Посещений:
Ventral neural patterning in the absence of a Shh activity gradient from the floorplate | |
---|---|
Vertebrate spinal cord development requires Sonic Hedgehog (Shh) signaling from the floorplate and notochord, where it is thought to act in concentration dependent manner to pattern distinct cell identities along the ventral-to-dorsal axis. While in vitro experiments demonstrate na?ve neural tissues are sensitive to small changes in Shh levels, genetic studies illustrate that some degree of ventral patterning can occur despite significant perturbations in Shh signaling. Consequently, the mechanistic relationship between Shh morphogen levels and acquisition of distinct cell identities remains unclear. Results: We addressed this using Hedgehog acetyltransferase (HhatCreface) and Wiggable mouse mutants. Hhat encodes a palmitoylase required for the secretion of Hedgehog proteins and formation of the Shh gradient. In its absence, the spinal cord develops without floorplate cells and V3 interneurons. Wiggable is an allele of the Shh receptor Patched1 (Ptch1Wig) that is unable to inhibit Shh signal transduction, resulting in expanded ventral progenitor domains. Surprisingly, HhatCreface/Creface; Ptch1Wig/Wig double mutants displayed fully restored ventral patterning despite an absence of Shh secretion from the floorplate. Conclusions: The full range of neuronal progenitor types can be generated in the absence of a Shh gradient provided pathway repression is dampened, illustrating the complexity of morphogen dynamics in vertebrate patterning. |
Превалирующее мнение о передаче сигналов морфогенов в развивающемся спинном мозге базируется на том. что противоположные концентрационные градиенты секретируемых молекул, а именно Shh вентрально и Wnts и BMPs дорсально, действуют совместно. чтобы специфицировать самостоятельные клеточные судьбы клеток вдоль дорсо-вентральной оси. Эта система, по-видимому, тонко регулируется, поскольку незначительные в 1 nM изменения в концентрации морфогена достаточны, чтобы индуцировать альтернативные судьбы клеток в нервном экспланте, культивируемом in vitro (Ericson et al., 1997; Briscoe et al., 2000; Dessaud et al., 2007, 2008, 2010). Однако, активация эффекторов передачи сигналов Shh, а именно Gli транскрипционных факторов, помогает создать паттерн доменов нейральных предшественников вдоль дорсо-вентральной оси (Stamataki et al., 2005; Dessaud et al., 2008).
Существуют три Gli белка, которые совместно действуют как принципиальные транскрипционные эффекторы пути Hedgehog (Jacob and Briscoe, 2003; Matise, 2013). Gli1 и Gli2 рассматриваются как активаторы транскрипции, тогда как Gli3 функционирует прежде всего как репрессор. Однако, Gli2 может действовать как репрессор в отсутствие Gli3, и напротив Gli3 может действовать как активатор в отсутствие Gli2. Gli2 и Gli3 необходимы, чтобы протеолитически превращаться в форму транскрипционного репрессора, который блокирует действие Gli белков при активации генов мишеней (Ruiz i Altaba, 1998; Sasaki et al., 1999; Wang et al., 2000, 2007; Persson et al., 2002; Bai et al., 2004). Т.о., определенные соотношения активатора и репрессора из Gli белков могут влиять на степень и эффект передачи сигналов Shh внутри эмбрионального спинного мозга.
Активность Smoothened (Smo) внутри специализированных клеточных структур, наз. первичными ресничками, обеспечивает процессинг и активность Gli, которая в свою очередь активирует экспрессию генов мишеней. Однако, др. центральный регулятор передачи сигналов Shh , Shh рецептор Patched1 (Ptch1), который ограничивает клеточную чувствительность к Shh путем ингибирования активности ко-репрессора Smoothened (Smo) (Chen and Struhl, 1996; Marigo et al., 1996; Stone et al., 1996; Zhang et al., 2001; Taipale et al., 2002; Cohen et al., 2015). Когда Hedgehog белки соединяются с Ptch1, то Ptch1 подвергается эндоцитозу, это уменьшает его ингибирующее действие на Smo, сдвигая баланс в направлении форм активаторов из Gli белков (Incardona et al., 2002). Транскрипционная активность Gli сама по себе проявляется градировано, это затем приводит к строгой активации транскрипции некоторых ключевых генов мишеней, включая FoxA2, Nkx2.2 и Olig2, которые специфицируют программы для донной пластинки, V3 промежуточных нейронов и двигательных нейронов, соотв. (Briscoe et al., 2000; Motoyama et al., 2003; Bai et al., 2004; Lei et al., 2004; Stamataki et al., 2005; Dessaud et al., 2007, 2008; Briscoe and Small, 2015). Эта сеть взаимно репрессирующих транскрипционных факторов предопределяет дорсо-вентральные домены клеток нервных предшественников (Huangfu et al., 2003; Huangfu and Anderson, 2005).
Shh градиент распознается с помощью первичной реснички клетки (Eggenschwiler and Anderson, 2007; Murdoch and Copp, 2010; Pal and Mukhopadhyay, 2015; He et al., 2017), и её важность в передаче сигналов Shh демонстрируется потерей структуры реснчики или двигательных белков, которые приводят к фенотипическим отклонениям, сходным с таковыми при потре функции компонентов пути Shh (Huangfu et al., 2003; Huangfu and Anderson, 2006; Caspary et al., 2007; Cortellino et al., 2009; Larkins et al., 2011; Qin et al., 2011; Bangs and Anderson, 2017). Ключевые компотенты пути передачи сигналов Shh, такие как Smo, концентрируются в ресничке (Huangfu and Anderson, 2006; Drummond, 2012). Секвестрирование Smo в ресничке делает возможным превращение Gli в активированные формы, это приводит к активации транскрипции генов мишеней, включая Ptch1 (Liu et al., 2005). В ответ на передачу сигналов Shh, Ptch1 становится расположенным в основании реснички, где он подавляет дальнейшую Smo-зависимую активацию Gli эффекторов (Rohatgi et al., 2007). Это ограничивает степень передачи сигналов Shh, облегчая тонкую регулировку (или стабилизацию) клеточных судеб внутри развивающейся нервной ткани (Ribes and Briscoe, 2009).
Для дальнейшей иллюстрации сложности передачи сигналов Shh, генетические исследования на мышах показали, что некоторая степень формирования нейрального паттерна может осуществляться, несмотря на потерю компонентов пути Shh. У мутантов Shh-/- хотя двигательные нейроны перестают формироваться, V0, V1 и др. промежуточные нейроны присутствуют, но расположены аномально (Chiang et al., 1996). Однако, дефекты формирования вентрального паттерна у Shh venантов может быть восстановлены у двойных мvтантов Gli3/Shh эмбрионов мыши, с известным исключением качественных особенностей донной пластинки (floorplate) и V3 промежуточных нейронов (Litingtung and Chiang, 2000; Oh et al., 2009). Более того, комбинаторная потеря Ptch1 и Gli2 и Gli3 также приводит к формированию практически нормального нейрального паттерна, особенно в отношении дорсальных типов клеток (Motoyama et al., 2003). Тот факт, что в обоих случаях не наблюдается полного восстановления вентрального паттерна, указывает, что передача сигналов Shh является наиболее критической для наиболее вентрально расположенных областей развивающейся нервной трубки. Кроме того, потеря экспрессии Shh в донной пластинке эмбрионального спинного мозга не меняет драматически формирование вентрального нервного паттерна. Это происходит, однако, в отношении изменения глиогенеза, подтверждая наличие раннего критического временного промежутка для высоких уровней, уровней Shh в хорде, задающих домены вентральных предшественников (Tian et al., 2005; Chamberlain et al., 2008; Yu et al., 2013).
Эта идея подтверждается экспериментами in vitroс участием нативной нервной ткани, которые показали, что активация программ вентральных предшественников высоко чувствительна к небольшим изменениям в уровнях Shh в течение коротких периодов времени (Ericson et al., 1997; Dessaud et al., 2007., 2010). Продолжительная экспозиция Shh служит для поддержания установленных программ предшественников и со временем предопределяет прогрессивно всё более дорсальные судьбы (Dessaud et al., 2010). Эти исследования и подтвердили мнение, что существует гибкая и адаптирующаяся реакция в ответ на уровни Shh во время формирования нейрального паттерна.
Др. способ оценить эти генетические исследования заключается в том, что динамика Shh морфогена базируется на способности негативных регуляторов изменять чувствительность клеток мишеней к градиентам Shh по прошествии времени (Dessaud et al., 2007, 2010). Это в свою очередь может помочь объяснить драматическое масштабирование (scaling) систем морфогенов, наблюдаемое у позвоночных (Uygur et al., 2016), при этом разные виды обнаруживают более, чем 3000-кратные различия в размерах тела, от недавно открытых лягушек Новой Гвинеи, которые длиной менее 8 мм до синего кита в 25 метров. В самом деле, как масштабируются градиенты морфогенов во время формирования эмбрионального паттерна, это один из интересных нерешенных вопросов биологии развития. Недавние успехи в получении изображений вживую показали, что домены нервных предшественников высоко регулятивны, адаптируются к изменениям во время роста нервной трубки (Xiong et al., 2013). Это обеспечивается, по крайней мере, частично возникновением реципрокных ингибирующих транскрипционных петель, которые динамически предопределяют границы доменов предшественников (Ribes and Briscoe, 2009; Briscoe and Small, 2015).
Критический детерминант формирования паттерна затем становится функцией изменений в чувствительности клеток мишеней на градиент Shh. Этот принцип недавно был продемонстрирован при сравнении реакции на уровни Shh в эмбриональной нервной трубке у эмбрионов кур в противовес зяблику (Uygur et al., 2016). Эмбрионы зяблика более мелкого организма по сравнению с эмбрионами кур более чувствительны к изменениям уровней Shh. Важно, что это достигается масштабированием градиента Shh принципиально с помощью снижения соотношения Gli2 и Gli3 репрессора к активатору, тем самым нервные клетки зяблика прирожденно оказываются более чувствительными к передаче сигналов Shh. Тем самым обнаруживается более утонченное мнение относительно того, как динамика морфогена регулирует формирование паттерна в развивающейся нервной системе, которое не покоится исключительно на узкой интерпретации градиента Shh по предопределению выбора дискретных клеточных судеб вдоль дорсо-вентральной нервной оси.
Мы попытались проверить, действительно ли нервная система позвоночных может быть сформирована без градиента Shh. Мы ранее описали Hedgehog acyltransferase gene (HhatCreface/Creface) инсерционных мышиных мутантов, у которых градиент Hedgehog эффективно устранен (Dennis et al., 2012). Hhat необходим, что palmitoylate диффундирующий отщепленный N-терминальный Shh пептид, Shh-Np, который облегчает дисперсию активного Shh пептида с поверхности клетки, создавая тем самым градиент Shh морфогена (Pepinsky et al., 1998; Chamoun et al., 2001; Zeng et al., 2001). Недавно мы описали новых Ptch1 мутантных мышей, наз. Wiggable(Ptch1Wiggable/Wiggable или Ptch1Wig/Wig), у которых происходит повышение передачи сигналов Shh во время эмбрионального развития (Kurosaka et al., 2014., 2015). Интересно, что компаундные мутации HhatCreface и Ptch1Wig спасаются от эффекта избыточной передачи сигналов Shh у Ptch1Wig мутантов в отношении черепно-лицевого морфогенеза и формирования паттерна краниальных нервов (Kurosaka et al., 2014, 2015). Это указывает на то, что эффекты Shh на формирование паттерн могут осуществляться без градиента, указывая на то, что репрессоры пути, которые являются частью контролируемого Ptch1, удалены.
Мы проверяли гипотезу во время развития спинного мозга у Ptch1Wig/Wig и HhatCreface/Creface мутантных мышей. Формирование нейрального паттерна в спинном мозге хорошо охарактеризованная система для изучения роли градиента морфогена Shh в спецификации судеб предшественников. Shh секретируется клетками донной пластинки (floorplate), чтобы сформировать паттерн судеб вентральных клеток в развивающейся нервной трубке. Однако, мы установили, что у HhatCreface/Creface мутантов, у которых отсутствует дальнодействующая передача сигналов Shh, образование вентральной пластинки и формирование паттерна вентральной части спинного мозга, может быть полностью восстановлено с помощью мутации Ptch1Wig. Неожиданно, HhatCreface/Creface; Ptch1Wig/Wig двойные мутанты имеют нормальную вентральную пластинку, V3 промежуточные нейроны, двигательные нейроны и спецификация вентральных промежуточных нейронов , происходит несмотря на отсутствие передачи сигналов Shh от floorplate. Эти находки подчеркивают сложную роль передачи сигналов Shh в формировании паттерна и подтверждают, что механизм абсолютного градиента не существенен для полного осуществления клеточной спецификации в развивающейся нервной трубке позвоночных. Discussion
Гипотеза морфогенов утверждает, что градированные уровни Shh необходимы для становления в полном объеме клеточных судеб предшественников в вентральной части нервной трубки (Ericson et al., 1997; Briscoe et al., 2000; Dessaud et al., 2007; Ribes and Briscoe, 2009; Briscoe and Small, 2015). Типы клеток, ближайшие к источнику Shh развиваются в ответ на самые высокие уровни концентрации морфогена, чем дальше от источника, тем более низкие уровни действуют на ткань. Как в ответ на незначительные изменения в уровнях сигнального фактора или в зависимости от продолжительности воздействия, сигналы превращаются в дискретные домены генной экспрессии и специфические типы клеток остаются в области активных исследований. Существующее мнение предполагает, что кратковременное воздействие активности морфогена Shh необходимо, чтобы инициировать программы активации генов, которые специфицируют наиболее вентральные типы клеток нервной системы (Tian et al., 2005; Dessaud et al., 2007, 2010; Chamberlain et al., 2008). Продолжающаяся передача сигналов Shh затем действует, чтобы стабилизировать эти вентральные домены, а также установить домены более дистальных клеток предшественников и способствует глиогенезу в вентральной части спинного мозга (Dessaud et al., 2010; Yu et al., 2013). Однако, пока остается ясно, что концентрации лиганда недостаточны, чтобы заставить действовать легкие отличия в сетях экспрессии генов так, чтобы коррелировать их с приобретением определенных клеточных судеб. Здесь мы предоставили генетическое доказательство, что весь диапазон типов клеточных предшественников в вентральной части нервной трубки может возникать в отсутствие градиента Shh, показав, что нижестоящая репрессия пути также притушена.
В классических системах экспериментов с использованием interrogate передачи сигналов морфогена, включая крыловые имагинальные диски личинок дрозофилы и нервную трубку у позвоночных, было показано, что реакция на Hh зависит от продолжительности экспозиции на ткани предшественника передачи сигналов Hh, чтобы полностью задействовать реакции формирования паттерна (Dessaud et al., 2007; Nahmad and Stathopoulos, 2009). Однако, имеются фундаментальные различия в механизме формирования градиента у беспозвоночных в противовес позвоночным. У беспозвоночных свободный ток или диффузия биомолекул от источника в синцитиальной цитоплазме может с готовностью устанавливать градиент морфогена (Briscoe and Small, 2015). Напротив, в нервной системе позвоночных динамически растущий псевдостартифицированный нейроэпителий делает становление градиента посредством диффузии секретируемых молекул затруднительным.
Дальнейшим осложнением этого вопроса является то, что Shh является модифицируемой липидами секретируемой молекулой, слипающейся (adhering) с клеточными мембранами и изображения вживую показали, что она может находиться на цитоплазматических выпячиваниях клеток источников, наз. цитонемами (cytonemes), чтобы влиять на судьбу клеток на расстоянии в несколько клеточных диаметров (McMahon and Hasso, 2013; Sanders et al., 2013; Xiong et al., 2013). Эти находки подтверждают, что Shh может не работать как традиционный градиент морфогена, продуцирующий реакции в виде специфических судеб клеток в соответствии с четкой интерпретацией концентрации лиганда. Более того, на in vitro эксплантах было показано, что продолжительность времени экспозиции на недетерминированную нервную ткань Shh оказывает выраженный эффект на её дифференцировку так. как это делает концентрация (Dessaud et al., 2007). Этот феномен, называется "временной адаптацией" и демонстрирует высоко динамичную природу передачи сигналов Shh во время нейрального развития. Novel Mouse Models for the Interrogation of Morphogen Gradient Dynamics in Neural Patterning
Ключевым компонентом механизма временной адаптации является контроль с помощью негативной петли обратной связи пути передачи сигналов Shh. Это управляется с помощью Shh рецептора Ptch1, который является также геном мишенью для Shh (Agren et al., 2004). Т.о., после активации Shh, продолжающаяся активация в ткани мишени быстро глушится за счет активации Shh ингибитора, Ptch1 (Cohen et al., 2015). Устойчивая активность пути должна, следовательно, нуждаться в постоянно увеличивающихся уровнях передачи сигналов Shh, чтобы преодолевать взаимное увеличение Ptch1-обеспечиваемого подавления. Устранение Ptch1, однако, должно разрывать эту ингибирующую обратную связь и приводить к увеличению чувствительности клеток мишеней к изменениям в уровнях передачи сигналов Shh.
Мутация Ptch1Wig, полученная после воздействия ENU и представляющая собой точечную мутацию в Ptch1, которая приводит к преждевременному укорочению после аминокислоты 878 (Kurosaka et al., 2015). Ptch1Wig/Wig мутантные эмбрионы обнаруживают повышенную передачу сигналов Shh в нервной трубке, это согласуется с нашим предыдущим наблюдением усиления передачи сигналов Shh в развивающемся черепно-лицевом комплексе (Kurosaka et al., 2014) и краниальных ганглиях (Kurosaka et al., 2015). Интересно, что Ptch1Wig/Wig мутантный фенотип не столь тяжелый как фенотип Ptch1LacZ/LacZ. Ptch1Wig/Wig мутанты являются летальными на ст. E11.5 и обнаруживают присутствие всего спектра характерных предшественников в развивающейся нервной трубке, несмотря на экспансию всех вентральных типов клеток, включая вентральную пластинку, p3 и pMN домены.
Напротив, Ptch1LacZ/LacZ эмбрионы, летальные на ст. E9.5, обнаруживают чрезвычайно вентрализованную нервную трубку, что сопровождается потерей большинства дорсальных типов клеток (Goodrich et al., 1997; Motoyama et al., 2003). Единственным объяснением различий в тяжести и фенотипе между двумя Ptch1 аллелями является то, что аллель Ptch1Wig всё ещё сохраняет некоторую функциональность в отношении регуляции передачи сигналов Shh. В подтверждение этой идеи, Ptch1Wig мутанты всё ещё продуцируют 83kDa репрессорную форму Gli3, хотя и на значительно редуцированных уровнях по сравнению с диким типом. Более того, белок Ptch1Wig является стабильным (Kurosaka et al., 2015), но не может локализовать единственную ресничку после Smo стимуляции в MDCK клетках. Вместо этого Ptch1Wig располагается по всей цитоплазме и клеточной поверхности. Поскольку мы не получили доказательств, что Ptch1Wig может соединяться с Shh, то лиганд-связывающий регион белка Ptch1Wig является интактным. Т.о., возможно, что Ptch1Wig может ингибировать передачу сигналов Shh путем соединения Shh комплексов с ко-рецепторами, хотя проверка этого механизма нуждается в дальнейших исследованиях. Также тот факт, что Ptch1Wig неспособен локализовать моно-ресничку после активации Smo малыми липидами, подтверждает, что эндоцитоз Ptch1 и Smo в ответ на соединение с Shh отсутствует у мутантов Ptch1Wig (Incardona et al., 2002).
Поскольку предыдущая работа показала, что активация Smo может локализовать моно-ресничку на MDCK клетках (Corbit et al., 2005), и мы теперь описали локализацию управляемой с помощью Shh мишени (Ptch1) в моно-ресничке в ответ на воздействие агониста Smo, то остается неизвестным, действительно ли это ведет к активации пути посредством Gli белков. Следовательно, возможно, что локализация белков Ptch1 и Smo в ресничке MDCK клеток не коррелирует с активацией пути Shh.
Генетически аллельPtch1Wig ведет себя как мутация с избыточной функцией Shh. На ст.E9.5, Ptch1Wig/Wig мутанты обнаруживают расширение p3 и floorplate предшественников, которые обычно перекрываются с наиболее вентральным регионом развивающейся нервной трубки на этой стадии. Это согласуется с предыдущими наблюдениями, показавшими, что клетки, подвергшиеся воздействию наивысшей концентрации Shh временно экспрессируют сеть регуляторных генов, ассоциированную с клеточными судьбами, выявляющими полный объем Shh (Balaskas et al., 2012). Реципрокные генетические ингибирующие петли затем действуют, чтобы определить со временем границы предшественников, при этом возникают отличающиеся домены клеток предшественников, подвергшихся разным уровням передачи сигналов Shh (Dessaud et al., 2007; Ribes and Briscoe, 2009; Briscoe and Small, 2015).
В случае мутантов Ptch1Wig , которые обнаруживают пониженную продукцию Gli3 репрессора, и тем самым пониженный ингибирующий контроль пути Shh, существует более высокая временная реакция на активацию программ вентральных предшественников, которая всё ещё детерминирует клеточные судьбы в дискретные домены, хотя расширяется и сдвигается дорсально. Т.о., разные домены предшественников всё ещё формируются у Ptch1Wig мутантов , это контрастирует с мутантами Ptch1null, обнаруживающих почти полное превращение нейральных судеб в качественные характеристики донной пластинки (floorplate) (Goodrich et al., 1997). Это подтверждает, что Ptch1Wig мутация сенсибилизирует эмбрион к передаче сигналов Shh. Поэтому мы получили HhatCreface/Creface;Ptch1Wig/Wig компаундных мутантов, чтобы проверить идею, что формирование нормального паттерна может обеспечиваться на Ptch1Wig мутантном фоне, демонстрируя, что уровни Shh редуцированы. Т.о., более продолжительная экспозиция клеток активной передачей сигналов Shh у Ptch1Wig/Wig мутантов может скомпенсировать снижение градиента у Hhat мутантов.
Ранее мы сообщали, что HhatCreface/Creface мутанты полностью лишены активности Shh (Dennis et al., 2012). Это было подтверждено иммунроокрашиванием для определения уровней Shh белка, используя 5E1 антитела, которые отсутствовали в floorplate при окрашивании на Shh у HhatCreface/Creface;Ptch1Wig/Wig компаундных мутантов, несмотря на мощную экспрессию мРНК. Возможно, что белок Shh неправильно укладывается у Hhat мутантов и поэтому не может быть обнаружен с помощью 5E1 антител (Fuse et al., 1999). Однако, нет доказательств, что потеря Hhat влияет на упаковку Shh и мы не наблюдали 5E1 иммуноокрашивания в хорде HhatCreface/Creface; Ptch1Wig/Wig двойных мутантов, это указывает. что белок Shh упакован правильно.
Мутация HhatCreface, следовательно, пригодна для выяснения роли градиента активности Shh во время формирования нейрального паттерна, поскольку она существенно уменьшает дальнодействие секреции Shh из floorplate, но не полностью устраняет передачу сигналов Shh (Dennis et al., 2012; Kurosaka et al., 2014, 2015). В частности, Hhat модифицирует секретируемую форму Shh (Shh-Np) с помощью palmitoyate moiety, которая существенна для становления дальнодействия передачи сигналов Shh, помогая тем самым создавать градиент Shh (Pepinsky et al., 1998; Chamoun et al., 2001; Zeng et al., 2001; Dennis et al., 2012). HhatCreface/Creface мутанты обнаруживают экспрессию Shh в хорде, но не в вентральной части нервной трубки. Как следствие, HhatCreface/Creface мутанты лишены floorplate и собственно формирования паттерна вентральной части спинного мозга, демонстрируя, что Hhatмутанты лишены способности генерировать дальнодействующие секретируемые Shh в тканях срединной линии.
Ранее мы сообщали, что HhatCreface/Creface; Ptch1Wig/Wig мутанты восстанавливают большую часть слияний по срединной линии и устраняют дефекты нейрогенных плакод у Ptch1Wig/Wig мутантов, подтверждая, что снижение репрессии пути Shh у Ptch1Wig/Wig было уравновешено с помощью потери формы дальнодействующей передачи сигналов Shh у мутантов HhatCreface/Creface (Kurosaka et al., 2014, 2015). В соответствии с этой идеей, мы теперь показали, что HhatCreface/Creface;Ptch1Wig/Wig двойные мутанты обеспечивают полное восстановление формирования вентрального паттерна спинного мозга, завершая соотв. спецификацию floorplate, p3 и pMN предшественников. Несмотря на отсутствие продукции белка Shh из вентральной пластинки, размер вентральных доменов в основном восстановлен, при этом восстановление увеличено и дорсально смещает домены p3 и pMN у Ptch1Wig/Wig мутантов. Эти типы клеток нуждаются в более высоких уровнях передачи сигналов Shh, хотя у HhatCreface/Creface;Ptch1Wig/Wig они развиваются нормально, указывая, что формирование паттерна может происходить у эмбрионов, лишенных дальнодействующей передачи сигналов Shh. Данное исследование подчеркивает сложную природу активности морфогена и подтверждает, что формирование нейрального паттерна не происходит из-за ограничений интерпретации ландшафта концентраций Shh. Вместо этого наши находки подтверждают идею, что формирование паттерна происходит благодаря взаимодействию между уровнями передачи сигналов Shh и комбинированной модуляцией репрессии, чтобы изменитиь чувствительность к Shh в клетках мишенях (Dessaud et al., 2007; Uygur et al., 2016). Implications for the Shh Morphogen Gradient Model
Каково значение эти х находок для модели градиента морфогена Shh? Во-первых, наши данные подтвердили потребность в передаче сигналов Shh для спецификации клеточных судеб в вентральной части нервной трубки. Более того, мы показали, что передача сигналов Shh от хорды необходима и достаточна для индукции формирования вентрального паттерна, поскольку Shh-/-; Ptch1Wig/Wig эмбрионы, лишенные Shh в хорде и вентральной пластинке, обнаруживают лишь частичное восстановление нейрального паттерна. Фактически, наиболее вентральные типы клеток, которые нуждаются в наивысших уровнях Shh, в именно, вентральная пластинка и p3 промежуточные нейроны не восстанавливались у этих двойных мутантов. Во-вторых, наши данные подтвердили, что градиент Shh принципиально действует в вентральной части нервной трубки, чтобы преодолевать Ptch1-обеспечиваемое ингибирование пути. Т.о., абсолютные уровни активности Shh или Gli недостаточны, чтобы специфицировать популяции нейральных предшественников, скорее существует относительный баланс Gli активаторов и репрессоров, который является критическим для формирования судеб разных классов нервных клеток, как это было постулировано ранее (Junker et al., 2014; Uygur et al., 2016).
Эта идея была также подтверждена предыдущей работой, которая показала, что аномальное формирование паттерна вентральных клеточных характеристик у мутантов Shh частично может быть восстановлено у Shh-/-;Gli3-/- двойных мутантов и у Ptch1-/-;Gli2+/-; Gli3-/- комбинированных мутантов (Litingtung and Chiang, 2000; Persson et al., 2002; Motoyama et al., 2003). В самом деле Shh-/-;Gli3-/- в основном напоминает напоминают Shh-/-; Ptch1Wig/Wig мутантов, что согласуется с функцией Ptch1 в ингибировании активации пути Shh (Junker et al., 2014). Наши находки подтверждают предыдущее наблюдение, что передача сигналов Shh в вентральной пластинке не существенна для инициации формирования паттерна в эмбриональном спинном мозге (Yu et al., 2013). Инициация формирования нейрального паттерна происходит во время раннего эмбриогенеза, когда хорда контактирует с вентральной срединной линией развивающейся нервной трубки (Tian et al., 2005; Chamberlain et al., 2008). Впоследствии продолжающаяся передача сигналов Shh необходима для стабилизации вентрального паттерна и спецификации более дистальных классов промежуточных нейронов
(Dessaud et al., 2010). Conclusions
A morphogen is defined as a molecule secreted from a localized source that directs the differential acquisition of cell fates in na?ve tissue as a function of the distance from the source (Balaskas et al., 2012; Briscoe and Small, 2015). That cells become patterned in response to a specific concentration of a secreted molecule is a central principal in developmental biology, and well supported, particularly by data generated in invertebrates (Nahmad and Stathopoulos, 2009; Swarup and Verheyen, 2012). Yet, in contrast to invertebrates, dissecting the complex genetics of morphogen gradients in vertebrate model systems is a challenge, thus the mechanistic regulation of Shh gradients remains incompletely understood (Briscoe and Small, 2015).
Here we took advantage of mouse genetic models to alter the levels and distribution of Shh in the developing neural tube, and the responsiveness of target cells to Shh signaling by reducing a negative regulator of the pathway. We tested whether ventral spinal cord patterning could proceed normally in embryos lacking Shh secreted from the floorplate as well as missing a fully functional Ptch1 receptor. We conclude that the dynamic activation of neural progenitor regulatory networks remains very much intact in HhatCreface/Creface; Ptch1Wig/Wig mutants, demonstrating that ventral neural patterning can occur normally despite a severe reduction in the Shh activity gradient. Specifically, we showed that the enhanced responsiveness to Shh signaling in Ptch1Wig/Wig mutants could still be moderated during development such that by E10.5 the HhatCreface/Creface; Ptch1Wig/Wig neural tube is patterned normally, with floorplate, p3 and pMN progenitor domains forming sharp mutually exclusive boundaries at the appropriate dorsal-ventral limits. Implicit in the standard Shh morphogen model is the direct relationship between the concentration of Shh and the acquisition of specific cell types along the dorsal-ventral axis of the neural tube (Stamataki et al., 2005; Ribes and Briscoe, 2009; Dessaud et al., 2010; Balaskas et al., 2012; Junker et al., 2014; Briscoe and Small, 2015; Cohen et al., 2015).
However, the diminished Shh activity gradient in HhatCreface/Creface embryos can be compensated by the loss of pathway repression mediated by Ptch1, allowing for the sustained activation of downstream target genes, in a manner consistent with the a temporal adaptation mechanism (Dessaud et al., 2007, 2010). Our findings support the view that the precise regulation of both morphogen levels and the modulation of intrinsic responsiveness of target cells are required for neural patterning in the vertebrate embryo.
|