Посещений:
РАЗВИТИЕ ХРУСТАЛИКА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ



Сети регуляторных генов и передача сигналов

Signaling and Gene Regulatory Networks in Mammalian Lens Development
Ales Cvekl, Xin Zhang
Trends in Genetics Volume 33, Issue 10, p677-702, October 2017 DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.tig.2017.08.001



Figure 1 The Earliest Stages of Vertebrate Lens Formation from the Pre-Placodal Ectoderm. (A) Model of chicken lens cell specification based on the inductive signaling of BMP, the necessity of FGF signaling, and the inhibitory role of Wnt signaling. The precursors for lens and olfactory placodes are intermingled and surround the anterior neural plate domain. Additional cell types, including cells moving into the neural plate/tube and outside towards the ectoderm, are not shown for simplicity. (B) The choice between lens/olfactory and adenohypophyseal cell fates is regulated by Shh signaling promoting adenohypophyseal placode formation, and is temporally regulated the subsequent activation and inhibition of BMP signaling necessary for olfactory placodal progenitors. Sustained BMP signaling is required for lens cell formation. (C) Schematic of the chicken embryo at the neural fold stage (4-5 somites). Panels (A-C) are adapted from [8].









Развитие хрусталика глаза представляет собой подходящую систему для изучения регуляторных механизмов, управляющих выбором клеточных судеб, внеклеточными сигналами, клеточной и тканевой организацией и подлежащими регуляторными сетями генов. Регулируемые в пространстве и времени домены BMP, FGFи др. сигнальных молекул на ст. поздней гаструлы и ранней нейрулы генерируют пограничные регионы между нервной пластинкой и не нейральной эктодермой появляются многие типы клеток, включая клетки предшественники хрусталика, которые появляются и лежат в основе формирования инициальной ткани. Передача внеклеточных сигналов и факторов транскрипции, связанных с ДНК, управляют морфогенезом хрусталика и оптического бокала. Pax6, c-Maf, Hsf4, Prox1, Sox1 и немногие дополнительные факторы регулируют экспрессию структурных белков хрусталика, кристаллинов. Экстенсивное общение между разными наборами сигнальных путей контролируют сложность и порядок процесса морфогенеза хрусталика и прозрачность хрусталика.

Trends


  • Recent progress based on RNA-seq and chromatin immunoprecipitation with deep sequencing (ChIP-seq) has provided novel insights into the chromatin and RNA expression landscape dynamics, and can be applied to studies of pre-placodal cells and their populations.
  • Innovative technology can be used to visualize movements and cell fate decisions at the single-cell and single-molecule levels.
  • Genome engineering using the CRISPR/Cas9 system accelerates studies of gene function, lncRNA functions, and distal enhancers.
  • The nuclear organization changes dramatically during lens fiber cell differentiation as a result of the preparation of nuclei for their organized degradation.
  • Development-controlling and congenital cataract-causing genes can be reliably predicted using the iSyTE database.


  • The 'Invisible' and 'Visible' Stages of Lens Development


    Развитие хрусталика может быть подразделено на 'невидимую' стадию (Figure 1), когда формируются клетки ранних предшественников хрусталика, после чего следует серия 'видимых' морфогенетических процессов, впервые обнаруживаемых, когда появляются будущие билатеральные глазные пузырьки (optic vesicles) из передней нервной складки и симметрично подступают к эктодерме. чтобы сформировать пару хрусталиковых плакод (Figure 2). На клеточном уровне взаимодействие внеклеточных сигналов (Table 1, Key Table), обычно обозначаемое как индуктивные процессы, диктуют выбор клеточных судеб из общих клеток предшественников в направлении хрусталика, обонятельного эпителия и части аденогипофиза и возможно эпителия роговицы и не нейральной эктодермы [8, 9, 17]. В ходе развития хрусталика трансмембранные рецепторные киназы, включая serine/threonine и tyrosine киназы, связываются с помощью bone morphogenetic factors (BMPs) и fibroblast growth factors (FGFs), соотв., наиболее часто используются для регуляции этих индуктивных процессов [8, 9, 17]. На молекулярном уровне качественные особенности типов клеток детерминируются с помощью комбинированной экспрессии клон-специфичных факторов ('локальных активаторов', Table 2) и сигналами регулируемых связывающих ДНК транскрипционных факторов (SRTFs, Table 3) [18], включая их пост-трансляционные модификации (PTMs) также как и их взаимодействия с модификаторами и ремодельерами хроматина [19-21].

    Table 1.Signal Transduction Pathways in Lens Developmenta

    Table 2 Summary of Selected DNA-Binding Factors and Their Roles in Lens Development Table 3 Summary of Selected SRTFs and Their Roles in Lens Development

    aFactors shown in bold font belong to the microphthalmia-anophthalmia-coloboma group [237].

    The 'Invisible' Beginning of Lens Development


    Морфогенез хрусталика может быть отслежен обратно к ст. нервной пластинки ранней ст. эмбриогенеза и к её трем производным эктодермы доменам, включая не нейральную эктодерму, нервную пластинку и третью промежуточную зону, известную как 'граница' между нервной пластинкой и не нейральной эктодермой (Figures 1 A,B) [7, 17, 22]. Образование пограничного региона и формирование его передне-заднего паттерна происходит в передний преплакодный регон (aPPR) и сзади в нервный гребень (NC) [7, 8, 17, 22]; , однако, данные для эмбрионов млекопитающих скудныe. Имеются доказательства отсутствия демаркационной границы; вместо неё существует перекрывание между проспективными нервными, передними пре-плакодными и эпидермальными клетками [8]. Образование границы зависит от планарных сигналов от передней части нервной пластинки и не нейральной эктодермы [8], также как от дорсо-латеральной и головной мезодермы [23], посредством передачи сигналов BMP и секреции одного или нескольких членов семейства FGF (напр., FGF8) от нервной пластинки. BMP4 и BMP7 участвуют, а передача сигналов BMP негативно модулируется с помощью Noggin, чтобы достичь 'оптимальных' уровней, необходимых для формирования границы и PPR. Передача сигналов FGF необходима, чтобы супрессировать формирование не нейрональной эктодермы [24], но её добавочная роль в формировании PPR остается неизвестной. Передача сигналов Wnt и ретиноевой кислоты (RA) внутри границы также участвует в контроле выбора клетками судеб в направлении формирования aPPR или NC. Блокирование передачи сигналов Wnt сочетается с формированием преплакоды (PPR), а активная передача сигналов Wnt приводит к образованию нервного гребня [23, 25-30]. Сходным образом, передача сигналов RA действует здесь как широко распространенный механизм постериоризации [7, 22, 31-34] (Table 1).
    Анализ экспрессии генов выявил несколько маркеров, экспрессирующихся в ранней PPR, а именно, гены, кодирующие гомеодоменовые (HD) транскрипционные факторы, такие как Six1, Six2 и Six4 [35-37], а также их партнеры по связыванию Eya1, Eya2 и Eya3, и Eya4 фосфатазные коактиваторы [38, 39]. Далее, HD факторы Dlx2, Dlx5, и Dlx6, forkhead factor Foxg1, zinc-finger factor Gata3 и HMG-box factor Sox2 также появляются в той же самой области; однако, домены их экспрессии более изменчивы, чем те из группы Six/Eya. Примечательно, что эти гены экспрессируются во многих др. регионах развивающегося эмбриона и что потеря функции этих индивидуальных генов у мышей не нарушает образование хрусталика на пре-плакодной стадии. Это наблюдение можно, скорее всего, приписать их функциональному перекрыванию [40-46]. Формирование передне-заднего паттерна PPR характеризуется направленными перемещениями клеток, экспрессирующих Gbx2 и Otx2 HD белки, в направлении заднего или переднего регионов [47] посредством взаимной их репрессии [48]. Экспрессия Pax6 запускается в передней субпопуляции PPR клеток и эти клетки формируют плакоды. Напротив, Pax6-негативные клетки вносят вклад в окружающий эпидермис [44, 49, 50]. Образование aPPR индуцируется с помощью BMPs из lateral-to-ventral не нейрональных эктодермальных клеток, это параллельно ингибирует образование нервной ткани. FGFs генерируются телэнцефалическими предшественниками из передней части нервной пластинки и ингибируются с помощью передачи сигналов Wnt из задней части нервной пластинки и подлежащей мезодермы (Figure 1 andTable 1) [8]. Доказательства, что передача сигналов BMP участвует на самых ранних стадиях развития хрусталика, подтверждаются отсутствием образования хрусталика у Bmp4-/- эмбрионов мышей, даже когда обонятельные плакоды образуются нормально [51], а у эмбрионов, мутантных по кондиционным инактивирующим типа I BMP рецепторным генам Bmpr1a и Acvr1, кодирующим serine/threonine киназы в проспективной хрусталиковой эктодерме [52]. Сходным образом, подавление передачи сигналов FGF в экспериментах с эксплантами снижает экспрессию Pax6, обнаруживаемую посредством репортерного гена, демонстрируя, что передача сигналов FGF контролирует эмбриональную индукцию хрусталика [53]. Недавно, кондиционная инактивация Bmp4 выявила необходимость глазного пузырька как источника этого морфогена для индукции хрусталика [54].
    Клетки первоначально представляющие aPPR дают многие мигрирующие предшественники [47], которые в конечном счете дают начало плакодам аденогипофиза, обонятельным и хрусталиковым (Figure 1). Было предположено, что формирование хрусталиковой плакоды является состоянием по умолчанию для клеток, продуцирующих aPPR, , по крайней мере, у эмбрионов кур [55]. Данные показывают существование общего пула клеток предшественников для хрусталиковой и обонятельной плакоды и что образование обонятельных клеток нуждается во временном подавлении передачи сигналов BMP [24]. Недавние исследования идентифицировали два нейропептида, nociceptin и somatostatin, в качестве молекул, индуцирующих хрусталиковую и обонятельную плакоды у кур [56]. Клональный анализ клеток, представляющих aPPR выявил подавление Dlx5 в хрусталиковых по сравнению с клетками обонятельных предшественников [57], а Dlx5+ клетки в конечном итоге в целом исключались из хрусталиков [49]. Было предположено, что некоторые хрусталик-подобные Pax6+ клетки предшественники, а именно те, что расположены по периферии, позднее дают эпителий роговицы [58]. У рыбок данио формирование паттерна PPR и передача сигналов сходны с таковыми у модельных эмбрионов кур [59]. Кроме того, исследования на рыбках данио и курах подтвердили, что предшественники аденогипофиза нуждаются в высоких уровнях передачи сигналов sonic hedgehog (Shh) [59-62]. Напротив, более дистальные клетки предшественники хрусталика не нуждаются в этом морфогене (Figure 1) [59, 60, 62]. Мы полагаем. что aPPR представлена перемешанными клетками, которые благодаря миграции и механизмам само-сортировки обеспечиваются белками клеточной адгезии, конвергируют в самостоятельные домены внутри передней эктодермы, которые становятся различимыми как эктодермальные утолщения, известные как черепно-лицевые плакоды [24, 49, 63, 64].
    Значительно меньше известно о формировании границ и aPPR у млекопитающих [17, 22, 65]. Экспрессия трех связывающих ДНК транскрипционных факторов, включая Foxg1 [45], Otx2 [48] и Six3 [44], как было установлено, происходит у эмбрионов мышей на ст. (E)8 (стадии 1-7 сомитов) презумптивной границе и PPR перед началом экспрессии Pax6 [66] (Table 2). Последующая активация экспрессии Pax6 в aPPR и её ауторегуляция генерируют движущие силы для каскада дифференцировки всего хрусталика. Интересно, что эмбриональные стволовые клетки человека (ES cells) могут дифференцироваться в клетки, экспрессирующие пре-плакодные маркеры, и их производные путем последовательного подавления и активации передачи сигналов BMP [67, 68], которое также включает мощное образование клеток предшественников хрусталика, управляемое с помощью BMP4/BMP7/FGF2 [69]. Итак, сложные данные подтверждают идею, что эволюционно законсервированные механизмы генерируют aPPR у позвоночных; но необходимы дальнейшие исследования для выделения всех типов клеток, присутствующих в пре-плакодной эктодерме, определение их транскриптома на уровне одиночных клеток и на уровне объединенного потомства и для выяснения тканевой спецификации в направлении плакод гипофиза, обонятельных и хрусталиковых, нейральной и не нейральной эктодермы и нервного гребня за счет активации или репрессии внеклеточной передачи сигналов.

    The 'Birth' of 'Visible' Lens Embryology


    По ходу образования нервных складок проспективное нейроэктодермальное поле сетчатки подразделяется на два билатеральных региона, морфологически обозначаемых как 'глазные борозды' ('optic sulcus'),которые углубляются, чтобы сформировать глазные пузырьки. Когда глазные пузырьки достигают поверхностной эктодермы, то мезенхимные клетки, располагающиеся в пространстве между эктодермой и нейроэктодермой (периокулярной мезенхимой, POM) исключаются. Как только происходит контакт нейроэктодермы и эктодермы, то появляется утолщение эктодермы в качестве хрусталиковой плакоды (Figure 2A,B). Реципрокная инвагинация хрусталиковой плакоды с глазным пузырьком закладывают 3D структуры инициального хрусталика и глазного бокала (Figures 2 B-D). Хрусталиковый пузырек состоит из хрусталиковых клеток предшественников, находящихся под влиянием передачи сигналов posterior BMP и FGF, а глазной бокал является источником сигналов для дифференцировки клеток хрусталиковых волокон (Table 1). Глазной бокал формирует свой паттерн вдоль проксимо-дистальной оси в виде множественных доменов: клетки предшественники будущей нейральной сетчатки, проспективный пигментный эпителий сетчатки и астроциты для будущего глазного нерва (Figure 2C) [70]. Передние клетки хрусталикового пузырька дают хрусталиковый эпителий, тогда как задние клетки хрусталикового пузырька удлиняются и продуцируют клетки первичных хрусталиковых волокон (Figure 2E), которые формируют ядро эмбрионального хрусталика (Figure 2F). Митотическая активность в хрусталиковом эпителии создает новые клетки и этот процесс приводит к заднему смещению клеток в направлении экватора хрусталика. Экваториальная область 'переходной' зоны представлена 6-7 клетками, в которой задние клетки выходят из клеточного цикла и дифференцируются во клетки вторичных хрусталиковых волокон (Figure 2G) [71, 72]. Эти процессы 'позднего'-начала хрусталиковой дифференцировки рассмотрены в обзорах [2, 73-75].
    Ранее мы рассмотрели, как будущие хрусталиковые клетки возникают из района границы/aPPR и специфицируются как индивидуальные клетки вместе с др. предшественниками, прежде чем глазной пузырек физически окажет воздействие на наружную эктодерму/aPPR. Возникает два вопроса: каковы клеточные и молекулярные механизмы, контролирующие расположение хрусталиковой плакоды и глазного пузырька и какие дефекты в глазном пузырьке будут нарушать формирование хрусталиковой плакоды? Разные экспериментальные подходы от культур тканевых эксплантов до генетической потери функции в исследованиях на мышах, предоставили ключевую информацию для этого сложного процесса. Классические эмбриологические исследования были осуществлены с использованием поздней гаструлы, стадий нервной пластинки и нервной складки у эмбрионов Xenopus laevis и с использованием разрезанных на мельчайшие куcочки ткани, продемонстрировали, что хрусталики могут быть cформированы в отсутствии глазного пузырька; однако, хрусталики в конечном итоге формировались в области прямого контакта между нейроэпителием будущего глазного бокала и проспективной эктодермой хрусталика [1]. Разрастание хрусталикового пузырька приводило к исключению POM из области контакта (Figures 2 A,B). Наилучшим молекулярным объяснением того, как POM подавляет образование хрусталика [76] является тот факт, что передача сигналов TGF-β и Wnt от POM ограничивает домен экспрессии Pax6 [77].
    Исследования потери функции многих генов мыши, экспрессирующихся в раннем глазном пузырьке, включая транскрипционные факторы Lhx2, Pax6 и Rax, предполагаемый РНК-связывающий белок Mab21l2, и retinaldehyde dehydrogenase Raldh2, обнаружили критические не клеточно автономные функции этих генов для образования хрусталиковой плакоды. Гомеобоксный Rax ген экспрессируется в проспективном retina-hypothalamus поле нервной пластинки [78]. Rax нулевые эмбрионы не образуют какого-либо глазного и соотв. не формируют глазного бокала, приводя к к тяжелому анофталмическому фенотипу [79]. Lhx2 мутанты обнаруживаю дерепрессию генов, специфичных для таламического возвышения и передне-дорсальной части гипоталамуса, это ассоциирует с неправильной локализацией глазного пузырька [80]. У Lhx2 нулевых эмбрионов экспрессия Pax6 отсутствует в проспективной хрусталиковой эктодерме, тогда как экспрессия Pax6 в глазном пузырьке остается неизменной [81]. Возможно, что первичной причиной этого большого дефекта может служить снижение экспрессии BMP4 и BMP7 [82]. Контролируемое в пространстве и во времени истощение Pax6 в глазном пузырьке также нарушает образование плакоды даже, если персистирует экспрессия Pax6 у мутантных эмбрионов [83]. Соматическая потеря Mab21l2 также подавляет формирование плакоды хрусталика [84]. Идентифицированы многие мутации гена человека MAB21L2 [85, 86]и были протестирован механизм его действия у рыбок данио [86]. Mab21-like семейство (MAB21L1 и MAB21L2) включает cGMP-AMP synthase (cGAS), а недавний структурный анализ MAB21L1 белка выявил потенциальный nucleotidyltransferase домен [87]; тем не менее помимо возможности, что MAB21L2 соединяется с Smad1 [88], ничего не известно о его молекулярной функции. Напротив, хотя Mab21l1 экспрессируется на высоком уровне в инвагинирующей хрусталиковой плакоде, её образование не нуждается в этом гене [89]. Сходным образом, потеря функции Rax и Pax6 у модельных животных д. исследоваться шире в направлении идентификации генов с нарушенной регуляцией как в глазном пузырьке, так в поверхностной эктодерме, с упором на выяснении роли передачи сигналов BMP, FGF, Notch и Wnt.
    Появившиеся исследования также показали, что передача сигналов RA выполняет важные функции в формировании хрусталиковой плакоды, начиная с её роли в posteriorization пограничного региона, где она регулирует экспрессию транскрипционного фактора Tbx1, корепрессора Ripply3, и Fgf8, чтобы заложить границы внутри PPR [33]. У Xenopus, Raldh2 (энзим, катализирующий окисление retinaldehyde в RA) и lipocalin-type prostaglandin D2 synthase (LPDGS, регулятор транспорта RA) экспрессируются вокруг передней части нервной пластинки и их экспрессия non-cell-autonomously регулируется с помощью zinc-finger транскрипционного фактора Zic1, экспрессирующегося в передней части нервной пластинки [90]. Др. домен экспрессии Raldh2, идентифицированный у мышей, включает POM, соседствующую с височной частью глазного пузырька, которая в этом случае действует паракринным способом на глазной пузырек [91]. На ст. E8.75 у эмбрионов мыши Raldh2-/- глазные пузырьки выглядят нормально, тогда как на ст. E10.25 не обнаруживается образование раннего глазного бокала, при этом отсутствует утолщение, противостоящей поверхностной эктодермы [92]. Будучи необходимой для нормального морфогенеза хрусталика, передача сигналов RA безусловно регулирует многие процессы внутри PPR и глазного пузырька (Table 1).
    Наконец, между E8.5 и E8.75, 'стадия' , представленная временной популяцией клеток, формирующих aPPR, Pax6, по-видимому, контролирует несколько функций, которые управляют образованием хрусталиковой плакоды и последующими стадиями морфогенеза хрусталика. Pax6 на сегодня единственный известный ген, существенный для формирования общих клеток предшественников для аденогипофиза, обонятельных луковиц и хрусталика, а ьакже для образования хрусталиковой плакоды, как показывает анализ эмбрионов Pax6-/- [6] и слега задерживаемых в развитии кондиционных мутантов [3]. В соответствии с этими данными по потере функции, инъекции Pax6 кДНК эмбрионам Xenopus на ст. двух клеток вызывали многочисленные эктопические хрусталики вне связи с нервной тканью [93], точно также эктопические глаза возникали после инъекции на 16-клеточной стадии [94]. Кроме того, эктопические хрусталики могут генерироваться с помощью экспрессии Six3 на 2-4-клеточной стадии у эмбрионов medaka в области слуховой плакоды за счет клеточно не автономного процесса [95].
    Роль хроматиновых и гистоновых пост-трансляционных модификаций в образовании хрусталиковой плакоды изучали посредством инактивации двух гистоновых ацетилтрансфераз CBP и p300 в проспективной хрусталиковой эктодерме. CBP-/- p300-/- эмбрионы обнаруживали существенное снижение ацетилированного гистона H3 lysine 18 (H3K18ac) и H3K27ac PTMs в мутантной эктодерме без каких-либо признаков образования хрусталиковой плакоды [96], как это было обнаружено ранее у Pax6-/- эмбрионов [3]. Далее, CBP [97] и p300 [97, 98] являются белок-связывающими партнерами для Pax6. Принимая во внимание, что многие гены обычно подавляются у Pax6, CBP и p300 мутантов, разумно предположить механическую связь между Pax6 и энхансерами активации [96]. Важно, что перекрывание между Pax6-/- и CBP-/- p300-/- подавляемыми генами, касается хорошо известных регуляторов морфогенеза хрусталиков (напр., c-Maf, Meis1, Pitx3, Prox1 и Sox2) и группы кристаллиновых генов [96, 99]. Итак исследование экспрессии Pax6 и регулируемых непосредственно им генов во время перехода от aPPR к хрусталиковой плакоде и и альтернативные состояния смогут поспособствовать расшифровке молекулярных механизмов образования клеток хрусталика.
    Регуляция экспрессии Pax6 в хрусталиковых и др. типах клеток, включая клетки предшественников сетчатки, панкреатические клетки и клетки радиальной глии, является важным предметом изучения сегодня [100, 101]. Ранние исследования показали, что мышиный Pax6 локус находится внутри региона в 420 kb хромосомы 2 [102] и содержит ландшафт из переплетающихся дистальных энхансеров, многие из которых очень консервативны в ходе эволюции позвоночных [103]. Чтобы установить начало экспрессии Pax6 в aPPR, необходимо сначала установить самые ранние активные энхансеры и соотв. транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию Pax6 и связать их с путями внеклеточной передачи сигналов, описанных выше. Поскольку транскрипция Pax6 продолжается в течение всех последующих ст. развития хрусталика и др. происходящих из эктодермы глазных структур (эпителии роговицы и слезные железы), то возможно, что может быть использован любой дополнительный энхансер и/или 'запущенные' энхансеры могут быть выведены из эксплуатации. Экспрессия Pax6 в хрусталике происходит с вышестоящего промотора P0, тогда как нижестоящий промотор P1используется в сетчатке и головном мозге (Figure 3A) [104, 105]. Два дистальных энхансера для локуса Pax6 были идентифицированы в эволюционно законсервированных не кодирующих регионах (ectodermal enhancer, EE [106, 107]), и посредством анализа DNase I hypersensitivity и транслокаций ДНК человека в 3'-регион локуса PAX6, наз. SIMO [108, 109]. Геномная делеция EE частично разрушает экспрессию Pax6 [110], способствуя систематическому анализу 5'-EE и 3'-SIMO (Figure 3A), включая их компаундные эффекты [100]. Имеющиеся данные подтверждают идею, что EE и SIMO функционируют как теневые энхансеры и используют некоторые общераспространенные факторы, включая Meis1/2 и Pax6 [100] (Figure 4B); несмотря на это, соединяются ли эти энхансеры также с SRTFs, стоящими ниже передачи сигналов BMP и FGF и запускают ли экспрессию Pax6, остается неизвестным (Figure 3B).
    У некоторых позвоночных формируются 'третьи' хрусталики внутри теменного (pineal) глаза и одиночные или множественные эктопические хрусталики формируются в головной области в результате специфических мутаций и генетических манипуляций. Теменной глаз обнаруживается у большинства ящериц, лягушек, миног и некоторых видов рыб, и является чувствительным к свету благодаря оригинальному механизму фототрансдукции [111], который включает parapinopsin [112], незрительный чувствительный к зеленому свету опсин, наз. parietopsin, и чувствительный к голубому pinopsin [113]. В противположность происходящим из эктодермы боковым хрусталикам, теменные хрусталики образуются из нейроэктодермы и состоят из одиночного слоя удлиненных клеток; тем не менее они экспрессируют нормальные кристаллины [114, 115]. Нейроэктодермальное происхождение теменных хрусталиков может быть связано с наблюдениями, что нейральная сетчатка способна трансдифференцироваться в хрусталики [116]. Недавно было показано, что передача сигналов Notch супрессирует этот процесс в сетчатке кур [117]. Как описано выше, передача сигналов Shh и Wnt подавляет образование клеток хрусталика (Table 1). Т.о., не удивительно, что имеются venанты, которые генерируют один или более эктопических хрусталиков вне сетчатки. У мутантов рыбок данио you-too (yot) нарушена нормальная функция Gli-2, негативного регулятора передачи сигналов Shh, и в результате хрусталики развиваются в области плакоды аденогипофиза [61, 118]. У кур каноническая передача сигналов Wnt/β-catenin обеспечивает репрессию хрусталиков с помощью клеток NC, а TGF-β снижает функцию и экспрессию Pax6 [77]. Напротив, потеря β-catenin в периокулярной эктодерме мышей приводит к образованию множественных рудиментарных хрусталиков [119, 120]. Чтобы противодействовать передаче сигналов Wnt, Pax6 может формировать 'защитный блок' посредством прямой активации двух негативных регуляторов передачи сигналов Wnt, Sfrp1 и Sfrp2 [120]; однако, ни один из этих белков не участвует в модуляции канонической передачи сигналов Wnt во время этой стадии формирования хрусталика [121]. Эти исследования иллюстрируют вовлечение многих сигнальных путей и их взаимодействие в обеспечении образования хрусталика, ограниченное областью, определяемой разрастанием глазного пузырька.

    Lens Morphogenesis and GRNs


    3D морфогенез хрусталика осуществляется за счет многих взаимосвязанных процессов, включая реципрокную инвагинацию хрусталиковой плакоды и глазного пузырька, выход из клеточного цикла внутри заднего компартмента глазного пузырька, экстенсивную элонгацию клеток, обильную экспрессию кристаллиновых генов и накопление белков, образование присущих межклеточных контактов между индивидуальными хрусталиковыми волокнами, продукция белков ECM, чтобы сформировать капсулу хрусталика, организованная деградация субклеточных органелл и завершение ремоделирования ткани. Развитие микроархитектуры хрусталика нуждается в ряде высоко специализированных белков, которые управляют образованием уникальных клеточных мембран, щелевых соединений и цитоскелетных структур (summarized in Box 1). Параллельно клетки хрусталиковых волокон деградируют свои внутриклеточные органеллы, так что минимизируют рассеивание света (Box 2). Среди этих процессов инвагинация хрусталиковой плакоды и молекулярные механизмы, лежащие в основе транскрипции кристаллиновых генов, активно исследовали и это служило в качестве первичной модели для лучшего понимания синхронизированных морфогенетических движений эпителиальных слоёв в др. органах и транскрипционный контроль др. генов, экспрессирующихся на высоком уровне в хрусталике, соотв. [122].

    Box 1 Lens 'In Vivo Engineering': Materials Needed to Build the Lens

    Box 2 Lens 'In Vivo Engineering': Structures and Organelles to Be Destroyed



    A Morphogenetic 'Tango': Lens Placode and Optic Vesicle Invagination to Generate the 3D Eye Primordium


    Чтобы объяснить образование плакоды во время утолщения эктодермы, впервые было показано, что область контакта между эктодермой и нейроэпителием остается постоянным во время процесса инвагинации. Этот контакт устанавливается с помощью ограничения эффектов ECM [123] , а образование богатых F-актином базальных временных филоподий действует в качестве физических креплений [124]. Эта модель далее была расширена находками, показавшими, что ECM заставляет хрусталиковые клетки утолщаться локально, чтобы облегчить последующую инвагинацию [99, 125], процесс прежде всего управляемый с помощью апикальных сужений, чтобы создавать клиноподобные клетки [122, 126] и с помощью передачи сигналов BMP [127]. В инвагинирующей хрусталиковой плакоде, клетки вблизи хрусталиковой ямки по окружности контрактируют свои комплексы слипчивых соединений, смыкая их вместе и при этом ремоделирование актомиозинового цитоскелета нуждается в RhoA small GTPase, Rho kinase (Rock), PDZ домен-содержащем белке Shroom3, и p120-catenin δ1 [122, 126]. Физические силы, генерируемые с помощью изгибания эпителия, регулируются путем сбалансированной активности Rac1 и RhoA [128]. Кроме того, устанавливается планарная поляризация клеток вблизи центра хрусталиковой плакоды, чтобы продуцировать множественные морфогенетические физические силы, которые контролируют процесс инвагинации [129]. У medaka образование филоподий, которые закрепляют хрусталик на сетчатке, нуждается в YAP посредством fibronectin 1 (Fn1) и β1-integrin, вовлеченных в путь Hippo-Yap по актомиозином обусловленной регуляции тканевого напряжения посредством Rho GTPase-активируемого белка ARHGAP18 [130]. Дальнейшая сложность с морфогенезом глазного пузырька и регуляцией формы демонстрируется кондиционной инактивацией Wntless (Wls)в презумптивной хрусталиковой эктодерме - которая обнаруживает крупные структурные изменения, дающие блюдцеобразный глазной бокал, поврежденный вентральной колобомой, пертурбации передачи сигналов RA и уменьшение количества клеток ретинального пигментного эпителия (RPE) по краю глазного бокала [131]. Эти находки позволили выдвинуть новую гипотезу, что количества дифференцированных клеток в двухслойном эпителии по аналогии с 'bimetallic strip', также регулируют финальную форму глазного бокала [131].
    Роль белков ECM иллюстрируется потерей в хрусталике функции, связанной с Fn1 у мышей [99] и laminin α1 (Lama1) рыбок данио [132]. Сходным образом, ограничивающий механизм, включающий динамику актомиозина, был установлен в морфогенезе нейроэпителия глазного бокала рыбок данио путем получения изображений вживую изменений клеточной формы и движений [129, 133, 134].
    Передача сигналов BMP продолжает выполнять критическую функцию во время образования хрусталиковой ямки и глазного бокала (Table 1). BMP4 (с E9.0 и ослабленный между E9.5 и E10) и BMP7 (между E9.5 и 10.5) экспрессируются в проспективной хрусталиковой эктодерме и хрусталиковой плакоде, BMP7 в будущем RPE, а BMP4 в будущей нейросетчатке. Активная каноническая передача сигналов BMP, оцениваемая по окрашиванию pSmad1/5/8 в ядре, ограничивается дорсальной частью глазного бокала [54]. В хрусталик-формирующей эктодерме экспрессия BMP ауторегулируется негативно [135], и это не зависит от Smad1, Smad5 или Smad4 [52]. Передача сигналов BMP, происходящая из хрусталика специфицирует нейросетчатку [136], а потеря BMP4 в гразном пузырьке сказывается пагубно на формировании хрусталика, при этом нейросетчатка превращается в RPE [54]. Очевидно, что экспрессия BMPs в дорсальной части глазного пузырька стабилизируется с помощью передачи сигналов Wnt от эктодермы посредством независимых от β-catenin и зависимых от GSK3β путей [137]. Ось Lhx2-BMP, описанная выше, далее используется посредством 'задержанной' инактивации Lhx2 в глазном бокале со ст. E10.5, что нарушает морфогенез хрусталика и сетчатки и сгижает экспрессию Fgf3, Fgf9, Fgf15, Etv5/ERM, Etv1/ER81 и Bmp4 в мутантном глазном бокале [138]. Важно, что это исследование идентифицировало комплимент к FGFs, который действует in vivo во время дифференцировки клеток хрусталиковых волокон. Сходным образом, большинство критических ролей Pax6 в формировании и инвагинации хрусталиковой плакоды было продемонстрировано с помощью исследований, показавших, что Lama1, Fn1, α5- и β1-integrins, и возможно Shroom3, являются непосредственными мишенями для Pax6 [99,126, 139, 140]. Необходимы дальнейшие исследования для установления молекулярных механизмов канонической и не канонической передачи сигналов BMP, включая SRTFs и их непосредственные гены мишени в хрусталиковом и ретинальном компартментах во время ранних стадий развития глаз.
    Инвагинация хрусталиковой плакоды обнаруживает склонность к тяжелым структурным повреждениям из-за мутаций во многих регуляторных генах, включая Mab21l1 [89], Pitx3 [141] и Six3 [44], вызывающих апоптоз клеток хрусталика, а Pitx3=/= обнаруживают 'исчезновение' самого хрусталика (афакия). Развитие хрусталика и сетчатки тяжело нарушено у Hes1=/= эмбрионов мыши со ст. E10.5, хотя раннее формирование паттерна глаз протекает нормально, на что указывает нормальная экспрессия Pax6 и Rax до этой стадии; тем не менее дефекты пролиферации клеток предшественников скорее, чем апоптоз лежит в основе этих дефектов [142, 143]. Hes1, bHLH репрессор транскрипции и нижестоящая мишень для передачи сигналов Notch, экспрессируется в хрусталиковой плакоде, пузырьке и глазном бокале, а клеточно автономные и не автономные Hes1-зависимые механизмы нуждаются в дальнейшем прояснении. Жизнеспособность клеток хрусталиковой плакоды и хрусталиковой ямки нуждается в передаче сигналов FGF и BMP (Table 1), на что указывают многие генетические стратегии по инактивации трех трансмембранных tyrosine kinase FGF рецепторов, Fgfr1, Fgfr2 и Fgfr3 [144], Bmp рецепторов Bmpr1a и Acvr1 [52], и комбинации из Bmpr1a и Fgfr2 [145]. Способствующий жизнеспособности путь передачи сигналов FGF включает путь PI3K/AKT (Table 1) [146]. Важной частью этих морфогенетических движений является отделение хрусталикового пузырька от поверхности эктодермы, которая впоследствии дает эпителий роговицы. Этот процесс нарушен у AP-2α-/= [147], Cited2=/= [148], Foxe3=/= [149], Pax6+/= [150], Rxra=/= Rarg-/- [151], Rbpj-/- [152], и Sox11=/= мутантов [153]. Кооперативное действие E- и N-cadherins и пространственно регулируемый апоптоз необходимы для начала и завершения разделения этих клеток [154]. Итак, достигнут существенный прогресс в идентификации многих критических компонентов этого 'танго', включая исчерпывающий и запутанный генетический анализ этой системы.

    GRNs That Govern Crystallin Gene Expression


    Экспрессия генов кристаллинов находится среди верхушки генов, изученных у млекопитающих и они наиболее сравнимы с высокой экспрессией генов β-globin в эритроцитах и гена Cacnad21 в нейронах [155]. Уровни экспрессии индивидуальных кристаллинов в хрусталиковых волокнах обычно на один-два порядка величин выше, чем их экспрессия в эпителиальных клетках. Заметным исключением является αB-crystallin, который наиболее обильно экспрессируется в эпителии хрусталика скорее, чем в хрусталиковых волокнах. Белок экспрессируется также во многих др. тканях, таких как сердце, головной мозг, сетчатка, почки и легкие [156]. Наиболее распространенным знаменателем среди этого разнообразного семейства кристаллиновых генов являются специфические для хрусталика регуляторные элементы, располагающиеся внутри удивительно коротких TATA-box-содержащих фрагментов промотора напр., -88/ + 46 для αA-crystallin,-115/ + 45 для αB-crystallin и -67/ + 45 для γF-crystallin промоторов [157]. Два специфичных для дифференцировки энхансера располагаются внутри 16 kb Cryaa локуса [158, 159], тогда как целиком регуляторные регионы для Cryab локуса располагаются в регионе ДНК 4 kb выше промотора [160], включая специфичный для мышц/сердца/легких -427/-255 энхансер, который также стимулирует экспрессию αB-crystallin в хрусталике [161]. Напротив, не известны дистальные энхансеры для βγ-crystallin локусов, хотя укорочения 5'-концевого промотора модулирует экспрессию доменов внутри хрусталиковых волокон клеточного компартмента [157, 162]. Генетические и молекулярные исследования на мышах идентифицировали Pax6 [163-166], c-Maf [167-169], Hsf4 [170-172], Prox1 [173, 174], и Sox1 [171, 17-177] в качестве специфичных для хрусталика транскрипционных факторов. Дальнейшие исследования подтвердили участие CREB [158], RARβ/RXRβ [165,176-179] и Six3 [180] , по крайней мере, в одном или нескольких кристаллиновых генов (Table 2). Важно, что некоторые мутации, вызывающие катаракту у людей, были идентифицированы в MAF [181, 182] и HSF4 [183-185].
    Современные данные подтверждают общую модель специфичных для хрусталика транскрипционных факторов и SRTFs, связанных с кристаллиновыми промоторами и энхансерами и показали, что существует 'стержневая' GRN, состоящая из трех ДНК -связывающих транскрипционных факторов, Pax6, c-Maf и Prox1, также как и множественные кристаллины (Figure 4 and Table 2). В инвагинирующей хрусталиковой плакоде, Pax6 непосредственно регулирует экспрессию c-Maf [166] посредством уникального 5'-отдаленного энхансера, содержащего тандем из сайтов. связывающих Pax6. Pax6 также непосредственно регулирует экспрессию Prox1 преимущественно посредством пары 3'-отдаленных энхансеров [139]; , однако, их пространственно-временная активность и их потребность в Pax6 tot предстоит проанализировать непосредственно. Регуляторное взаимодействие между Pax6, c-Maf, Prox1 и их кристаллиновыми мишенями обозначается как 'feed-forward loop'. Имеются также доказательства, что Pax6, Prox1 и Hsf4 прямо контролируют экспрессию генов, кодирующих Fgfs т их рецепторы, Fgfrs [139, 170, 186], и что FGF-регулируемая mitogen-activated protein kinase (MAPK) Erk1/2 фосфорилирует Hsf4, чтобы повысить его связывание с ДНК [187]. Сходным образом, Pax6 также может быть фосфорилирован с помощью Erk, p38 или HIPK2 [188]; однако, ни одно из этих исследований не было проведено в контексте развития хрусталика. Figure 4 показывает установку связей GRNs, управляющих транскрипцией у мышей αA-, βB- и γF-crystallin генов. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы решить вопросы: (i) действительно ли регуляторные регионы βγ-crystallin содержат AP-1 и Ets связывающие сайты? [189]. (ii) передача сигналов BMP , как известно, регулирует экспрессию αA-crystallin гена [190, 191] и возможно др. кристаллинов, но действительно ли кристаллиновые гены регулируются с помощью Smad белков? (iii) где находятся энхансеры, необходимые для начала экспрессии Cryaa у мышей на ст. E10.5? [159]. (iv) формирует ли bZIP фактор c-Maf гомодимеры или гетеродимеры с c-Jun и/или CREB га разных Maf-связывающих сайтах? (v) Какова роль CREB в развитии хрусталика? - помимо реакции на каноническую передачу сигналов cAMP, CREB также может оказаться нижестоящей мишенью для канонической передачи сигналов Wnt/β-catenin, которая участвует в наиболее продвинутых стадиях дифференцировки клеток хрусталиковых волокон [192]. Наконец, (vi) как PTMs регулируют функции транскрипционных факторов хрусталика? [193-195].

    Reiterative Use of the Same Genes and Signaling Pathways Directs Lens Fiber Cell Differentiation and Builds the Lens 3D Shape and Internal Structure


    Непрерывный рост хрусталика в течение всей жизни организма нуждается в упорядоченной пролиферации и дифференцировке клеток хрусталикового эпителия, чтобы генерировать вторичные хрусталиковые волокна. Этот процесс начинается в переходной зоне, расположенной непосредственно кпереди от экватора хрусталика, где эпителиальные клетки хрусталика завершают свои финальные митотические стадии перед окончательной дифференцировкой в волокна (Figure 5). Ключевым регулятором этого перехода является передача сигналов FGF, которая обнаруживает двухфазную активность в хрусталиковых эпителиальных клетках, способствуя пролиферации в низких дозах и дифференцировке при высоких дозах [196]. Это уравновешивается с помощью передачи сигналов Notch, которая супрессирует дифференцировку хрусталиковых эпителиальных клеток, чтобы сохранять пул предшественников. Поскольку Notch лиганд Jag1 продуцируется вновь дифференцированными клетками хрусталиковых волокон, то этот путь представляет собой элегантный механизм обратной связи, который соотв. образом координирует время и ход дифференцировки хрусталика [197, 198]. Интересно, что посредством канонической передачи сигналов Wnt супрессируется инициальное приобретение судьбы клеток хрусталика , как было описано выше, активность Wnt репортера может быть обнаружена в эпителии хрусталика, а потеря Wnt корецептора Lrp6 вызывает прорыв материала хрусталика в переднюю камеру глаза, демонстрируя позитивную роль передачи сигналов Wnt на этой поздней стадии развития хрусталика [199, 200]. Как известно, ключевым эффектором канонической передачи сигналов Wnt является β-catenin, который также важен для слипчивых соединений, закрепляемых с помощью кадгериновых белков. Интересно, что уcтранение β-catenin не вызывает образование грыжи хрусталика, а вместо этого нарушается полярность и слипчивость эпителиальных клеток хрусталика, фенотип, сходный с таковым, обнаруживаемым при нокауте кадгерина [119, 154, 201]. Эксперименты по генетическому устранению отклонений также продемонстрировали, что белок, связывающий кадгерин, NF2 негативно регулирует YAP, который необходим для поддержания полярности эпителиальных клеток хрусталика и предупреждения преждевременно дифференцировки [202, 203]. YAP, как было установлено, также активно вовлекается в передачу сигналов Wnt/β-catenin в др. системах. Т.о., эпителий хрусталика, скорее всего, регулируется за счет конвергенции передачи сигналов Wnt, cadherin, and и Yap (Table 1).
    Вновь дифференцированные клетки хрусталиковых волокон, примыкающие к переходной зоне, являются также котлом многих сигнальных путей, наиболее активно изучалась передача сигналов FGF (Figure 5). Показано, что повышение уровня фосфорилирования ERK, достоверно повышает передачу сигналов FGF в этих клетках. В противоположность его роли, способствующей росту, в эпителиальных клетках хрусталика, высокая интенсивность передачи сигналов FGF в клетках хрусталиковых волокон стимулирует выход из клеточного цикла и дифференцировку. Удивительно, среди всех изученных ростовых факторов, только FGFs спосбны выявлять экспрессию специфичных для волокон белков и существенно менять форму клеток [196, 204, 205]. Это ставит интересный вопрос: какие внутриклеточные молекулы обеспечивают уникальную активность FGF в клетках хрусталиковых волокон? Недавняя работа подтвердила, что ключевым трансмиттером передачи сигналов FGF является Frs2, адапторный белок, специфичный к FGF тирозин киназным рецепторам [206] и Shp2, белку тирозин фосфатазы [144, 207, 208,209]. Постоянно активная передача сигналов Ras может компенсировать потерю Frs2 и Shp2 в клеточной пролиферации и дифференцировке, тогда как передача сигналов PI3K спасает от дефицита FGF receptor 2 (Fgfr2) и клетки выживают, подтверждая, что передача сигналов FGF использует compendium нижестоящих путей, чтобы регулировать развитие хрусталика [146, 207]. Стоящие ниже относительно Ras, MAP киназы, такие как Erk, фосфорилируют и стимулируют активность AP1 и ETS семейств транскрипционных факторов, которые в свою очередь индуцируют экспрессию кристаллинов и др. генов детерминации хрусталика, таких как Prox1 и Maf [186, 189]. Этот путь также тонко контролируется с помощью негативных регуляторов, включая GTPase-активирующий белок NF1 Ras ингибитор Sprouty, а также с помощью транскрипционного фактора Prox1, который активирует экспрессию FGF рецепторов [186, 210-212]. Передача сигналов FGF, как было установлено, индуцирует экспрессию Jag1, лиганда для передачи сигналов Notch, который супрессирует дифференцировку эпителиальных клеток хрусталика, и Fizzled-6, рецептора для передачи сигналов Wnt/planar cell polarity (PCP), которые может облегчать ориентацию хрусталиковых волокон [213,214]. Передача сигналов FGF также задействована во взаимодействии с передачей сигналов BMP, это способствует выходу из клеточного цикла и дифференцировке хрусталика FGF-зависимым способом [190, 215, 216]. Однако, хотя дифференцировка хрусталика и останавливается у мутантных мышей, которые лишены BMP рецепторов Bmpr1a и Acvr1, вряд ли она остается незатронутой или даже усиленной при делеции регуляторных Smads (Smad1 и Smad5) и Smad4, которые являются медиаторами канонической передачи сигналов BMP [52, 217, 218]. Напротив, потеря Smad7, подавляющего Smad, действительно нарушает дифференцировку [219]. Эти несопоставимые фенотипы подтверждают, что дифференцировка хрусталика, скорее всего, регулируется с помощью Smad-независимой не канонической передачи сигналов BMP.
    Передача сигналов FGF, как полагают, также побуждает клетки хрусталика дифференцироваться в ответ на каноническую передачу сигналов Wnt [192]. InВ подтверждение этой модели делеция β-catenin нарушает дифференцировку хрусталиковых волокон, а комбинация Wnt3a и FGF2 оказалась наиболее эффективной в генерации хрусталико-подобных тел из ES клеток человека [69, 201]. В качестве предостережения наиболее часто используемый TCF/Lef1 репортер для канонической передачи сигналов Wnt является единственным активным в эпителии хрусталика, но не в компартменте хрусталиковых волокон, but this reporter но этот репортер может полностью воспроизвести каноническую активность Wnt [121, 220]. Наконец, передача сигналов FGF в хрусталиковых волокнах индуцирует экспрессию Frizzled-6, Wnt который, как полагают, чувствителен к градиенту Wnt, чтобы управлять миграцией волокон к переднему полюсу хрусталика, хотя доказательства in vivo такой не канонической передачи сигналов Wnt/PCP всё ещё отсутствуют [214, 221]. Итак, эти линии доказательств показывают, что передача сигналов FGF является центральным дирижером в оркестровке передачи сигналов Notch, BMP и Wnt , чтобы регулировать дифференцировку волокон и морфогенез хрусталика.
    Клеточная адгезия и белки соединений играют важные роли в дифференцировке и морфогенезе хрусталика. E- и N-cadherins располагаются на апикальной и боковых сторонах клеток эпителия хрусталика, чтобы поддерживать свою полярность и адгезию др. с др., для этого также необходимы RapGAP белок Sipa1l3 и передача сигналов ephrin-A5 [154, 222-225]. В клетках хрусталиковых волокон, N-cadherin спосбствует элонгации клеток и морфогенезу путем активации из Src семейства киназы Fyn, совместно с EphA2 рецепторными тирозин киназами, индуцирующими фосфорилирование Src и F-actin связывающего белка cortactin, чтобы контролировать сборку актина и расположение клеток волокон [226, 227]. Также на боковых сторонах клеток хрусталиковых волокон белок щелевых соединений Cx50 (Gja8) не только образует каналы для обмена ионами и метаболитами, но и негативно регулирует E3 ubiquitin лигазу Skp2, чтобы предотвращать деградацию ингибитора клеточного цикла Cdkn1b/p27, способствуя выходу из клеточного цикла и дифференцировке [228]. Integrins являются главными adhesion рецепторами на базальной стороне клеток хрусталика и соединяют внутренний цитоскелет с ECM в капсуле хрусталика. В эпителии хрусталика программа дифференцировки клеток супрессируется с помощью β1-integrin , который противодействует передаче сигналов FGF, но способствует с помощью α6-integrin активации передачи сигналов IGF [229, 230]. Хотя точный механизм такой дивергентной роли интегринов неясен, генетические доказательства подтверждают, что модель, согласно которой передача сигналов интегринов регулируется с помощью трансмембранного белка Crim1, обеспечиваемого с помощью pseudokinase ILK, и в конечном итоге передаются малым GTPases, таким как Rac и Rap, стобы контролировать клеточную адгезию и сборку базальных мембран
    [231-235].

    Concluding Remarks


    The cell fate decision and differentiation processes described here illustrate both the simplicity and complexity of the ocular lens. At the 'simple' level, the current model of lens cell formation is constructed from a tripartite Six3-Pax6-Sox2 network that paves the way for the expression of the essential crystallin regulatory genes Maf, Prox1, Sox1, and Hsf4. Two cell types, the lens epithelium and lens fiber cells, also provide a uniquely 'simple' system to understand cellular differentiation at the molecular level. The 'complexity' originates from the reiterative use of ubiquitously used signaling pathways (TGF-?/BMP, FGF, Wnt, nuclear receptors, Shh, integrins, Notch, Hippo/Yap, and possibly Jak/Stat) (Table 1); however, it is important to stress that both the sources of these signals and their agonists and antagonists, target receptors, and nuclear SRTFs may differ depending on the precise context. For example, FGF signaling functions first as the early-inductive driver (planar signals from the diencephalon), then as activator of pro-survival mechanisms during lens placode invagination (from the optic vesicle), and finally as the overarching source of differentiation molecules later in lens development (from the neuroretina). Likewise, we do not fully understand the contributions of individual genes to the formation of the aPPR given the possible effect of 'protective' redundancies, species differences, and the wiring of their GRNs within the lens-induction pathway. We also lack a transcriptomic definition of lens cell fate competence, commitment, and determination. While the majority of extracellular signaling pathways play positive roles in lens cell formation, the repressive mechanisms seem to be under-represented (Table 1), and the extensive crosstalk between individual pathways remains poorly understood [131, 190, 236]. Other levels of unresolved complexities relate to the contradictory findings that optic cup formation requires ectoderm-derived signals [137], anopthalmia is caused by various mutations of genes either in the ectoderm or optic vesicle [3, 51, 54, 79,82, 83, 237], and that optic cup formation proceeds without any rudimentary lens in retinal organoid cultures [125, 238]. These and other central issues previously discussed (see Outstanding Questions) will be resolved in the upcoming years. Nonetheless, experimental challenges remain high due to both the low number of cells comprising the early embryonic structures and the difficulty of purifying them.
    In recent years, lens studies have greatly benefited from the implementation of a full repertoire of genome-wide and proteomic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, and mass spectrometry, and the growing number of genes available for mouse genetic studies that include double and triple knockouts [52, 91, 96, 100, 144, 145,239, 240]. Use of the CRISPR/Cas9 system allows effective dissection of regulatory mechanisms at the DNA level, including complex enhancers [100]. A major gap exists in our understanding of the post-transcriptional, translational, and post-translational regulatory mechanisms functioning in the lens [241, 242, 243], as well as of the crosstalk taking place between individual signal transduction pathways [221, 244], nuclear organization [245, 246], and how noncoding RNAs regulate nuclear organization and gene expression [247]. Ongoing studies are focused on lens chromatin dynamics by ATAC-seq, as well as the identification of lncRNAs and microRNAs and their functions in the lens. Transcriptional processes and their modulation are intimately connected to PTMs, interactions with chromatin-modifying and -remodeling enzymes, and the half-lives of individual transcription factors. Pioneering studies on protein-protein interactions of Pax6 [97] and its proteosomal degradation in neuronal cells [248, 249] should be followed by similar studies of other transcription factors in lens cells. Genetic studies of lens abnormalities [250], candidate gene approaches facilitated by the iSyTE database [251], and studies of microphthalmia-anopthalmia-coloboma [237] will also assist in the expansion of lens-specific GRNs.
    Lastly, lens fiber cell elongation encounters a series of obstacles, such as the necessity to produce large amounts of protein and lipid building materials per each individual cell in a short time-window that is restricted by organelle degradation. The complex mechanisms governing intracellular transport, quality control, and assembly in the developing eye provide numerous excellent opportunities to study the fundamentals of diverse biological processes, including cytoplasmic membrane biogenesis, organelle degradation and turnover [252, 253, 254], recycling of materials via autophagy [252, 255], developmental endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response [256], the function of the ubiquitin-proteasome systems [228, 257, 258], protein sorting into raft and nonraft bilayers [259, 260], remodeling of the membrane cytoskeleton [261, 262], and the formation of mechanical stiffness and elasticity of the lens [263, 264, 265] (Boxes 1 and 2), as well as to expand studies of GRNs and extracellular signaling to include genes that either control (e.g., Gata3, Hsf4, Prox1, Sox1, etc.) or function in these processes (e.g., aquaporin 0/MIP, Bfsp1, Bfsp2/filensin, Dnase2b, Gja8/Cx50, Lim2, etc.). Paramount to these studies is the implementation of assays to visualize and track single molecules within the lens cells, including individual organelles using fluorescent techniques, visualization of nascent transcription and RNA transport, and the development of antibodies that recognize specific PTMs of lens proteins including crystallins. We conclude that the next decade of lens research is poised to provide novel insights into the general cellular and molecular mechanisms of tissue morphogenesis, and will explain the mechanisms underlying congenital eye defects as well as 'late' aging defects originating from disrupted lens homeostasis.