Katja Hartstock, Benedikt S. Nilges, Anna Ovcharenko, et al. Enzymatic or In Vivo Installation of Propargyl Groups in Combination with Click Chemistry for the Enrichment and Detection of Methyltransferase Target Sites in RNA.Angewandte Chemie International Edition, 2018; DOI:10.1002/anie.201800188 | |
|---|---|
|
|
мРНК играют важную роль во всех клеточных процессах. Исследователи двух групп из Cells-in-Motion Cluster of Excellence at Münster University впервые осуществили химио-ферментативное мечение важных изменений в мРНК -- т. наз модификацию m6A -- и затем определили их с точностью с помощью совр. мол. биологических методов. "Этот новый подход позволил нам локализовать модификации в мРНК со значительной степенью аккуратности, чем ранее," заявил Andrea Rentmeister. Знание, где и в какой степени возникают m6A модификации, позднее поможет исследователям проверить еще точнее роль этих модификаций в физиологических и патологических процессах.
Генетическая информация ДНК транскрибируется в мРНК. После транскрипции мРНК транспортирует генетическую информацию из клеточного ядра в цитоплазму. Здесь она служит для продукции белков.
Подобно двунитчатой ДНК однонитчатая РНК состоит из т.наз. нуклеотидов. В РНК, однако, имеются также многочисленные химические изменения таких нуклеотидов -- известных как модификации РНК. Эти модификации возникают после того, как генетическая информация будет считана. В процессе простых перестроек атомов -- метильные группы -- присоединяются к нуклеотидам. "Одна из модификаций активно обсуждается, это N6-methyladenosine, известный как m6A," говорит Andrea Rentmeister. Имеется специфическая причина, почему эта модификация очень инт ересна, это потому, что она, по-видимому, ответственна за серию биологичческих процессов, напр., за циркадные часы. Она также, по-видимому, играет роль в некоторых патологических процессах, напр., в определенных формах рака или вирусных инфекций. Biochemists labelled RNA modifications chemo-enzymatically Чтобы лучше понять роль m6A, исследователи попытались найти ответ на вопрос, где в точности на мРНК располагается эта модификация? Для этого они метили её. С этой целью биологи часто используют антитела, присоединяются к исследуемой молекуле. Этот метод имеет ограничения, поскольку апнтитела могут соединяться не только с модификациями в мРНК, но и также с соседними нуклеотидами. Это затруднение локализацию модификации," объясняет Andrea Rentmeister. Поэтому исследователи использовали propargyl группы с более длинным углеводородным остатком.
Исследователи соединили propargyl группы с ко-субстратом энзима и скомбинировали все три компонента с молекулами мРНК в пробирке. По своей химической структуре propargylсходен с естественной молекулой, связываемой methyltransferase. Метилтрансферазы частично являются энзимами, ответственными за модификацию мРНК. Т.о., метилтрансферазы способны переносить propargyl группу на РНК. Используя т. наз. click химию, ученые оказались способны выделить и очистить РНК с propargyl группами. Molecular biologists detected RNA modifications using Next Generation Sequencing Чтобы определить специфически меченные модификации, исследователи использовали специальный фермент, чтобы транскрибировать мРНК обратно в ДНК. Возникающая в результате нить ДНК давала копии предыдущей РНК и могла быть исследована с использованием молекулярных биологических методов. Молекулярные биологи из Cells-in-Motion Cluster of Excellence и из Max Planck Institute for Molecular Biomedicine in Münster ctrdtybhjsdfkb эти синтезированные с новой нити ДНК. Для этого использовали метод, известный как секвенирпование следующенго поколения, которое позволяет определять последоваательности нуклеотидов с чрезвычайной эффективностью.
"Этот метод позволил нам анализировать тысячи последоваательностей параллельно," объясняет Sebastian Leidel.
Поскольку исследователи метили модификации c помощью propargyl групп, то энзимы, необходимые для перезаписи РНК подвергали аресту. В результате они были неспособны транскрибировать РНК обратно в ДНК. "Энзимы теряли какую-либо активность на меченых сайтах и генерировали своего рода стоп-сигналl," говорит Katja Hartstock. Исследователи оказались способны определить эти стоп сигналы во время секвенирования,это означало, что они могут определять места, в которыхъ происходят модификации РНК.
После первоначальных экспериментов в пробирках исследователи применили свой новый метод на культуре эпителиальных клеток человека -- клетках HeLa. Исследователи скармливали клеткам, меченные propargyl т. наз. аминокислотные предшественники, которые клетки "поглощали" и затем происходило мечение. Т.к. уже было установлено в пробирках propargyl группы присоединяются к РНК c помощью метилтрансфераз и делают возможным определять мРНК с модификациями c помощью Next generation sequencing.
Далее исследователи предполагают применить свой метод к живым организмам, чтобы изучить значение модификаций для их развития. Наиболее пригодны рыбки данио, они развиваются очень быстро и поэтому модификац2ии транскрибируются быстрее и удаляются также быстрее.
|