Синтетические пары оснований, впервые описаны к в 2014, могут теперь не только реплицироваться в живых клетках, но и кодировать и продуцировать белки, содержащие атипические аминокислоты. Сегодня биохимики способны генерировать полностью новые формы белков, и их функции могут создаваться обычными организмами.

Во всех формах жизни на земле генетическая информация состоит из 4-х буквенного алфавита в виде нуклеотидов G, C, A и T, которые формируют пары оснований G-C и A-T. Но три года назад химик Floyd Romesberg из Scripps Research Institute в California с коллегами расширили алфавит, сообщив о создании дополнительных искусственных нуклеотидов, X и Y, которые могут спариваться внутри ДНК и принимать участие в репликации в живых бактериальных клетках.

Сначала исследователи внесли искусственную пару оснований, X-Y, в ген для green fluorescent protein (GFP)-переключив кодон в некритической части гена с TAC (который кодирует аминокислоту тирозин) в AXC (Рис). Затем они создали транспортную РНК, которая содержала соотв. анти-кодон, GYT, и которая несла неканоническую аминокислоту, наз. PrK - добавляемую исследователями аминокислоту, которая редко обнаруживается в каком-либо природном белке. Коллектив затем экспрессировал эти два гена внутри специализированных бактерий, которые поддерживали удержание синтетических нуклеотидов внутри своей ДНК - наз. полу-синтетическими организмами, микробами продуцирующими белки GFP, содержащие нестандартную аминокислоту.

Далее группа продемонстрировала, что транскрипция и трансляция могут происходить с альтернативного синтетического кодона - GXC - и в результате будет включена еще одна неканоническая аминокислота, называемая pAzF. Они использовали несколько анализов, в том числе масс-спектрометрию и click химию для подтверждения присутствия неканонических аминокислот в белках.

Искусственная пара оснований X-Y образуется посредством гидрофобного притяжения между двумя элементами, а не водородной связью, которая обычно образует мостики между естественными парами оснований. Но X и Y нуклеотиды в остальном аналогичны - обладают такой же сахарофосфатной основой, как и нормальные нуклеотиды.

"Очень интересно, что вам не нужна водородная связь для управления передачей информации", - говорит Ричардс. Следовательно, - говорит Ву, - достаточно аппроксимировать форму пар оснований".

Однако необычная химия спаривания, вероятно, ограничивает количество таких пар искусственных оснований, которые могут быть включены в молекулу ДНК, говорит Ричардс. "Вы будете получать искажения в спирали", где оказываются эти пары оснований, объясняет он. Таким образом, одна пара оснований может приспособиться, поскольку "окружающие пары оснований Watson-and-Crick почти наверняка компенсируют это изменение. Но если бы у вас было три пары подряд, то теперь результат становится не предсказуем, сможете ли вы поддерживать спиральную структуру или будут ли ферменты действительно работать ".

Другие исследователи, в том числе Стивен Беннер из Фонда прикладной молекулярной эволюции во Флориде, создали ряд новых пар оснований, которые используют водородную связь. Они интегрируются в ДНК без нарушения двойной спирали и могут присутствовать в ДНК в виде длинных отрезков. Однако до сих пор эти нуклеотиды способны только реплицироваться, транскрибироваться и транслироваться только in vitro, поясняет Беннер.

Наиболее вероятным применением для пары искусственных оснований Ромесберга является "включение неестественных аминокислот в определенные части белков", - говорит Ву, тем самым значительно увеличивая возможности для биохимиков создавать белки с новыми функциями. Наличие уникальной аминокислоты внутри белка может, например, обеспечить присоединение лекарственного средства или другой молекулы, представляющей интерес для конкретной точки на конкретном белке. И для таких видов приложений ограничения гидрофобной связи, вероятно, "не имеют значения", говорит Ричардс.

В конечном итоге инженеры X-Y хотели "получить молекулы, которые функционируют в клетке. Это было нашей целью ", - говорит Ромсберг. "Каждый белок, вырабатываемый в любой живой клетке, был получен путем декодирования четырехбуквенного алфавита. Теперь мы сообщили об декодировании белков с шестибуквенным алфавитом ".

a, Chemical structure of the dNaM–dTPT3 UBP and a natural dA–dT base pair. b, Schematic illustration of the gene cassette used to express sfGFP(AXC)151 and tRNASer(GYT). PT7 and TT7 denote the T7 RNAP promoter and terminator, respectively. In controls where sfGFP is expressed in the absence of serT, the sequence following the sfGFP T7 terminator is absent. c, d, Fluorescence (c) and growth (d) of cells expressing sfGFP and tRNASer with the indicated position 151 codon and anticodon, respectively. Minus sign denotes the absence of serT in the expression cassette. t?=?0 corresponds to the addition of IPTG to induce expression of T7 RNAP and tRNASer (if present); aTc was added at t?=?0.5?h to induce expression of sfGFP. Individual data points shown from n?=?4 cultures, each propagated from an individual colony (biological replicates). a.u., arbitrary unit. e, Western blot of lysates (normalized by OD600) from cells collected at the last time point shown in c and d, probed with an anti-GFP antibody (N-terminal epitope). For blot source data, see Supplementary Fig. 1. f, Relative abundance of amino acids (S, I/L and N) at position 151 of sfGFP purified from cells expressing sfGFP(AGT)151 or sfGFP(AXC)151 and tRNASer(GYT), as determined by LC–MS/MS and precursor ion intensity-based quantification; amino acids detected at <0.1% (on average, for both codons) are not shown. Data shown as mean with individual values, n=4 purified sfGFP samples, each from a culture propagated from an individual colony and collected at the last time point shown in c and d.