализ отслеживаемых клонов показали, что клоны обнаруживают стереотипическое поведение в серии раундов трансплантаций, это указывает на то, что их характерные исходы не очень сильно зависят от ниши15,59,64,65. Однако, возможно, что разные субнаборы HSC имеют разные предпочтения к нишам. Более того, при огромном большинстве HSC расположенных в костном мозге взрослых, небольшой процент HSCs высвобождается в кровь в виде паттернов, контролируемых циркадными часами116, HSCs могут также обнаруживаться в в селезенке117 и лёгких118 (Fig. 3). Роль этих ниш вне костного мозга и являются ли они специфичными для хозяина субнаборами HSCs и обнаруживает ли их способность к дифференцировке или клональной экспансии зависимость от ниш, предстоит исследовать на уровне одиночных клеток. Наконец, многие типы стрессов непосредственно влияют на функцию HSC: повреждения ДНК 40,41, воспаление119, острая и хроническая инфекция120,121, психосоциальные стрессы122, метаболические стрессы33 и ожирение123. Для большинства таких процессов информации недостаточно о молекулярных механизмах, управляющих изменениями функции HSC или клеток предшественников. Имеются также примеры, показывающие, что на клеточном уровне не все HSC или субнаборы предшественников реагируют одинаково на эти стрессы. Напр., возникновение миелопоэза, MPP2 и MPP3 управляют усиленной продукцией GMPs13,124, которые преобразуют сами себя пространственно и активируют сеть самообновления124. Поэтому мы только в начале понимания того, как реакции на стресс могут преобразовывать относительные концентрации и возможно дифференцировку траекторий разных субнаборов HSPC, и всё ещё мало известно о клеточных и молекулярных контролирующих механизмах, которые поддерживают и/или переустанавливают гомеостаз.

Implications for human disease


Наше понимание гематопоэза сегодня обнаруживает несколько сдвигов. Во-первых, демаркации между стволовыми клетками и клетками предшественниками, которые ранее рассматривались как довольно жесткие становятся всё более размытыми. Во-вторых, выбор судеб клетками по сравнению с классическими, определяемыми как би- или олигопотентные клетки предшественники, может быть более превалирующим, чем ранее полагали. В-третьих, потеря ключевых характеристик может быть в основном отделена от инициации программ специфической клональной дифференцировки. Наконец, определение клеточных судеб in vivo без необходимости в очень деструктивных процедурах трансплантации подчеркивает ранее недооцененную важность кратковременных HSC/MPPs при ненарушенном гематопоэзе. Этот и др. пересмотры нашего понимания гематопоэза как онтогенетической системы стволовых клеток имеет большое значение для диагностики, прогноза и лечения гематопоэтических болезней.
Гематология как клиническая дисциплина прошла длинный путь вплоть до первых успешных испытаний по генотерапии125,126, а также до некоторых первых всесторонних исследований генома при раке127. В отношении гематопоэтических озлокачествлений совсем недавние исследования сконцентрировались на идентификации клеточного источника, который приобретает первые соматические мутации в многоступенчатом продвижении в направлении полного расцвета злокачественности. Теперь считается, что стволовые клетки и клетки предшественники выполняют основную роль в развитии миелоидного рака (chronic myelogenous leukaemia и acute myelogenous leukaemia) и миелопролиферативных новообразований. Недавние доказательства указывают на участие HSCs и лимфоидных предшественников на ранних стадиях hairy cell лейкемии128 и лимфом129. В обзоре приводится список эффектов от каждой driver мутаций на HSC и клетках предшественниках, но ничего неизвестно, как каждая из них сможет переделывать баланс траекторий дифференцировки и генерировать сложные клональные динамические паттерны. Поскольку клеточный контекст влияний потенциального эффекта мутаций, вызывающих лейкемию, вновь распознанная размытость клеточных состояний внутри компартмента HSPC подтверждают огромную гетерогенность болезней у разных пациентов, поскольку даже два пациента, несущие идентичную мутацию основательницу, скорее всего, вряд ли возникли в идентичных клеточных состояниях. Более того, злокачественная трансформация, скорее всего, открывает новые молекулярные состояния и траектории. При острой миелогенной лейкемии, напр., лейкемические стволовые клетки определяются по химерному состоянию транскрипции10,130, и протеомные подходы на одиночных клетках демонстрируют существование различных траекторий дифференцировки у злокачественных клеток131.
Принимая во внимание всё увеличивающееся распознавание между клональным поведением нативных ненарушенных HSPCs трансплантаций, в противовес ксенотрансплантации человеческих лейкемических клеток будут иметь сходные ограничения, при которых использование лейкемичных клеток в трансплантациях могут индуцировать клеточное поведение, которое никогда не возникает у пациентов людей. Прекрасные перспективы могут быть обнаружены на новых моделях, которые смогут переносить трансплантации без облучения132 и использовать косточки, начиненные стромальными клетками костного мозга человека133,134. Тем не менее настоятельно необходимы прямые отслеживания болезни у человеческих пациентов. Необходима тщательная подготовка кагорт пациентов и новые технологии скрининга, включая multiomic технологии на одиночных клетках, чтобы определять клеточное состояние, а также мутации индивидуальных клеток, как это было продемонстрировано недавно гена слияния BCR-ABL, обнаруживаемого у большинства пациентов с хронической миелогенной лейкемией135.
Трансплантации костного мозга вряд ли останутся важными для терапии у большинства пациентов с лейкемией и с прогрессом в области клеточной и генной терапии могут быть найдены значительно более пригодные способы. Многообещающим подходом становится продукция HSCs из др. типов клеток путем использования регуляторных процессов, важных для гематопоэза во время развития, как это иллюстрируется недавней генерацией стволовых клеток с долговременной способностью приживления из плюрипотентных клеток человека и эндотелиальных клеток взрослых мышей136,137. Лучшее понимание состояний HSC и выбора клеточных судеб может предоставить новые возможности для разработки протоколов по амплификации in vitro HSCs138-140, и также для облегчения оптимизации протоколов для мощного геномного инженеринга HSCs с огромным потенциалом для лечения широко распространенных болезней. Расширение клинического применения со значительными результатами благодаря лучшему пониманию потенциала самообновления и дифференцировки HSPCs, вместе с мощными алгоритмами предсказаний из молекулярных профилирующих данных для оценки эффективности продуктов для клеточной терапии.