Посещений:
длинные не-кодирующие РНК



Выяснение функции с помощью CRISPR-Cas9

Application of CRISPR-Cas9 for Long Noncoding RNA Genes in Cancer Research
Shuai Zhen and Xu Li
Human Gene Therapy Vol. 30, No. 1 https://doi.org/10.1089/hum.2018.063

Long noncoding RNAs (LncRNA), a class of transcripts with lengths >200 nt, play a master role in the regulation of cancer pathogenesis. Recently, the CRISPR-Cas9 system has been explored as a revolutionary genome editing tool for molecular biology. Growing evidence shows that LncRNAs can be targeted by the CRISPR-Cas9 system used for evaluating its function. Thus, the CRISPR-Cas9 systems provide a novel gene-editing strategy for the modification of LncRNA expression. This review summarizes current knowledge of the functions and underlying mechanisms of LncRNA by CRISPR-Cas9. Emerging strategies for non-viral/viral delivery of CRISPR-Cas9 in a clinical context are also discussed.
Long noncoding RNAs (LncRNAs) являются набором из не-кодирующих эндогенных РНК длиной более 200 nt, важных для регуляции многих биологических процессов (Fig. 1).1-3 и раковых опухолях человека.4-7

Figure 1. The main origins of long noncoding RNAs (LncRNAs).

LncRNAs originate from enhancer sequences (A), promoter regions (B), 5?-UTRs (C), exons (D), introns (E), intragenic regions (F), intergenic sequences (G), antisense sequences (H and I), and 3?-UTRs (J).

Генетические модификации являются важным подходом для изучения функции генов. Технологии редактирования генов, такие как нуклеазы цинковые пальчики, transcription activator-like effector нуклеазы и clustered regularly-interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) системы позволяют манипулировать с геномом человека.8
Три типа (I-III) систем CRISPR впервые были открыты у бактерий и archaea, у которых они образуют иммунную защитную систему против чужеродных вирусов (напр., фагов) и др. генетических элементов.9,10 Теоретически любая последовательность ДНК, сопровождаемая PAM, может быть распознана и расщеплена с помощью sgRNA:Cas9 ribonucleoprotein (sgRNP) комплекса.11,12 CRISPR-Cas9 система оказалась наиболее пригодной для редактирования генов,13,14 в том числе и при болезнях человека (Fig. 2).15,16

Figure 2. The mechanism of the CRISPR-Cas9 system.

Here, the current status and recent progress of LncRNA-targeted therapeutics through CRISPR-Cas9 are critically examined, along with alternative emerging strategies specifically to combine different delivery platforms and cell-fate engineering for the elucidation of LncRNAs function and LncRNA-based therapeutic intervention.

CRISPR-Cas9: A Strategy For Interrogating Lncrna Gene Function


Установлено, что система CRISPR-Cas9 позволяет получать нокаут lncRNA (Fig. 3).17 Однако, откровенные инсерции/делеции, вызываемые одиночным разрывом двоеной нити ДНК вряд ли вызывают функциональное устранение не-кодирующего гена. Поэтому необходим более сложный подход к изучению функции LncRNA. Одной из стратегий, обеспечивающих полное устранение, д. стать делеция всего геномного региона, ассоциированного с LncRNA.18 Этот подход очень эффективен.19 Однако, при делеции геномной ДНК может возникнуть вопрос, действительно ли фенотипический эффект обусловлен потерей не-кодирующего транскрипта или потенциальной регуляторной последовательности самого геномного региона.20,21 Это видно на примере систематических базирующихся на CRISPR делециях и инсерциях LncRNA Haunt.22 Авт. продемонстрировали четкие и противоположные роли для LncRNA транскрипта Haunt и его геномного локуса в регуляции кластера генов HOXA во время дифференцировки эмбриональных стволовых клеток. Так, прерывание транскрипции Haunt посредством инсерции стоп сигнала транскрипции усилило активацию HoxA. Более того, инсерции Haunt cDNA в геномные нокауты того же самого региона, оказались неспособными восстанавливать активность HoxA, продемонстрировав в конечном счете, что геномный регион Haunt усиливает регуляторную фугкцию, тогда как не-кодирующий транскрипт сам по себе, по-видимому, действует как репрессор. Очевидно, что внесение стоп сигнала транскрипции может оказаться весьма эффективным для устранения LncRNA транскрипта без существенного нарушения роли самой последовательности ДНК.23 Альтернативным подходом является целенаправленное воздействие на промоторный регион LncRNA. Путем делеции региона, окружающего промотор для LncRNA-CSR, Basu et al. продемонстрировали, что отсутствие самого транскрипта (несмотря на интактный геномный регион) разрушает контакты хроматина на длительные расстояния более 2.6 Mb, приводя к нарушению регуляции переключения изотипа в B клетках.24 Ещё одним преимуществом целенаправленного воздействия на промотор является небольшой размер делеции, необходимый для повышения эффективности редактирования. С этой целью парные guide-based CRISPR делеции промоторов LncRNA были приспособлены для широкомасштабных исследований по выявлению эффектов LncRNAs.25

Figure 3. The CRISPR-Cas9 genome editing method utilizes a guide RNA to drive the Cas9 endonuclease, which cleaves a specific sequence in the target LncRNAs.

Эти подходы могут быть улучшены при использовании системы iCRISPR.26 С помощью интеграции индуцибельной конструкции Cas9 в AAVS1 safe harbor локус индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), LncRNAs могут подвергнуться целенаправленному воздействию простых дополнительных RNA guides. Сила этой системы заключается в том, что она способна заставить дифференцироваться эти iPSCs в дальнейшем в специфические типы клеток, которые могут быть связаны с функционированием LncRNA. Более того, LncRNAs, ответственные за спецификацию клонов могут быть также идентифицированы с использованием этой системы посредством систематического устранения LncRNAs и наблюдения за возникающими в результате клеточными судьбами.

CRISPR-Cas9 System In Cancer Research


Breast carcinoma


Недавно исследовали роли LncRoR при раке груди27. Peng et al. манипулировали с экспрессией LncRoR в линиях клеток карциномы груди посредством CRISPR-Cas9 технологии. Используя эту стратегию, авт. продемонстрировали, что LncRoR способствует увеличению эстрогена и активирует путь MAPK/ERK в карциноме груди. Это представляет пример использования технологии CRISPR-Cas9, пригодной для изучения потери функции LncRNA, и предоставляет доказательства, что LncRoR может быть потенциальной мишенью для целенаправленного воздействия на estrogen-receptor-positive (ER+) карциному груди.
Singh et al.,28 показали, что LncBC200 активируется при раке груди. Среди экземпляров опухолей груди уровень LncBC200 выше в ER+ опухолях. Чтобы понять значение экспрессии ER-regulated LncBC200 при раке груди, они вызывали нокаут LncBC200 с помощью CRISPR-Cas9 технологии, чтобы супрессировать рост опухолевых клеток in vitro и in vivo. Результаты показали, что LncBC200 играет важную роль при раке груди.
В 2017, Pratirodh et al. сообщили, что LncAK023948 является позитивным регулятором пути AKT, который нарушен при многих раковых опухолях. Показано, что AK023948 активируется при раке груди, а его нокаут с использованием CRISPR-Cas9, привел к снижению прогрессирования опухоли.29 Те же самые результат получены Ho et al., использовавшими целенаправленное воздействие двух gRNA AK023948.30

Bladder cell carcinoma


Недавно, на LncRNA-UCA1 целенаправленно воздействовали с помощью CRISPR-Cas9 системы в линии клеток карциномы мочевого пузыря (5637 клетки и T24 клетки).31 Это сообщение подтвердило, что эффективность нокдауна с помощью sgRNA, нацеленной на промоторный регион в LncRNA-UCA1 составлла более 80%, тогда как эффективность нокдауна для LncRNA-UCA1-exon1 находилась между 85% и 90%. Более того, CRISPR-Cas9-UCA1-(exon1 + promoter) были ко-трансфицированы в клетки рака мочевого пузыря и наблюдалось синергичное подавление экспрессии UCA1. После делеции Lnc-UCA1, авт. подтвердили, что её подавление приводит к снижению туморогенеза.

Prostate cancer


Некоторые исследования выявили участие LncRNA в патогенезе и прогрессировании разных злокачественных образований у людей, включая рак простаты.32,33 Напр., LncRNAs оказались вовлечены в разные клеточные процессы при карциноме простаты. Beaver et al.34 подтвердили, что sulforaphane (SFN)-обусловленные альтерации в экспрессии LncRNA коррелируют с генами, регулирующими клеточный цикл, сигнальную трансдукцию и метаболизм, такими как LINC01116. Когда LINC01116 был разрушен с помощью CRISPR-Cas9, то обнаруживалось снижение жизнеспособности клеток рака простаты, подтверждая онкогенную функцию LINC01116. Они идентифицировали новую изоформу LINC01116 и подтвердили, что LINC01116 может взаимодействовать с генами мишенями. Было установлено, что SFN может влиять на экспрессию функционально важных LncRNAs.

Colorectal cancer


Проведен интересный анализ роли LncRNA в качестве функциональных компонентов онкогенов при colorectal раке (CRC).35 Сообщалось, что подавление пролиферации в клетках CRC обусловливается потерей экспрессии LncRNA CCAT2. Yu et al. использовали для этого подход CRISPR-Cas редактирования генов для целенаправленного воздействия на LncCCAT2. Нокаут LncCCAT2 повышает экспрессию miR-145 и снижает экспрессию miR-21 в клетках рака толстой кишки (HCT-116), ослабляет пролиферацию и дифференцировку. Это исследование подтвердило, что LncCCAT2 регулирует пролиферацию и дифференцировку CRC.
Ho et al., разработали целенаправленное воздействие двух gRNA на lncRNA-21A. Одновременная трансфекция двух векторов из донора и LncRNA-21A в клетки CRC (HCT-116) привела к 16.3-кратному увеличению числа колоний.30

Gastric cancer


Рак желудка (GC) один из наиболее распространенных раков в мире. Liu et al.36 манипулировали с экспрессией LncPANDAR в клетках линии GC человека с помощью CRISPR-Cas9, нацеленных на последовательности Lnc-PANDAR. Они продемонстрировали, что нокаут LncPANDAR супрессирует злокачественные свойства клеток GC и подавляет рост опухоли in vivo. Это пример того, как CRISPR-Cas9 технология может быть использована для изучения LncRNA и показывает, что LncPANDAR может быть потенциальной терапевтической мишенью при GC.

Application Of CRISPR-Cas9 Technology For Lncrna Therapeutics: The Delivery-Related Concerns


Подходы, обеспечивающие избыточность или недостаточность функции использованы для изучения роли LncRNAs. Роль LncRNAs в терапевтических подходах становится областью интенсивных исследований (Table 1). 

Table 1. LncRNA editing in cancer 
 

LncRNA        Cancer types        Ref.
RoR        Breast cancer        27

BC200        Breast cancer        28

AK023948        Breast cancer        29,30

UCA1        Bladder        33

01116        Prostate        34

CCAT2        Colorectal cancer        35

21A        Colorectal cancer        30

PANDAR        Gastric cancer        36


LncRNA, long noncoding RNAs.


Для терапевтического редактирования генома желательно ограничить экспрессию компонентов CRISPR в определенных тканях, чтобы снизить потенциальные эффекты вне мишени. В результате становится возможным ограничить экспрессию Cas белков в специфических тканях, используя ткане-специфические промоторы. Общие пертурбации гомеостаза клеток и тканей с помощью процессов доставки сами по себе могут запускать нежелательные реакции. 37 Такие неспецифические эффекты, ассоциированные с процессами доставки могут, скорее всего, быть преодолены путем минимизации концентрации липидов. Тем не менее, естественная функция Cas9 заключается в действии в качестве нуклеаз по созданию разрывов двойной нити ДНК (DSB) посредством RuvC и HNH эндонуклеазных доменов, каждый из которых разрезает одну нить мишени ДНК.38 Альтернативой к ограничению активности вне мишени CRISPR-Cas9 далее становится использование модифицированного энзима Cas9, который обладает только одним активным каталитическим доменом (обозначаемым "Cas9-nickase" или Cas9n) для специфического связывания sgRNA, и только он способен разрезать одну нить ДНК, приводя к "зарубке" или разрывы одной нити ДНК вместо DSB.39,40 Т.о., система CRISPR, делающая "dual nickase" или "две зарубки" становится методом, который может сужать частоты разрезов вне мишени для редактирования LncRNA путем использования одной Cas9 nickase и двух разных sgRNAs. Кроме того, чтобы снизить эффекты вне мишени длина sgRNA д. быть также оптимизирована. Напр., сообщалось, что укороченные sgRNAs с менее 20 гомологичными основаниями вызывают меньше эффектов вне мишени.41 Более того, два новых компонента Cas9 были созданы для снижения активности вне мишени до почти необнаружимого уровня благодаря рационально введенным мутациям: (1) улучшенная Streptococcus pyogenes Cas9 (eSpCas9) с редуцированной активностью геликазы без снижения эффективности редактирования мишени,42 и (2) вариант с высокой точностью воспроизведения SpCas9, который содержит искусственно созданные мутации в остатках SpCas9, которые обычно образуют водородные мостики с ДНК.43 Любой из этих вариантов может быть использован для редактирования генов LncRNAs.
С одной стороны, целенаправленного воздействие на один из регионов LncRNA недостаточно, т.к. некоторые болезни, включая рак, нуждаются в большем количестве мишеней из LncRNAs, чтобы нарушить патологическое состояние клетки, ассоциированной с ним. Т.о., разные подходы необходимо использовать, чтобы заставить sgRNAs целенаправленно воздействовать на многие геномные локусы, для этого необходимы разработки, мультиплексных базирующихся на CRISPR/Cas9 геном преобразующих инструментах.44 Первоначально система была разработана и сконструирована для экспрессии и доставки Cas9 нуклеазы и двух sgRNAs, экспрессируемых с независимых и отличающихся поверхностных антиген-кодирующих регионов hepatitis B virus (HBV).45 Интересно, что каждая sgRNA эффективно экспрессировалась и это делало возможным обеспечение мультиплексного редактирования гена и подавление экспрессии и репликации HBV in vitro и in vivo, предоставляя пригодную методологию, которая также приложима к базирующимся на LncRNA биомедицинским исследованиям. Однако, использование разных промоторов или преобразование некоторых воздействий может увеличивать возникновение риска побочных эффектов.46 Чтобы преодолеть эти ограничения частично, множественные sgRNAs д. быть экспрессированы с одиночного соотв. промотора одновременно и каждая sgRNA д. иметь на флангах два само-отщепляющиеся ribozymes и/или само-отщепляющиеся transfer RNA (tRNA), чтобы осуществлять активность обрезки (trimming) для высвобождения индивидуальных и функциональных sgRNAs47 против разных последовательностей miRNA. Это представляет собой привлекательную стратегию для избегания совместной доставки множественных sgRNA, кодируемых конструкций и для уменьшения количества компонентов CRISPR-Cas9 и потенциальных вредных побочных эффектов.
Но технология CRISPR-Cas9 нуждается также в улучшении систем доставки при практическом использовании. Сегодня, базирующиеся на нуклеиновых кислотах, aptamers, были успешно приспособлены к целенаправленной доставке посредством специфических рецепторов клеточной поверхности in vitro и in vivo.48 Недавно были созданы aptamerliposome-CRISPR-Cas9 химеры, внедряющие аптомер, который специфически соединяется с антигеном мембраны простаты на раковых клетках.49 Затем CRISPR-Cas9 доставляется с помощью катионовых липосом, нацеленных на polo-like kinase 1, которая экспрессируется в опухолевых клетках. Было продемонстрировано, что такая aptamer-liposome CRISPR-Cas9 химера обнаруживает значительную специфичность к типу клеток и вызывает эффект нокдауна гена in vitro и in vivo. Согласно авт. это единственный подход aptamer-cationic для обеспечения доставки CRISPR-Cas9. Однако, хотя целенаправленное воздействие на опухоли с использованием аптамеров является привлекательным использованием CRISPR-Cas9, этот подход всё ещё имеет множество проблем, поскольку имеется немного РНК аптамеров, приспособленных к целенаправленной доставке посредством специфических рецепторов клеточной поверхности. Фактически, выделение аптамерных лигандов высокого сродства само по себе затруднительно. Это указывает на необходимость претворять др. подходы с плазмидными свободными от ДНК CRISPR для CRISPR-Cas9 доставки.
Недавно Mout et al.50 сообщили об высоко эффективном методе редактирования, базирующимся на совместной доставке Cas9 белка, скомплексованного с sgRNA (Cas9-RNPs комплекс) для эффективной доставки в цитоплазму. Интересно, что nano-сборкой опосредованная доставка Cas9-RNP осуществляется преимущественно посредством зависимого от холестерола подобного слиянию мембран процесса, избегающего накопления в эндосомах Cas9 и sgRNA. С помощью этого свободного от ДНК CRISPR подхода авт. достигла примерно 90% эффективности доставки в ряде типов клеток и эффективности редактирования гена до 30%.
Комплекс Cas9 и gRNA может быть доставлен в клетку, используя экспрессионные векторы, подобные вирусным.51 5 главных вирусных векторов-ретровирусов,52 лентивирусы,53 аденовирусы,54 adeno-associated virus (AAV),55 и baculoviruses56 - используются для геномного редактирования. Среди них AAVs обнаруживают очевидные преимущества для лечения., включая очень слабую иммунную реакцию и токсичность. Более того, AAVs остаются преимущественно эписомными после трансдукции, избегая случайной интеграции вирусного генетического материала в геном хозяина, что может нарушать функцию соседних генов и вызывать инсерционный мутагенез.
Терапевтическое использование CRISPR-Cas9 для редактирования LncRNA сталкивается с проблемой в отношении трансляционного потенциала. Напр., для LncRNAs с важной ролью в физиологии клеток, регулирующих многие разнообразные мишени, важны исследования по частичной потере функции.57 Сегодня описаны технологии, базирующиеся на nuclease-deactivated Cas9, которые могут быть внесены рядом с промоторной последовательностью гена мишени, чтобы вызывать регуляцию RNA-guided транскрипции без постоянного модифицирования генома. Следовательно, активация (CRISPRa) или репрессия (CRISPRi), временный или стабильный контроль экспрессии LncRNA без нарушения геномных последовательностей необходимо исследовать. Напр., регуляция транскрипции LncRNA может быть модулирована посредством sgRNA-ведомых ДНК-связывающих белков, которые могут быть слиты с эпигенетическими модификаторами (напр., methylase или acetylase). Более того, некоторые подходы были испытаны, чтобы создать индуцибельные системы , которые используют минимальные элементы для достижения Cas9 экспрессии.58,59 Подобно miRNA, Hirosawa et al.60 разработали miRNA-responsive CRISPR-Cas9 систему, наз. miR-Cas9 switches, которая эффективно реагирует на экспрессию miRNA в клетках и пост-транскрипционно ослабляет активность Cas9 только в присутствии любой из miRNA в этих клетках мишенях. С помощью этой стратегии, используя LncRNA комплементарные последовательности к 5'-UTR в LncRNA, кодирующей Cas9, её геном-редактирующая активность может быть модулирована посредством эндогенных LncRNA сигнатур в клетках людей.

Conclusion and Future Perspectives


Despite the ethical controversies regarding non-research applications of CRISPR-Cas technology, it is clear that CRISPR-Cas represents a cutting-edge tool suitable for basic research and future therapeutic modalities. Given the flexibility in the design of sgRNA, it is now possible to target a wide range of DNA sequences containing PAM. In addition, developments in nanotechnology and materials for nonviral delivery systems, including liposomes, polymers, nanoparticles, and cell-penetrating peptides, have increased the alternatives available for the delivery of Cas proteins and sgRNAs.61 Therefore, research efforts must be encouraged to investigate the potential application of CRISPR technologies as a traditional LncRNA editing strategy for the elucidation of LncRNA function and LncRNA-based therapeutic intervention, with an emphasis on combining one or more delivery strategies that might increase the success rate of delivery of CRISPR-Cas components in cancer cells.