В последнее время стало возможным непосредственно манипулировать с генами организма во время раннего развития, чтобы генерировать, напр., мышей с генетическими модификациями. Такие трансгенные мыши являются мощными модельными системами для изучения болезней человека¹, но обычно и эти подходы затратны и требуют много времени. В журнале Nature, Chang et al.² описывают альтернативный подход по построению сложных мышиных моделей для изучения функции и болезней переднего мозга.

Read the paper: Neural blastocyst complementation enables mouse forebrain organogenesis

При обычных трансгенных подходах гены модифицируются в embryonic stem (ES) клетки, которые являются плюрипотентными - они могут давать все типы клеток тела животных. Генетически преобразованные клетки затем инъецируются в мышиный эмбрион на ранних ст. развития, на ст. бластоциста. Возникшие в результате химерные мыши, у которых некоторые клетки генетически модифицированы, а некоторые нет. Если яйцеклетки или спермии животных содержат генетическую модификацию, то они могут давать потомство, у которого все клетки модифицированы (Fig. 1a). Этот подход, хотя и недавно усиленный технологиями редактирования генов, такие как CRISPR-Cas9, остается дорогостоящим и трудоёмким. Более того, несмотря на генетическую модификацию преобразованные гены экспрессируются только в определенном типе клеток, этот подход ограничивается генами, которые существенны для раннего эмбрионального развития.

Figure 1 | Two ways to generate genetically modified mice. a, Genetically modified mice are usually generated by engineering mouse embryonic stem (ES) cells to harbour a desired mutation, and injecting the modified cells into a host embryo at the blastocyst stage. The embryo is then implanted into a foster mother. The donor and host ES cells mingle, giving rise to chimaeric mice consisting of both cell lineages (indicated by colouring). By breeding with wild-type mice, chimaeric animals can pass the mutation down through their eggs or sperm, producing offspring in which all cells are genetically modified. b, Chang et al.2 describe an alternative approach called neural blastocyst complementation to produce mice whose forebrain cells all carry a desired genetic modification. The authors generated host embryos in which diphtheria toxin subunit A was expressed only in forebrain progenitor cells - these cells therefore died, leaving a vacant niche. The group injected the host blastocysts with donor ES cells that harboured a genetic modification of interest, and implanted them into foster mothers. The donor cells filled the vacant niche, repopulating the forebrain (but not other brain regions) of the resulting mice.

Более 20 лет тому назад в нашей лаб. была предложена техника. наз. blastocyst complementation, для преодоления этих ограничений в иммунной системе³. Этот подход базируется на том факте, что если развитие определенного органа у хозяина нарушено, то создается пустующая ниша, которая может быть заполнена тканью, происходящей из вновь индуцированных ES клеток. В работе авт. использовали RAG2-дефицитных мышей, которые не имеют зрелых иммунных клеток, наз. T и B клетками. Они показали, что эмбрионы этой линии могут давать мышей, которые генерируют нормально T и B клетки, если в бластоцист инъецировали дикого типа мышиные ES клетки. Более того, эти иммунные клетки были исключительно донорского происхождения.

Комплементация бластоциста с тех пор используется для генерации хрусталика глаза⁴, почек⁵ и сердца⁶. Эта техника была также использована для генерации поджелудочной железы за счет в основном клеток от др. вида, путем инъекций мышиных клеток в бластоцисты крыс, неспособные давать поджелудочную железу и vice versa⁷. Такого типа животные, наз. межвидовыми химерами, обладают огромным потенциалом как для понимания фундаментальных принципов биологии, так и для регенеративной медицины, целью которой в конечном итоге является выращивание органов, несущих геном специфичного индивида.

Chang et al. разработали подход, наз. neural blastocyst complementation (NBC), который использует разрушение в развивающемся переднем мозге мыши - в регионе, который д. генерировать гиппокамп головного мозга, кору головного мозга и обонятельные луковицы среди прочих структур (Fig. 1b). Они скрещивали из существующей олинии трансгенных мышей, чтобы получать эмбрионы, у которых diphtheria toxin subunit A экспрессируется специфически в клетках предшественниках переднего мозга. Это приводит к гибели этих клеток и поэтому мыши лишены структур переднего мозга. Но дикого типа ES клетки инъецировали в бластоцисты этой линии, чтобы заселить ниршу переднего мозга. Авт. установили, что структуры переднего мозга у возникающих в результате животных восстанавливались. Такие мыши были неотличимы от контрольных по набору поведенческих реакций.

Исследователи затем показали, что этот подход может быть совмещен с CRISPR-Cas9 редактированием донорских ES клеток, как способ восстановления функции интересующих генов в переднем мозге. Для проверки принципа они сконцентрировались на гене doublecortin (Dcx), кодирующем белок, участвующий в миграции нейронов и вызывающий нарушения развития коры головного мозга, если он мутантен у пациентов. Получемые химеры с использованием Dcx-дефицитных донорских ES клеток обнаруживали дефекты гиппокампа, которые воспроизводили нарушения, наблюдаемые у трансгенных мышей с отсутствием Dcx⁸.

NBC подход может облегчить исследования развития головного мозга и болезней несколькими способами. Во-первых, генерация трансгенных животных, у которых обе копии гена мутантны, требует многих ступеней разведения: даже если обе копии гена мутантны в инъецируемых ES клетках, химерны мыши д. быть скрещены с партнерами дикого типа, чтобы давать потомство с одной нормальной копией и необходимы дополнительные шаги, чтобы продуцировать животных, у которых обе копии мутантны. Необходимость в этих ступенях разведения устраняется при NBC. Сходным образом, многочисленные модификации могут быть внесены в донорские ES клетки в то же самое время при использовании CRISPR-Cas9. Это может ускорить исследования при нарушениях, вызываемых более одного гена, таких как нарушения спектра аутизма и может улучшить наше понимание межгенных взаимодействий во время развития.

Во-вторых, хотя Chang et al. выбрали устранение предшественников переднего мозга, тот же самый принцип может быть использован и для др. регионов или типов клеток в ЦНС. Более того, альтернативные подходы по целенаправленному удалению генов могут также использоваться, такие как удаление генов, существенных для развития специфических регионов головного мозга, или может вызывать усиленную экспрессию белков, которые индуцируют запрограммированную гибель клеток. Однако, из-за того, что большинство белков, регулирующих развитие, играют роль в разных типах клеток и на ряде эмбриональных стадий, необходимы гарантии при планировании стратегий целенаправленного удаления, чтобы избежать нежелательных эффектов.

В-третьих, это исследование открывает возможность генерации межвидовых химер в ЦНС. В частности, генерации химер между человеком и животными, в которых клетки человека интегрируются в нейральные связи (circuits) животных, это может позволить изучить некоторые специфичные для человека свойства головного мозга в более физиологических условиях⁹. Однако, необходимо учитывать этическое значение этого исследования¹⁰. В самом деле, организации, такие как International Society for Stem Cell Research рекомендуют ограничить эксперименты, по инкорпорации клеток человека животным в ходе раннего развития, как и специализированный обзор ¹¹.

Имеются технические затруднения. Хотя клетки человека, такие как нервные предшественники успешно трансплантирую в эмбрионы мышей для получения химерных тканей¹², значительно труднее эффективно сгенерировать целый химерный организм с помощью инъекций в бластоцист. Этот барьер может быть преодолен с помощью стратегии, которая предоставляет избирательные преимущества или улучшает жизнеспособность донорских клеток человека или с помощью разработки техники лучшего мониторинга состояния линий плюрипотентных стволовых клеток человека. Напр., плюрипотентные стволовые клетки человека, которые согласно своему основному состоянию известны как нативные (naive) и могут трансплантироваться в бластоцисты свиней и коров, но обнаруживают мало способности формировать химеры; напротив, плюрипотентные стволовые клетки в разных клеточных состояниях, известные как, промежуточные, могут быть трансплантированы и генерируют дифференцированное потомство¹³.

Тем не менее, модель, разработанная Чангом и др., обеспечивает мощный инструмент для нейробиологов, чтобы изучить развитие головного мозга и эволюцию млекопитающих . Это несомненно расширит нашу способность исследовать механизмы психоневрологических нарушений.