Посещений:
ПОЛИЦИСТРОННЫЕ мРНК У МЛЕКОПИТАЮЩИХ



Механизмы трансляции

Mammalian Polycistronic mRNAs and Disease
Timofey A. Karginov, Daniel Parviz Hejazi Pastor, Bert L. Semler , Christopher M. Gomez
DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.tig.2016.11.007

we address the gradual recognition that a growing number of polycistronic genes, originally discovered in viruses, are being identified within the mammalian genome, and that these may provide new insights into disease mechanisms and treatment. We carried out a systematic literature review identifying 13 mammalian genes for which there is evidence for polycistronic expression via translation through an internal ribosome entry site (IRES). Although the canonical mechanism of translation initiation has been studied extensively, here we highlight a process of noncanonical translation, IRES-mediated translation, that is a growing source for understanding complex inheritance, the elucidation of disease mechanisms, and the discovery of novel therapeutic targets. Identification of additional polycistronic genes may provide new insights into disease therapy and allow for new discoveries of both translational and disease mechanisms


Рисунки к статье



One Messenger RNA, Multiple Polypeptides


George Beadle и Edward Tatum впервые предложили модель генной экспрессии, согласно которой индивидуальные гены кодируют одиночные продукты ферментов, она была пересмотрена в последующие годы в гипотезу 'один ген один полипептид' [1, 2]. Затем помимо характеризации альтернативного сплайсинга транскриптов для создания разных белков, исследования выявили несколько неканонических механизмов трансляции, показав. что один ген может кодировать более одного функционально отличающихся полипептидов. Наиболее впечатляющий пример у вирусов, простейших и беспозвоночных существуют многочисленные гены, несущие множественные открытые рамки считывания (ORF; полицистронные), кодирующих два или более независимо регулируемых белка. Полицистронные гены у простейших и беспозвоночных делают возможной инициацию трансляции с двух и более сайтов вдоль одиночного транскрипта мРНК в качестве эффективного способа скоординированной экспрессии генов. Такая стратегия экспрессии первоначально не была обнаружена в геноме позвоночных. Недавно идентифицировано небольшое, но всё увеличивающееся количество генов или с тандемными, или перекрывающимися цистронами. Инициация трансляции с нижестоящей или перекрывающейся ORF обычно достигается с помощью capitalizing на высоко структуированном stem-loop RNA элементе, наз. IRES (see Glossary) в первичном транскрипте, где рибосомы соединяются с нижестоящим каноническим сайтом старта трансляции. Функция IRES нуждается во взаимодействии с самостоятельным набором РНК-связывающих белков (факторов инициации трансляции и IRES транс-действующих факторов), которые делают возможным дифференциальный, но скоординированный контроль экспрессии генов относительно вышестоящей ORF. Видные полицистронные клеточные гены у млекопитающих, по-видимому, подразделяются, по крайней мере, на четыре отличающиеся категории, базируясь на структуре мРНК и функции генных продуктов: (i) две субъединицы мультисубъединичного комплекса, чья экспрессия скоординирована в одном транскрипте ; (ii) функционально сходные генные продукты, которые ко-экспрессируются по разному; (iii) функционально отличающиеся генные продукты, которые имеют запрограммированную сходную экспрессию; и (iv) сигнальные белки, сгенерированные или с помощью stimulus-coupled расщепления протеазами или cap-независимой трансляции (Figure 1).



Canonical Protein Synthesis in Eukaryotes


Трансляция мРНК в белок проходит три стадии: инициации, элонгации и завершения. Преимущественная форма инициации трансляции известна как 'cap-зависимая инициация', базируется на распознавании m7GpppN(7-methylguanosine) структуры 'cap' на 5' конце мРНК с помощью комплекса канонических факторов инициации (eukaryotic initiation factors; eIFs), наз. 'eIF4F'. Комплекс eIF4F, представленный eIF4A (DEAD-box РНК геликаза), eIF4E ( cap-связывающий белок) и eIF4G (мультидоменовый каркасный белок), распознает и соединяется с 5'-cap. Комплекс eIF4F затем привлекает 40S рибосомальную субъединицу вместе с др. комплексом, тройным комплексом (GTP-связанный eIF2 и заряженный метиониновый инициатор tRNA), как часть 43S комплекса инициации, чтобы сформировать 48S комплекс инициации. 48S комплекс инициации затем перемещается вдоль 5'-нетранслируемой области (5'-UTR) мРНК, используя активность геликазы eIF4A, чтобы помочь раскрутить любую потенциально ингибирующую вторичную структуру вплоть до AUG, на которую наталкивается в благоприятных условиях [3]. GTP впоследствии гидролизуется до GDP в присутствии eIF5, что сопровождается диссоциацией некоторых из факторов инициации. 60S рибосомальная субъединица затем соединяется с малой субъединицей, приводя в результате к образованию готовой к элонгации 80S рибосомы. С этого момента инициируется трансляция (Figure 2). Затем происходит фаза элонгации пока рибосома не натолкнется на кодон терминации [4, 5].



Cap-Independent Translation in Vertebrates


Базируясь на своих первичных нуклеотидных последовательностях, многие мРНК подвергаются внутримолекулярному спариванию оснований, чтобы продуцировать чрезвычайно упорядоченные вторичные структуры, способные к формированию комплекса stem-loop конформаций, которые облегчают связывание специфических белков с функциональными последствиями. Для мРНК вирусов и эукариот высоко структуированные IRES элементы могут формировать комплексы с рибосомами вместе с субнабором канонических eIFs и др. РНК-связывающих белков, наз. IRES trans-acting factors (ITAFs) , чтобы сделать возможным синтез белка, инициируемый в условиях неблагоприятных для (или не требующих) cap-зависимой инициации (Figure 2) [6-8]. Потребности в eIF и ITAF отличаются между IRESs. Взаимодействия eIFs и ITAFs с рибосомными субъединицами, как полагают, делают возможным правильное позиционирование IRES-обеспечиваемой трансляции кодона инициации в рибосомном P-сайте [6]. Однако, тщательные исследования комплексов инициации для региона IRES не были проведены. Сначала полагали, что это свойство вирусов исключительно, но приблизительно 10-15% мРНК из клеток позвоночных, как полагают, сегодня способны подвергаться IRES-обеспечиваемому синтезу белка, исходя из присутствия IRESs, расположенных в 5'-UTR нижестоящем cap сайте [9]. Описаны 115 генов, содержащих клеточные 5'-UTR IRESs, а недавнее систематическое исследование предоставило подтверждающие доказательства для известных IRESs и подтвердило потенциально новые IRESs, используемые олигонуклеотидами, предназначенными для активности cap-независимой трансляции [10, 11].
Базируясь на функции изученных генов, становится очевидным, что 5'-IRES предоставляют способ экспрессии определенных ключевых белков в условиях клеточных стрессов, когда cap-зависимая трансляция подавлена. Альтернативная трансляция с помощью клеточных 5'-UTR IRESs также может возникать во время фаз ангиогенеза, митозов и клеточной пролиферации, особенно в генах, которые имеют IRESs, расположенные в 5'-UTR регионе, таких как семейство myc генов и тех, что кодируют циклин-зависимую киназу 11 и vascular endothelial growth factor (VEGF) [6]. Структуры eIFs и ITAFs были определены только у небольшого количества таких клеточных IRESs. Однако, в некоторых случаях активности IRES появлялись в зависимости от уровней экспрессии и локализации ITAF, подтверждая четкую регуляцию полицистронных генов [6]. В отличие от их вирусных аналогов, которые представлены разными семействами структурно родственных IRESs, клеточные IRESs, по-видимому, появляются в зависимости от коротких мотивов и ITAFs [8]. Т.о., клеточные IRESs имеют дифференцированные структуры, которые в принципе делают возможными разные функции и локализации белковых продуктов, продуцируемых под их контролем.

Polycistronic Cellular Genes


Почти все положительно направленные (positive-sense) РНК вирусы имеют геномную РНК, которая кодирет множественные белковые продукты в форме предшественника множественных белков, который затем подвергается преобразованию в функциональные полипептиды, используемые для вирусной инфекции. Субнабор таких вирусов (напр., человеческие rhinovirus, hepatitis C virus и cricket paralysis virus) содержит, по крайней мере, одну ORF, которой предпослана структура IRES. Однако, растут доказательства, что некоторые клеточные мРНК и мРНК позвоночных также имеют IRES-подобные структуры значительно ниже 5'-UTR, внутри или после 5' проксимальной ORF, это делает возможной экспрессию белков с тандемных или перекрывающихся ORFs. Как и в случает прокариотических полицистронных генов, каноническая трансляция обычно инициируется вблизи 5' концов мРНК бицистронных генов позвоночных. Однако, в немногих случаях установлено, что синтез второго белка инициируется посредством IRES элемента, расположенного ниже или внутри первой ORF.
Обусловленная многими механизмами альтернативная генная экспрессия и трансляция в клетках эукариот, идентификация мРНК, обладающих bona fide IRES последовательностями, нуждаются в нескольких строгих критериях, которые д. быть удовлетворительными. Скрытые промоторы в репортерных плазмидах и события альтернативного сплайсинга, приводящие к разным транскриптам и вторичным белковым продуктам д. быть исключены [12, 13]. Кроме того, множественные механизмы трансляции вторичных белков, включая сканирование рибосомами, ре-инициацию, прочитывание стоп-кодона или сдвиг рамки считывания трансляции, могут быть обнаружены в одном и том же гене. Убедительные доказательства присутствия IRES требуют исключения этих механизмов и функциональных исследований (Figure 3).



Regulation of Cellular IRES Activity


Хотя механизм функции клеточных IRES недостаточно ясен, растет интерес к идентификации клеточно-специфических уровней экспрессии ITAFs и к структурным элементам, которые определяют активность IRES. ITAFs не участвуют в cap-зависимых механизмах и, как полагают, специфичны для cap-независмой трансляции [14]. Как результат, ITAFs выполняют важную роль в детерминации клеточно- и ткане-специфичной экспрессии полицистронных транскриптов с IRESs. Напр., в гене, кодирующем melanoma-overexpressed antigen (meloe), два IRESs кодируют T клеточные антигены, которые избирательно экспрессируются в клетках меланомы, но отсутствуют в меланоцитах, указывая на то, что ITAFs замалчиваются в нормальных меланоцитах [15, 16]. В тканях, которые не экспрессируют или секвестрируют ITAFs, критические для функции IRES, следует ожидать, что полицистронные гены будут функционировать моноцистронным способом, сильно зависимым от cap-зависимой трансляции. Следовательно, полицистронная активность может изменять разнообразие экспрессии гена в основном посредством доступности этих IRES-специфических факторов [6]. Однако, потеря- или избыточность IRES-обеспечиваемой трансляции может вносить вклад в патофизиологию в тех случаях, когда болезнь ткани изменяет доступность ITAFs до аномальной, способствуя или элиминируя активность IRES. LAMB1, напр., кодирует мембранный гликопротеин Laminin B1, который играет важную роль в инвазии рака посредством 5'-UTR IRES, регулируемых с помощью ITAF La. Экспрессия La и последующая IRES-обеспечиваемая трансляция Laminin B1, снижена в нормальных гепатоцитах по сравнению с гепатоцитами после эпителиально-мезенхимного перехода (EMT), критической ступени в приобретении инвазивных свойств клетками карциномы [17].
Помимо уровней экспрессии субклеточная локализация ITAFs является важной для функции клеточного IRES [6, 14, 18]. Ядерный ITAF может секвестрировать мРНК до тех пор, пока изменения передачи сигналов не позволят переместиться ему в цитоплазму для трансляции. Свободные ITAFs могут также быть компартментализованы вплоть до получения определенного сигнала, ведущего к перемещению, необходимому для трансляции с IRES (напр., перемещение ингибитора ITAF из цитоплазмы в ядро) [6, 14]. Эти гипотезы подтверждают, что сегрегация ITAFs с мРНК посредством субклеточной компартментализации является критическим регуляторным механизмом для полицистронных мРНК.
Наконец, структурные элементы IRES важны для понимания их функции и роли в болезнях. miRNA, напр., как было установлено, соединяются с сайтом в 3'-UTR и действуют как регуляторы IRES-обеспечиваемой трансляции для гена VEGFA, который содержит два IRESs в 5'-UTR [19]. Более того, клеточные IRESs были отнесены в ту категорию, которые зависят от коротких мотивов и в ту, которые нуждаются в общей сложной вторичной и третичной структуре [11]. Такое распределение указывает на то, что мутации, которые разрушают или короткие мотивы, или структуру РНК, д. приводить к нарушению нормальной функции IRES и д. приводить к болезни.

Why Polycistronic Genes?


Клеточные полицистронные гены имеют несколько потенциальных преимуществ для скоординированной экспрессии генов, организованных здесь в 4 самостояте6льные категории, которые указывают на механизмы экспрессии каждого полицистронного гена (Figure 1). Более того, в то время как полицистронная организация гена делает возможным уникальный и избирательный механизм контроля экспрессии белка, эта генетическая стратегия имеет несколько потенциальных вредных клинических исходов в присутствии генетических мутаций или нарушения регуляции IRES. Разные мутации полицистронных генов приводят к сложном и отличающимся фенотипам, возможно из-за того, что их эффект влияет или на ORF или саму IRES последовательность. Как результат полицистронные гены могут открыть способ новой терапии.
Table 1 содержит список из 13 полицистронных генов. Гены не включают те, что в основном экспрессируют укороченные формы одного и того же белка в основном с той же функцией. Гены, для которых механизм cap-независимой экспрессии не подтвержден экспериментально, были исключены. В след. разделах мы предоставим примеры 4-х функциональных классов полицистронных генов и биологии и/или паттерны экспрессии, с ними ассоциированные (additional genes are mentioned in Table 1, Key Table).

Table 1Key TableMammalian Polycistronic Genesa Gene Protein(s) Functional category Primary protein function Secondary protein function Disease relevance Mechanism of expression of second cistron Bicistronic organization Refs TCP-BP PRO1 (8.9 kDa); PRO2 (9.5 kDa) 1 PRO1: interacts with PRO2 to form a low-affinity phencyclidine-binding entity that is part of a synaptic membrane complex PRO2: interacts with PRO1 to form a low-affinity phencyclidine-binding entity that is part of a synaptic membrane complex None reported Putative IRES sequence between PRO1 ORF and PRO2 ORF Tandem [20] FFAR1 GPR40 (31 kDa); GPR41 (38 kDa) 2 GPR40: long-chain fatty acid receptor GPR41: short-chain fatty acid receptor None reported IRES in coding region of FFAR1 encodes GPR41 Tandem [21,22,23,24] meloe MELOE-1 (4.3 kDa); MELOE-2 (5.1 kDa); MELOE-3 (5.9 kDa) 2 MELOE-3: no known function; poor immunogenicity, but is expressed in melanoma cells and normal melanocytes MELOE-1: no known function; T cell antigen selectively expressed in melanoma cells MELOE-2: no known function; T cell antigen selectively expressed in melanoma cells Potential target for T cell immune therapy for melanoma IRES upstream of ORFs of MELOE-1 and MELOE-2; MELOE-3 produced by cap-dependent translation Tandem [15,16,25] MTPN Myotrophin (12.9 kDa); MPD6 (6.4 kDa) 3 Myotrophin: allows dimerization of NF-?B in cardiac tissue MPD6: no known function; antigen upregulated in response to interferon-? (IFN-?) Myotrophin induces cardiac hypertrophy; MPD6 elicits humoral immune response in some cancers MPD6 antigen ORF is located in the 3?-UTR region of the MTPN gene and is translated by an IRES located upstream Tandem [30] Cx43 Cx43 (43 kDa); Cx43-CT (20 kDa) 3 Cx43: highly abundant connexin with junctional and nonjunctional functions Cx43-CT: implicated in autoregulating trafficking of Cx43 Hypoplastic left heart syndrome 1, oculodentodigital dysplasia, syndactyly type III; craniometaphyseal dysplasia Putative IRES or Cap-dependent internal translation Overlapping [45,46] Cx55.5 Cx55.5 (56 kDa); CT-11 (16 kDa) 3 Cx55.5: a connexin exclusively expressed in horizontal cells CT-11: has nuclear translocation and may be involved in regulating light-dependent plasticity Mutations in human homolog associated with cataracts Putative IRES upstream of ATG at nucleotide position 1201 Overlapping [47] pVHL-19 pVHL-30 (30 kDa); pVHL-19 (19 kDa) 3 pVHL-30: tumor suppressor residing in cytosol pVHL-19: comparable tumor suppressor in nucleus and cytoplasm with possibly different molecular substrates von Hippel-Lindau disease Mechanism not investigated Overlapping [48,49] CdcL1/CdcL2(PITSLRE genes) p110 (PITSLRE) (110 kDa); p58 (PITSLRE) (58 kDa) cyclin-dependent kinase isoforms 3 p110 (PITSLRE): regulates transcriptional processing by binding elongation factors and RNA-binding proteins p58 (PITSLRE): binds cyclin D3 in G2/M phase of cell cycle None reported Increased translation of p58 during G2/M phase due to Unr and phosphorylated eIF-2? binding via IRES near C-terminal end of p110 Overlapping [26] SNRPN/SNURF SmN (24.6 kDa); SNURF (8.4 kDa) 3 SmN: splicing factor important for RNA processing SNURF: implicated in the regulatory mechanism behind gene imprinting Prader-Willi syndrome; Angelman syndrome Mechanism not investigated Tandem [50] GDF1-LASS1 GDF1 (39 kDa); LASS1 (39 kDa) 3 GDF1: TGF? superfamily member implicated in cell growth and differentiation with role in left-right patterning and mesoderm induction LASS1 (CerS1) ceramide synthase: TGF? superfamily member implicated in cell growth and differentiation; catalyzes synthesis of C18 ceramide in a fumonisin B1-independent manner GDF1: cardiovascular malformations; LASS1: progressive myoclonic epilepsy-8 (EPM8) Mechanism not Investigated Tandem [51] CACNA1A ?1A (220 kDa); ?1ACT (75 kDa) 3 ?1A: voltage-gated calcium channel subunit involved in pre- and postsynaptic Ca2+ signaling, gene expression ?1ACT: transcription factor important for expression of neural and Purkinje cell development genes SCA6, episodic ataxia type 2 (EA-2), familial hemiplegic migraine type 1 (FHM-1), epilepsy ?1ACT is made via an IRES in the C-terminal coding region of CACNA1A Overlapping [27,28,29] Notch2 Notch2 (265 kDa); N2ICD (v-Notch2) (70 kDa) 4 Notch2: cell surface transmembrane receptor involved in cell fate decision during development by release of N2ICD N2ICD: intracellular domain is decoupled and independent of Notch2 surface ligand Hajdu-Cheney syndrome; Alagille syndrome Proposed dual mechanism of second cistron initiation: ribosomal reinitiation and IRES both contribute equally to expression of N2ICD Overlapping [31,32,33,34,35,36,37] Her2 HER2 (185 kDa); HER2 CTF (70 kDa) 4 HER2: tyrosine kinase receptor canonically known to act in secretory and endocytic pathways; also acts within the cell nucleoplasm and nucleus HER2 CTFs: C-terminal fragments that encompass the transmembrane and cytoplasmic domains of full-length HER2 are associated with nodal metastasis, and localize to the cytoplasm and nucleus of cells Hereditary breast cancer, cancer metastasis, tumor development Hypothesized IRES within coding region (not confirmed); two methionines at positions 611 and 687 act as initiators of translation for CTFS Overlapping [38] View Table in HTML aAbbreviations: Cx43, connexin 43; Cx55.5, connexin 55.5; GDF1, growth differentiation factor 1; Her2, human epidermal growth factor receptor 2; LASS1, ceramide synthase 1, also longevity assurance gene 1 protein homolog 1;NOTCH2, neurogenic locus notch homolog protein; pVHL, Von Hippel-Lindau tumor suppressor; SNRPN, small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N;SNURF, SNRPN upstream reading frame.

Two Subunits of a Multisubunit Complex Whose Expression Is Coordinated in a Single Transcript TCP-BP


1-[1-(2-Thienyl)Cyclohexyl]piperidine (tenocyclidine or TCP)-binding protein(TCP-BP) был идентифицирован как один из комплексов из 4-х белков, выделенных из синаптических мембран головного мозга крыс, который связывает агониста glutamate. TCP-BP представлен двумя субъединицами, PRO-1 и PRO-2, которые являются совместно экспрессирующимися субъединицами, кодируемыми двумя тандемными ORFs внутри одиночного a бицистронного транскрипта. IRES элемент, предшествует второй ORF, которая осуществляет трансляцию субъединицы PRO-2 [20]. PRO-1 трансляция начинается с AUG в месте старта ORF1, представленного 160 парами оснований, стоящих ниже точки старта мРНК. PRO-2 трансляция происходит с ORF2, отстоящей на 400 пар оснований ниже ORF1, в межгенном регионе мРНК. of the PRO-1 и PRO-2 экспрессируются в нейронах головного мозга и обнаруживают тенденцию формировать комплекс, необходимый для связывания TCP. Т.о., PRO-1 и PRO-2 образуются посредством скоординировано контролируемой, независимой трансляции с двух ORF регионов посредством cap-зависимого механизма (PRO-1) и IRES элемента (PRO-2). Этот ген головного мозга крыс обнаруживает потенциально редкий класс бицистронных генов млекопитающих, в которых две субъединицы из мультибелкового комплекса транслируются с помощью разных стратегий экспрессии. Отсутствуют какие-либо клинические ассоциации внутри этого бицистронного гена.

Functionally Similar Gene Products that Are Differentially Co-Expressed


Two Proteins with Similar Structure and Function Are Differentially Expressed in the Same Biological System


FFAR1: GPR40 and GPR41
GPR40 и GPR41 кодируются бицистронным транскриптом Free fatty acid receptor 1 (FFAR1), при этом экспрессия GPR40 управляется с помощью cap-зависимого механизма, тогда как экспрессия GPR41регулируется посредством IRES [21]. GPR40, рецептор средней и длинной цепочки жирных кислот, вызывает и уровня внутриклеточного кальция, обусловленное Gαq/11, которое стимулирует высвобождение инсулина в присутствии длинной цепи жирных кислот [22]. GPR40 экспрессируется очень избирательным способом, преимущественно в панкреатических β-клетках и клетках ЖКТ [23]. GPR41также сцеплен с Gαq/11, но чувствителен к короткой цепи жирных кислот. Хотя его роль в метаболических путях β клеток до конца не охарактеризована, но GPR41 участвует в энергетическом гомеостазе. Оба белка экспрессируются в жировой ткани и периферической нервной системе [23, 24]. В beta клетках экспрессия обоих рецепторов может быть необходима для воздействия на метаболические пути. Нарушения регуляции каждого в отдельности или обоих цистронов может вызывать метаболическую болезнь. Было предположено, что совместная экспрессия этих рецепторов, активируемых жирными кислотами, может сенсибилизировать β клетки к разным типам и уровням жирных кислот [21].

meloe: MELOE-1, MELOE-2, and MELOE-3
Клетки клона меланоцитов экспрессируют два полипептида с неизвестной функцией, MELOE-1 и MELOE-2, с тандемных цистронов в meloe мРНК. Специфические Т-клеточные клоны распознают клетки меланомы, но не нормальных меланоцитов, на базе экспрессии одного из этих меланомных антигенов на поверхности клеток меланомы [15, 25]. Следовательно, MELOE-1 и MELOE-2 были исследованы в надежде на использование в T-клеточной иммунотерапии метастазирующей меланомы [15]. IRES последовательность в themeloe мРНК была обнаружена выше обеих ORFs и было предположено, что разные трансляционные механизмы 5' cap-зависимой и IRES-обусловленной трансляции могут быть ответственны за избирательную экспрессию MELOE-1 и MELOE-2 только в клетках меланомы [15]. Дифференциальная экспрессия ITAFs между нормальными меланоцитами и клетками меланомы может также рассматриваться как участвующая в активации этих антигенов только в раковых- клетках [15]. Более того, идентифицирована дополнительная ORF в 5' регионе meloe , кодирующая MELOE-3, транслируемый с помощью cap-зависимого пути [16]. MELOE-3 , как было установлено, обладает низкой иммуногенностью, что подтверждает важность целенаправленного воздействия IRES-зависимых белков MELOE-1 и MELOE-2 для иммунотерапии меланомы.

Functionally Distinct Gene Products that Have Programmatically Related Expression


Two Proteins with Distinct Functions Are Coupled for Co-Expression in the Same Biological Pathway


CdcL1/CdcL2 (PITSLRE genes): p110 and p58
PITSLRE/CDK11 удвоенные гены CdcL1 и CdcL2, каждый из которых кодирует две cyclin-зависимые изоформы протеин киназы, p110 и p58. полной длины транскрипты CdcL1/CdcL2 кодируют p110 белки. p58 продуцируется с ORF на С-терминальном конце основной ORF посредством IRES-обеспечиваемой трансляции [26]. p110 является известным регулятором транскрипции, который регулирует РНК-связывающие белки и факторы элонгации. Более того, p110 был обнаружен во всех фазах клеточного цикла [26]. Тогда как p58 связывает cyclin D3 в фазе G2/M клеточного цикла [26]. В то время как трансляция p58 усиливается во время фазы G2/M, то транскрипционная активность p110 во время клеточного цикла, скорее всего, связана с избирательной экспрессией p58 в фазе G2/M. Т.о., эти два PITSLRE гена кодируют функционально отличающиеся белки, которые программно связаны и могут подвергаться связанной экспрессии. Хотя не обнаружена ассоциация с какой-то специфической CdcL1 и dcL2, циклин-зависимые протеин киназы участвуют в ступенях фосфорилирования во время клеточного цикла, что является критическим для собственно клеточной функции.
CACNA1A: α1A and α1ACT
По крайней мере, один член семейства генов, кодирующих напряжением запираемые Ca2+ каналы, calcium voltage-gated channel subunit alpha1 A (CACNA1A), состоит из двух цистронов. CACNA1A кодирует субъединицу формирующего пору кальциевого канала, α1A, посредством канонической cap-зависимой трансляции и нового транскрипционного фактора, α1ACT, благодаря IRES-обеспечиваемой трансляции с, по крайней мере, одной слайс-формы той же самой CACNA1A мРНК [27, 28]. Этот α1A напряжением, запираемый канал Ca2+ экспрессируется на высоком уровне в окончаниях аксонов, особенно мозжечка, где он обеспечивает поступление кальция, чтобы облегчить высвобождение пузырьков нейротрансмиттера. α1ACT транслоцируется в ядро и соединяется с последовательностью энхансера, содержащего богатый AT мотив, чтобы увеличить экспрессию нескольких экспрессирующихся генов в клетках Пуркинье. Экспрессия α1ACT усиливает в клетках Пуркинье рост дендритов и развитие коры мозжечка. α1A мРНК содержит CAG повторы, кодирующие полиглютаминовый (polyQ) трек, который увеличивается при аутосомно доминантной болезни, spinocerebellar ataxia type 6 (SCA6). SCA6 приводит к избирательной дегенерации клеток Пуркинье. α1ACT, несущий увеличенный polyQ участок обнаруживает снижение функции транскрипционного фактора и оказывается токсичным для нейрональных клеток [27]. Избирательное подавление α1ACT путем целенаправленного воздействия на IRES (напр., посредством RNA interference with miRNA) у взрослых перед началом болезни может быть терапевтической стратегией при SCA6 [29].
MTPN: Myotrophin and MPD6
Ген MTPN, кодирует два белка с тандемного бицистронного транскрипта. Myotrophin транслируется с помощью канонической cap-зависимой трансляции, а MPD6 продуцируется со второго цистрона посредством IRES-обеспечиваемой трансляции. Как и в случае CACNA1A, функции двух белков, кодируемых MTPN , по-видимому, различны, но программно связаны. Первичный белковый продукт, myotrophin, участвует в димеризации NF-κB в селдечной ткани. MPD6 является антигеном, активируемым в ответ на interferon-α (IFN-α) [30]. Как результат, MPD6 участвует в иммунном ответе у ряда пациентов с polycythemia vera, хронической миелоидногенной лейкемией или раком простаты [30]. Благодаря возможности IFN-α избирательно повышать трансляцию с IRES и участию в иммунотерапии, это удивительно напоминает сходство с избирательной регуляцией meloe IRESs в раковых клетках. Отличающаяся экспрессия ITAF у меланоцитов и клеток меланомы была приписана экспрессии с разных цистронов при meloe. В случае MPD6, такая дифференциация, по-видимому, приложима к реакции на продукцию IFN-α клеток хозяина. Т.о., избирательная регуляция экспрессии в бицистронном гене представляется более сложной в свете роли MTPN в нормальной и аномальной клеточной функции.

Signaling Proteins Generated by Stimulus-Coupled Protease Cleavage or by Cap-Independent Translation


The Secondary Protein Normally Coupled to Expression and Ligand Binding of the First Protein Has a Constitutively Active Route for Expression in Physiological or Pathological States


NOTCH2: Notch2 and N2ICD
Notch2 кодирует один из 4-х рецепторных генов (Notch1-4), участвующих в высоко законсервированном лиганд-рецептор notch-сигнальном пути. Взаимодействие этих рецепторов клеточной поверхности с внеклеточным notch лигандом приводит к протеазному отщеплению C-терминального полипептида, известного как notch intracellular domain (NICD). NICD транслоцируется в ядро и вызывает транскрипцию генов мишеней посредством взаимодействий с ко-репрессорами и ко-активаторами [31]. Помимо канонического пути, используемого Notch1-4, Notch2-ICD (N2ICD) продуцируется и как независимый пептид посредством cap-независимого процесса, использующего IRES элемент, присутствующий внутри кодирующего региона мРНК Notch2 [32]. Базирующаяся на IRES экспрессия N2ICD предоставляет дополнительный способ передачи сигналов notch, подверженный иной регуляции [32]. Кроме того, этот двойной механизм экспрессии может иметь значение для понимания разных условий, ассоциированных нарушениями регуляции передачи сигналов notch, особенно принимая во внимание, что сильно отличающиеся клинические условия возникают в результате мутаций в разных доменах Notch2 [33-37]
Her2: HER2 and HER2 CTF
Her2 является частью семейства ErbB/Her рецепторных тирозин киназ, участвующих в раковых опухолях и нейродегенеративных болезнях. Her2 является полицистронным геном, кодирующим полной длины 185-kDa HER2 белок и несколько независимых С-терминальных фрагментов (~70 kD HER2 CTF) [38]. 2 methionines, один в позиции 611 и др. в 687, действуют как инициаторы трансляции для CTFs. Существование этих внутренних сайтов инициации указывает на присутствие IRES внутри кодирующего региона HER2, хотя канонические методы идентификации IRES не были осуществлены. Белок HER2 является тирозин киназным рецептором, участвующим в секреторных и эндоцитотических путях. Полной длины белок также потенциально располагается в нуклеоплазме клеток. HER2 CTFs соответствует трансмембранному и цитоплазматическому доменам в HER2 и может участвовать в экспрессии генов. Избыточная экспрессия Her2 характерна для наследственного рака груди и раковых метастазов. Терапевтическое использование антител против поверхностных HER2 является главной опорой иммунотерапии для рака груди. Однако, HER2 CTFs экспрессируется в отсутствие HER2 поверхностных рецепторов, это указывает на нечувствительность к терапии антителами. Эти опухолевые клетки были чувствительны только к киназным ингибиторам [38]. Как результат открытие полицистронной регуляции Her2 при раке может позволить улучшить разработку и отбор терапии рака.

Concluding Remarks


The organization and expression of specific proteins from mammalian polycistronic mRNAs appear to provide a similar layer of coordinated expression control to that used constitutively by invertebrates and protozoans, adding to other expression controls believed to be exclusive to mammals. Among the few examples of human polycistronic genes recognized, the additional cistrons appear to allow for: (i) co-expression of multiple subunits of a protein that is part of a complex; (ii) co-expression of similarly functioning proteins under slightly different spatial or temporal patterns; or (iii) co-production of novel, independently functioning but programmatically related proteins. Although little is understood at present about the cellular machinery involved in the regulation of these IRESs, or whether the upstream cistron product may have a role in the function of the IRES or expression of the second protein, these controls may have important implications in the understanding of health and disease (see Outstanding Questions). ITAFs have been shown to both promote and inhibit the translation of cellular IRESs, suggesting their dynamic role in regulating downstream cistron expression [6, 39]. In addition, overexpression or depleted expression of ITAFs could cause direct dysregulation of the secondary protein that could result in disease. A possible therapeutic strategy could be to use genetic knockdown or drug intervention to restore the balance of ITAF expression [40]. Additionally, a disease state may result in alternative localization or alternative cell specificity of ITAFs and thereby change the regulation of secondary protein expression. This is a critical consideration to take into account when developing therapeutics against diseases involving genes with functional IRESs [41].
In cases where polycistronic activity is compromised through mutations in important regions within the IRES, therapeutics could target the expression of the second protein independent of the IRES (e.g., via adeno-associated virus injection of a cap-dependent form of the mRNA sequence of the secondary protein) or possibly genetic editing to restore IRES function. Additionally, if the secondary protein expression needs to be abrogated, the IRES may be targeted directly through RNAi (i.e., miRNA) or small-molecule inhibitors [29, 40]. For example, selective inhibition of the function of an IRES may enable selective suppression of a disease protein, as shown in an animal model of SCA6, and could, in theory, be the case with persistent expression of HER2 intracellular protein in treatment-resistant breast tumors [29, 38]. Additionally, second cistron expression of an antigen exclusively in cancer cells, such as in the case of meloe, presents an opportunity for immunotherapy [15, 25]. Thus, if the IRES-specific mechanisms governing the expression of the additional cistrons are unique, they may be ideal drug targets. Furthermore, elucidating various IRES control mechanisms, such as eIFs, ITAFs, miRNAs, and other regulatory features, may provide insight into the mechanism of poly amino acid expression seen in diseases associated with repeat associated non-ATG (RAN) translation [42, 43]. Finally, if the function of the upstream cistron-encoded protein has a role in the expression of the downstream protein, genetic aberrations of this gene could in theory have pleiotropic consequences. For example, because depolarization may affect the translocation of the CACNA1Ccalcium channel transcription factor, CCAT, to the nucleus, gain- or loss-of-function mutations of the calcium channel portion of this gene may affect the entry of CCAT into the nucleus and expression of the array of genes under its control [44]. Thus, further understanding of the control of polycistronic gene expression in vertebrate tissues should provide new insights into different human genotype-phenotype correlations as well as treatments of human disease.