LncRNAs regulating stemness in aging
 Aging Cell. 2019 Feb; 18(1): e12870. doi: 10.1111/acel.12870 | |
|---|---|
|
Разные консорциумы, а именно, ENCODE project, картируют данные по экспрессии в разных типах клеток и и в разных условиях, включая стволовые клетки, предшественники и соматические клетки (Bernstein et al., 2012). Одним из первых сюрпризов стало наблюдение, что количество кодирующих генов ниже ожидаемого и параллельно с этим обнаружено экспоненциальное распределение видов РНК, лишенных кодирующего потенциала. Кроме того, высокая межвидовая изменчивость на не-кодируемом уровне указывает на роль не-кодируемой транскрипции в предопределении видовой принадлежности (Mattick & Makunin, 2006). Более того, было продемонстрировано, что некодирующие РНК обеспечивают значительно более сильно тканевую специфичность, чем белок-кодирующие гены, подчеркивая их важность в предопределении функции и качественной особенности тканевой специфичности (Cabili et al., 2011). Некодирующие РНК играют важную регуляторную роль в модулировании транскрипционно и пост-транскрипционно кодирующего транскриптома (Angrand, Vennin, Bourhis, & Adriaenssens, 2015; Mattick & Makunin, 2006), это начинает проявляться при патологических состояниях, таких как рак. Однако, как не-кодирующий транскриптом дивергирует от клеточной стволовости (stemness) к тканевому предопределению и старению и как он влияет на эти процессы. остается неизвестным.
Не-кодирующий транскриптом включает разные виды РНК, от малых не-кодирующих РНК, включая микроРНК (miRNAs), Piwi RNAs (piRNAs) малые ядрышковые РНК (snoRNAs) до длинных не-кодирующих РНК (lncRNAs), более 200 пн, но которые могут быть длиной в несколько kilobases и могут быть подразделены на разные категории. LncRNAs транскрибируются в основном с помощью Pol II и Pol I RNA polymerases и распределены по всему геному, или как антисмысловые кодирующие гены (natural antisense transcripts-NATs), псевдогены или межгенные (long intergenic non-coding RNAs - lincRNAs), кроме того, они могут быть двунаправленными, возникают в результате транс-сплайсинга или принимают разные структурные формы, которые увеличивают их стабильность (Figure 1a). Некоторые lncRNAs участвуют в сетях регуляторных генов, выполняя роли, такие как хромосомная дозовая компенсация, геномный импринтинг, эпигенетическая регуляция, контроль клеточного цикла, сплайсинг и клеточная дифференцировка (Mercer, Dinger, & Mattick, 2009; Rinn & Chang, 2012). Мутантные линии мышей по разным lncRNAs (Fendrr, Peril, Mdgt, Brn1b, or Pint) обнаруживают фенотипы в пределах от дефектов роста до аномалий в структуре неокортекса (Sauvageau et al., 2013). Все эти исследования подтвердили концепцию, что подобно кодирующим генам, lncRNAs могут выполнять критические роли in vivo (Li & Chang, 2014). Однако, принимая во внимание, что lncRNAs ответственны за 10% у мышей и за 24% у людей от всех РНК транскриптов (Atianand & Fitzgerald, 2014), количество lncRNAs с известной функцией всё ещё ограничено.
Figure 1 (a) Classification of lncRNAs. lncRNAs can adopt different classifications depending on its localization. LncRNAs can be segments of protein-coding transcripts or being transcribed from the opposite strand (natural antisense transcripts-NATs). Antisense lncRNAs could be complementary to the antisense strand of protein-coding or non?coding genes. lncRNAs could emerge from intergenic regions (lincRNAs) or from introns of coding genes. Protein-coding exons shown in dark blue and introns in light blue; lncRNAs shown in red. Additionally, IncRNAs can adopt a circular structure of covalently closed loops (circRNAs; Nigro et al., 1991; Rong et al., 2017). circRNAs could be classified into several subtypes depending on their positioning relatively to the parental linear transcript or from the integration of 1 or multiple introns and/or exons (Qu et al., 2017; Westholm et al., 2014; Zhang, Wang, et al., 2014; Zhang, Zhang, et al., 2013). (b) Expression profiles of different RNA species during senescence of human skin fibroblasts. Previously released RNA?seq data from human wt and senescent WI-38 human cells (Chen et al., 2012; Marthandan et al., 2015) were analyzed with ISAT2(v2.1.0)/Stringtie(v1.3.3b; Kim et al., 2015; Pertea, Kim, Pertea, Leek, & Salzberg, 2016) using Ensembl Homo sapiens GRCh37.74 release as template for quantification. FPKM values for each transcript were converted to log2. The threshold value chosen to identify expressed protein?coding genes was determined as previously described. (Hart, Komori, LaMere, Podshivalova, & Salomon, 2013) and for antisense and lincRNAs when FPKM > 1. Plotted values correspond to the percentage of expressed genes. Two-sided Student's t test was used for statistical analysis (***p < 0.001). (c) lncRNAs involved in gut homeostasis. In mammals, aging is associated with decreased intestinal barrier function. Differentially expressed lncRNAs may be positively involved in the response of the gut epithelium to the aging stress or, on the other hand, exacerbate the impact of aging on gut function (related to Table Table11)/ Старение является биологическим процессом, характеризующимся каскадом биохимических изменений, которые в конечном итоге приводят к функциональному распаду (Lopez-Otin, Blasco, Partridge, Serrano, & Kroemer, 2013), вызываемым накоплением старых клеток с необратимым арестом пролиферации (de Jesus & Blasco, 2012). Манипуляции с рядом старых клеток могут влиять на прогрессирование старения, демонстрируя осуществимость терапии старения для синдромов связанных с возрастом (Baker et al., 2016, 2011 ; Campisi & d'Adda di Fagagna, 2007; de Jesus & Blasco, 2012; Gil & Withers, 2016; Itahana, Campisi, & Dimri, 2007). Подобно характерной особенности lncRNA, существующей и коррелирующей со сложностью разных тканей, процент генов lncRNA, экспрессируемых во время старения в первичных фибробластах человека, лучше всего отражает разные качественные особенности клеток, если сравнивать с экспрессией кодирующих генов (Figure 1b). Сначала было выявлено влияние ("footprint") некоторых ассоциированных со старением lncRNAs (SAL-RNAs) (Abdelmohsen et al., 2013), подчеркнув связь между lncRNAs и старением. Более того, было установлено, что целенаправленное воздействие lncRNAs (напр., SAL-RNA1-XLOC_023166) действительно задерживает старение, подтверждая непосредственную роль lncRNAs в приобретении и/или поддержании признаков старения.
Помимо их зависимой от последовательности роли, lncRNAs могут становиться разными структурами при одной и той же последовательности, приводя к разным биологическим свойствам. Напр., кольцевые РНК. Одним из любопытных примеров является анти-смысловой транскрипт, совместно существующий в локусе INK4a-ARF (опухолевый супрессор, ассоциированный с stemness, старением и раком; Li et al., 2009) наз. ANRIL (Aguilo, Zhou, & Walsh, 2011; Holdt et al., 2016). ANRIL может принимать линейную и/или кольцевую форму. ANRIL имеет 19 экзонов (Burd et al., 2010; Pasmant et al., 2007) , что приводит к образованию нескольких сплайс-транскриптов (Folkersen et al., 2009). Интерпретация биологической функции ANRIL оказывается очень затрудненной. ANRIL, как было установлено, напр., регулирует соседний ген опухолевого супрессора в цис-положении с помощью эпигенетических механизмов (Lee, 2012) и это коррелирует с риском атеросклеротической сосудистой болезни в случае новых кольцевых изоформ (cANRIL; Burd et al., 2010). Это исследование выявило корреляцию структуры и функции ANRIL, открывая возможность, что специфические манипуляции со структурой ANRIL могут менять специфические клеточные процессы, такие как старение. LncRNAs, как было установлено, также активно участвуют прямо или косвенно в др. связанных со старением путях, таких как восприятие питательных веществ (nutrient sensing) (Dang, 2014; Meng et al., 2007; Mourtada-Maarabouni, Pickard, Hedge, Farzaneh, & Williams, 2009; Wang, Pang, et al., 2014; Zhang, Zhu, et al., 2013), динамике теломер (Azzalin & Lingner, 2008; Azzalin, Reichenbach, Khoriauli, Giulotto, & Lingner, 2007; Cao et al., 2009; Cusanelli & Chartrand, 2014; Montero, Lopez de Silanes, Grana, & Blasco, 2016; Schoeftner & Blasco, 2008, 2009a, 2009b) и в p53-ассоциированном и эпигенетически регулируемом старении (Bracken et al., 2007; Dietrich et al., 2007; Gil, Bernard, Martinez, & Beach, 2004; Jacobs, Kieboom, Marino, DePinho, & Lohuizen, 1999; Marin?Bejar et al., 2013; Puvvula et al., 2014). Роль lncRNAs в этих путях была рассмотрена в др. работе (Degirmenci & Lei, 2016). 2. STEMNESS AND AGING
2.1. Impact of aging on adult stem cells
Стволовые клетки обладают потенциалом самообновления и дифференцировки в разные клоны, давая начало различным типам специализированных клеток и тканей у взрослых (Watt & Hogan, 2000). Большинство взрослых органов сохраняет ограниченную регенеративную способность, что, по-видимому, зависит от резерва стволовых клеток (которые поддерживают самообновление, потенциал плюрипотентности после сигналов мобилизации; Bianco & Robey, 2001; Korbling & Estrov, 2003). Хотя стволовые клетки обладают специализированными характеристиками, которые защищают их от внешних инсультов, старение влияет на гомеостаз стволовых клеток, приводя в результате к остановке самообновления стволовых клеток и пролиферации (Ermolaeva, Neri, Ori, & Rudolph, 2018; Goodell & Rando, 2015). Стволовые клетки подвергаются зависимому от возраста накоплению повреждений ДНК и укорочению теломер (Flores & Blasco, 2010; Flores et al., 2008), что непосредственно влияет на на функцию стволовых клеток и в конечном итоге на продолжительность жизни (Ruzankina et al., 2007; Vilas et al., 2018). Интересно, что, по крайней мере, некоторые фенотипы старения стволовых клеток могут быть частично задержаны. Примером может служить эффект против старости ограничения калорий в пище (Mazzoccoli, Tevy, Borghesan, Delle Vergini, & Vinciguerra, 2014). Ограничение калорий, как было установлено, удлиняет способность стволовых клеток само-обновляться, пролиферировать, дифференцироваться и замещать клетки в некоторых из взрослых тканей. Действительно ли lncRNAs могут действовать непосредственно или косвенно на гомеостаз стволовых клеток и являются новыми мишенями устойчивости стволовых клеток к процессам, вызывающим старение (Chen, Zhu, et al., 2017; Bernardes de Jesus et al., 2018; Li et al., 2017; Ramos et al., 2013).
Стволовые клетки взрослых являются редкой популяцией недифференцированных клеток, способных к самообновлению и к дифференцировке в клон-специфические ткани обычно внутри ниш, в которых они пребывают (Dulak, Szade, Szade, Nowak, & Jozkowicz, 2015). Стволовые клетки взрослых замещают поврежденные клетки, возникшие в результате оборота ткани или повреждений. Высокая текучесть клеток в органах, как известно, замещается стволовыми клетками взрослых, хотя считается, что некоторые ткани взрослых сохраняют популяцию стволовых клеток у взрослых даже в отсутствие обнаружимой пролиферации (Dulak et al., 2015). Хорошо охарактеризованные примеры высокого оборота в ткани - это кишечник, кровь или мышцы. здесь стволовые клетки взрослых играют критическую роль в гомеостазе ткани (Wagers & Weissman, 2004). Во время периода жизни стволовые клетки взрослых также стареют, что сопровождается снижением их свойств (Ahmed, Sheng, Wasnik, Baylink, & Lau, 2017). Старение затрагивает в основном, но не только, высокий оборот в тканях, таких как происходящие из костного мозга мезенхимные стволовые клетки и соотв. гематопоэтические стволовые клетки (HSCs), скелетные мышцы или кишечник. 2.1.1. lncRNAs in adult skeletal muscle stem cells
Скелетные мышцы взрослых сохраняют частично способность к регенерации (Ahmed et al., 2017; Brack & Munoz-Canoves, 2016; Garcia-Prat, Sousa-Victor, & Munoz-Canoves, 2013), благодаря существованию мышечных стволовых клеток взрослых, известных как сателлитные клетки. Нарушение способности скелетных мышц регенерировать, особенно после повреждений во время старения, может обусловливать снижение тканевой функции и свойств мышечных стволовых клеток. В самом деле, во время старения сателлитные клетки обнаруживают замедленную реакцию на активирующие сигналы, приводя к снижению пролиферативной реакции (Brack et al., 2007; Conboy, Conboy, Smythe, & Rando, 2003; Garcia-Prat et al., 2013; Schultz & Lipton, 1982; Taylor-Jones et al., 2002). Некоторые lncRNAs, как было установлено, участвуют в процессе регуляции дифференцировки и регенерации мышц (Hagan et al., 2017). LncRNAs участвуют в миогенезе, включая Malat1, linc-RAM, MUNC, lnc-mg, и linc-31. Chen et al. продемонстрировали, что Malat1 регулирует экспрессию генов во время миогенной дифференцировки (Chen, He, et al., 2017). Предполагается, что в пролиферирующих миобластах Malat1 в высоком изобилии и приводит к триметилированию гистона 3 по лизину 9 (H3K9me3) и к последующей репрессии экспрессии гена мишени путем рекрутирования Suv39h1 на MyoD-связывающие локусы. Во время дифференцировки Malat1 деградирует, дестабилизируя тем самым репрессивный комплекс и приводя к активации гена мишени. Итак, Chen et al. идентифицировали регуляторную ось в контроле миогенеза с помощью Malat1, продемонстрировав ингибирующую роль Malat1 во время миогенной дифференцировки. Linc-RAM привлекается на ст. дифференцировки миогенеза путем регуляции транскрипции MyoG (Yu et al., 2017). LncRNA MUNC целенаправлено воздействует на РНК, таких как myogenin и Myh3, участвующих в миогенной дифференцировке (Mueller et al., 2015). Lnc-mg специфически обогащена в скелетных мышцах и существенна для дифференцировки мышечных клеток и развития скелетных мышц (Zhu et al., 2017). Наконец, Dimartino et al показали, что lnc-31, lncRNA, необходимая для пролиферации миобластов, стабилизирует YB-1 фактор, это позволяет ему оказывать положительный эффект на трансляцию мРНК Rock1 (Dimartino et al., 2018; see Table.1). Др. мышечно-специфические lncRNAs включают LincMD1, которая контролирует мышечную дифференцировку, действуя как competitive endogenous RNA (ceRNA) на miR-133 и miR-135, регулируя экспрессию MAML1 и MEF2C (Cesana et al., 2011). Избыточная экспрессия linc-MD1 коррелирует с ранним действием программы мышечной дифференцировки. Хотя они и доказывают участие в программе мышечной регенерации, но корреляции мышечных lncRNAs с процессом старения всё ещё отсутствуют. Недавно новая lncRNA (Chronos) была идентифицирована в старых мышцах (Neppl, Wu, & Walsh, 2017). Chronos регулирует процесс, приводящий к постепенной потере мышечной массы, возникающей по мере старения. Chronos позитивно активируется с возрастом. Подавление Chronos вызывает гипертрофию мышц за счет модуляции передачи сигналов Bmp7 (Neppl et al., 2017). Table 1 LncRNAs regulating stem cells in adult organs Names Mechanism References Adult skeletal muscle stem cells MALAT1 MyoD suppression through Suv39h1/HP1Я/HDAC-1 Chen, He, et al. (2017)) linc-RAM Enhance MyoG transcription through MyoD-Baf60c-Brg1 Yu et al. (2017) MUNC Increase myogenic-related mRNAs Mueller et al. (2015) lnc-mg Myogenic signaling (IGF2) Zhu et al. (2017) Linc-31 Required for myoblast proliferation Dimartino et al. (2018) linc-MD1 Controls muscle differentiation (ceRNA) Cesana et al. (2011) Chronos Induces hypertrophy of the muscle through the modulation of Bmp7 Neppl et al. (2017) Adult hematopoietic stem cells lncHSC-1 Regulate HSC differentiation via cell cycle and chromatin regulators Luo et al. (2015) lncHSC-2 Regulate HSC differentiation via cell cycle and chromatin regulators Luo et al. (2015) Spehd Silencing lead to defective multilineage differentiation Delбs et al. (2018) Gut WiNTRLINC1 Controls intestinal stem cell fate through ASCL2 Giakountis et al. (2016) T-UCR uc.173 Stimulates growth of the small intestinal mucosa Xiao et al. (2018) H19 Disrupts the gut epithelium by degradation of ZO-1 and E-cad mRNAs Zou et al. (2016) SPRY4-IT1 Controls the expression of several tight junctions' proteins Scherr et al. 2.1.2. LncRNAs and HSC
Hematopoietic stem cells (HSCs) специализированными кровь-формирующими стволовыми клетками (Birbrair & Frenette, 2016), которые поддерживают самообновление во время всей жизни. Активность HSCs регулируется с помощью клеточных внутренних и внешних механизмов. Старение затрагивает эту регуляторную сеть, приводя к снижению количеств HSC, характеризующихся нарушенными функциями (Pietras, Warr, & Passegue, 2011). Luo с колл. сравнивали экспрессию lncRNA в HSC разных возрастов (старые HSCs обнаруживали дефекты пополнения популяции) и у WT и DNA methylation-deficient Dnmt3a KO HSCs (Dnmt3a-/- HSCs с дефектами дифференцировки) (Challen et al., 2011). Они сконцентрировались на двух lncRNAs, LncHSC-1 иd LncHSC-2, которые экспрессировались на высоком уровне в WT HSC, но отсутствовали в Dnmt3a KO HSCs. Кроме того, они также идентифицировали небольшие субнаборы lncRNAs (29 из 159) с измененной экспрессией между 4mo и 24mo HSCs. Неожиданно lncRNAs, чья экспрессия была изменена с возрастом, оказались не охарактеризованными (Luo et al., 2015). Действительно ли связанные со старением lncRNAs могут играть сходную роль в усилении формирования колоний в контексте старения, пока неизвестно (Figure.1c). Недавно, Delбs с колл. охарактеризовали субнабор мышиных lncRNAs, экспрессия которых связана в гематопоэтической дифференцировкой. Среди кандидатов была идентифицирована одна lncRNA, Spehd, замалчивание которой приводило к дефициту в миелоидных предшественниках их пути оксидативного фосфорилирования (Delбs et al., 2018). Повысился интерес к lncRNAs с появлением новых технологий. 2.1.3. Gut
Эпителий кишечника является само-обновляющейся тканью, зависящей от внутренне присущих процессов, включая мобилизацию. пролиферацию и дифференцировку базальных стволовых клеток. Быстрое деление и мобилизация новых клеток необходимы для уравновешивания хорошо отрегулированного апоптического процесса (Wang & Xiao, 2017). Этот баланс регулируется с помощью внутренних и внешних сигналов. Нарушения кишечного эпителия могут возникать у пациентов с серьезными болезнями, приводящими к проникновению токсических веществ в кровь. Сходным образом, с др. генотоксическими сигналами старение приводит к тяжелым изменениям гомеостаза кишечника (Wang & Xiao, 2017). У Drosophila, старение приводит к увеличению количества и пролиферации дисфункциональных стволовых клеток (Moorefield et al., 2017; Tran & Greenwood-Van Meerveld, 2013). У млекопитающих старение ассоциирует со снижением барьерной функции кишечника (Tran & Greenwood-Van Meerveld, 2013) и нарушениями абсорбции питательных веществ (Holt, 2007). Мышиные модели ускоренного старения указывают на фенотипические изменениям в эпителии кишечника, включая несовершенную регенерацию, нарушения регуляции способности стволовых клеток к делениям (Fox, Magness, Kujoth, Prolla, & Maeda, 2012), и отклонения в канонической передаче сигналов Wnt (Liu & Rando, 2011), пути, участвующем в поддержании и мобилизации стволовых клеток. Giakountis et al. (2016) описали lncRNA, наз. WiNTRLINC1, которая позитивно регулирует экспрессию ASCL2, транскрипционного фактора, контролирующего судьбу кишечных стволовых клеток. WiNTRLINC1 и ASCL2 образуют feed-forward регуляторную петлю, контролирующую экспрессию генов, связанных с контролем стволовых клеток. Этот регуляторный циркуит, как было установлено, участвует в прогрессировании колоректального рака. Может ли он участвовать в старении, пока неизвестно. Др. класс РНК, участвующий в гомеостазе кишечника, - это lncRNAs транскрибируемые с ультра-консервативных регионов (T-UCRs). Xiao с колл. описали паттерны экспрессии T-UCRs в кишечном эпителии (Xiao et al., 2018). T-UCRs обладают самостоятельной динамикой после пищевого голодания. При этом T-UCR uc.173 стимулирует рост слизистой тонкого кишечника. Благодаря консервации, наблюдаемой в этом классе транскриптов, эти находки могут указать на пути для терапевтических стратегий, стимулирующих регенерацию слизистой кишечника во время старения (Xiao et al., 2018). Др. lncRNAs, участвующие в биологии кишечника, - это lncRNA H19 и lncRNA SPRY4-IT1. H19 это законсервированная lncRNA, транскрибируемая с импринтируемого кластера генов H19/Igf2. H19 экспрессируется на высоком уровне во время эмбриогенеза, но её уровни снижаются во время старения (Fu et al., 2008). H19 является молекулярной губкой и соединяется с разными miRNAs (Kallen et al., 2013). Изобилие H19 нарушает функцию эпителия кишечника возможно путем усиления деградации и репрессии трансляции zonula occludens protein 1 (ZO-1) и мРНК E-cadherin (Zou et al., 2016), двух белков, участвующих в формировании и регуляции эпителиального барьера (Bhatt, Rizvi, Batta, Kataria, & Jamora, 2013; Furuse, Izumi, Oda, Higashi, & Iwamoto, 2014; Tian et al., 2011; Zou et al., 2016). Др. исследования далее продемонстрировали, что эктопическая экспрессия H19 индуцирует уровни нескольких miRNAs (miR-675-3p или miR-675-5p) в клетках кишечного эпителия (IECs) (Dey, Pfeifer, & Dutta, 2014). Дисфункция эпителиального барьера может быть ответственна за повышение уровней этих miRNAs. Подобный сценарий наблюдается при раке, потере импринтинга локуса IGF2-H19 во время старения (Fu et al., 2008) и может возникать из-за аномальной экспрессии H19, и др. генов в этом локусе, приводя к мобилизации дисфункциональных кишечных стволовых клеток (Grammatikakis, Panda, Abdelmohsen, & Gorospe, 2014). Др. примером является SPRY4-IT1, широко экспрессируемая lncRNA в разных тканях человека, включая слизистую кишечника (Khaitan et al., 2011). SPRY4-IT1 усиливает барьер кишечного эпителия за счет увеличения плотных соединений (Xiao et al., 2016). SPRY4-IT1 экспрессируется на высоком уровне в стволовых клеток кишечника. Замалчивание SPRY4-IT1 подавляет экспрессию некоторых белков плотных соединений, нарушая функцию эпителиального барьера. Лентивирусная экспрессия SPRY4-IT1 (Scherr et al., 2007) защищает кишечный барьер у мышей, подвергшихся воздействию внешних стрессов. Интересно, что уровни SPRY4-IT1 в слизистой снижаются у пациентов с диагнозом повышенной проницаемости кишечника (IGP) по сравнению с контролем (Wang & Xiao, 2017). Уровни SPRY4-IT1 коррелируют с уровнями репрессии плотных соединений, это указывает на потенциальную роль этой lncRNA в восстановлении измененных фенотипов слизистой (Wang & Xiao, 2017). Манипуляции с этими lncRNAs могут оказаться благоприятными для зависимой от возраста потери гомеостаза кишечника. 3. AGING ROADBLOCKS DURING CELLULAR REPROGRAMMING-A ROLE FOR LNCRNAS?
Несколько альтернативных in vitro методологий было оптимизировано для репрограммирования и/или экспансии подобных эмбриональным стволовых клеток их взрослых тканей. В частности, Yamanaka с колл. установили, что экспрессия 4-х транскрипционных факторов, а именно, Sox2, Klf4, Oct4 и c-Myc, в фибробластах кожи человека и мыши превращает их в "стволо-подобное" состояние, наз. induced pluripotent stem cells (iPSCs; Takahashi & Yamanaka, 2006; Yamanaka, 2009). Вероятность замещения исходных ретровирусных и лентивирусных векторов путем использования не встраивающихся стратегий была протестирована и используется с тех пор (Sun, Longaker, & Wu, 2010), и сюда входят некодирующие РНК игроки. В самом деле, вскоре после выделения первых iPSC создан протокол репрограммирования, согласно которому внесение miRNA мимикрирует эмбриональные стволовые клетки (ESCs), специфические miRNAs усиливают образование мышиных iPSC, и замещают функцию c-Myc во время репрограммирования (Judson, Babiarz, Venere, & Blelloch, 2009). Тщательное исследование дифференциального распределения кодирующего и не кодирующего транскриптома у стволовых и дифференцированных клеток позволило раскрыть новые мишени в барьерах репрограммирования. Обусловленное избытком регенеративного потенциала во время клеточного репрограммирования позволило подумать о его пригодности в области старения (Ocampo, Reddy, & Belmonte, 2016; Soria-Valles & Lopez-Otin, 2016). Индуцированные плюрипотентные клетки, получаемые во время клеточного репрограммирования стареющих тканей, вызывало преобразование в них ассоциированных со стрессами и старением эпигенетических меток (Lapasset et al., 2011; Liu et al., 2011; Zhang et al., 2011). Стирание меток старения является критической ступенью во время клеточных и тканевых регенеративных стратегий.
Старение было идентифицировано как препятствие процессу репрограммирования iPSC. В самом деле, репрограммирование старых клеток в iPSCs очень неэффективный процесс, дающий клетки, которые не проходят промежуточные стадии и не приобретают полностью характеристики плюрипотентности. Описаны разные барьеры в старых клетках, объясняющие эти ограничения. Среди путей, участвующих в клеточном старении, может быть один из ключевых барьеров, по крайней мере, у мышей (Banito et al., 2009; Hong et al., 2009; Kawamura et al., 2009; Li et al., 2009; Marion et al., 2009; Tat, Sumer, Pralong, & Verma, 2011; Utikal et al., 2009; Zhao et al., 2008). Старые клетки характеризуются необратимым арестом клеточного цикла, высокой экспрессией локуса ink4a/ARF и некоторыми изменениями в клеточных характеристиках, таких как конденсация хроматина и секреторные фенотипы (Campisi & d'Adda di Fagagna, 2007; de Jesus & Blasco, 2012; Kuilman, Michaloglou, Mooi, & Peeper, 2010). Клеточное перепрограммирование, как было установлено, сильно зависит от способности клеток делиться (Hanna et al., 2009; Hanna, Saha, & Jaenisch, 2010), её потеря это характерный признак старения. Однако, барьер, обнаруживаемый во время старения, который может влиять на эффективность клеточного репрограммирования, изменяет затрагиваемый mTOR (target of rapamycin) путь. TOR ингибиторы могут действовать, путем облегчения мезенхимно-эпителиального перехода (MET; Chen et al., 2011), так что клетки мезенхимного происхождения, такие как взрослые фибробласты. подвергаются MET во время клеточного репрограммирования (Li et al., 2010; Samavarchi-Tehrani et al., 2010). В самом деле, экспрессия Zeb2 (Beltran et al., 2008; Wang, Guo, et al., 2013), EMT фактора, как было установлено, возрастает с возрастом и становится барьером на пути клеточного репрограммирования (Bernardes de Jesus et al., 2018). Подавление Zeb2 в стареющих и старых взрослых фибробластах оказывает значительное воздействие на их репрограммирующую эффективность (Bernardes de Jesus et al., 2018). Снижение эффективности репрограммирования старых клеток может указывать на неспособность большинства клеток полностью приобретать состояние, подобное стволовым клеткам. Более того, действительно ли iPSCs , происходящие из старых клеток, имеют те же самые свойства плюрипотентности, что и произошедшие из молодых, не было тщательно проанализировано. В этом отношении старые донорские клетки, как было установлено, резистентны к нормальному деметилированию во время репрограммирования у людей, приводя к ~5% повышению уровней глобального метилирования (Lo Sardo et al., 2017). Это подчеркивает сходство iPSCs из старых донорских клеток с накоплением более стохастических эпигенетических ошибок во время репрограммирования, что может влиять на экспрессию импринтируемых lncRNAs и вызывать снижение в iPSCs потенциала плюрипотентности.
3.1. LncRNAs as part of the stem cell network LncRNAs уже давно были ассоциированы с клеточной стволовостью (Loewer et al., 2010) , при этом более 100 lncRNAs, как известно, связаны с транскрипционными факторами плюрипотентности (Sheik Mohamed, Gaughwin, Lim, Robson, & Lipovich, 2010). Некоторые lncRNAs обнаруживают непосредственное участие в поддержании плюрипотентности, в непосредственной регуляции транскрипционных факторов (TFs), или участвуют в процессах репрограммирования (Guttman et al., 2011; Loewer et al., 2010). Совместная деятельность lncRNAs и стволовости была также подтвержден за счет прямой ассоциации с плюрипотентностью TFs, таких как Oct4, Sox2 или Nanog с промоторами lncRNAs, подтверждая прямую регуляцию уровней lncRNAs при репрограммировании клеток и сохранении стволовости (stemness preservation) (Loewer et al., 2010). Одним из примеров является lncRNA-RoR, которая, как было установлено, участвует в репрограммирующем превращении (Wang, Xu, et al., 2013). lncRoR работает как miRNA губка, защищающая плюрипотентность TFs от целенаправленного воздействия miRNA. Плюрипотентным кандидатом, прямо регулирующим lncRNAs является онкоген c-Myc. Хотя он традиционно связан с раком (Dang, 2012) и возможно является во вторую очередь игроком во время репрограммирования соматических клеток, присутствие c-Myc в репрограммирующем коктейле увеличивает выход iPSCs. Недавно было продемонстрировано, что не-кодирующий транскрипт, наз. PVT1 lncRNA, присутствует поблизости от локуса c-Myc,, по-видимому, увеличивая стабильность белка c-Myc путем защиты белка c-Myc от обусловленной фосфорилированием деградации, поддерживая тем самым высокие уровни Myc (Tseng et al., 2014).
Регуляция дифференцировки стволовых клеток в направлении детерминированных клонов с помощью lncRNAs пока плохо охарактеризована. Мышиные ESCs остаются недифференцированными в присутствии leukemia inhibitory factor (LIF), который работает путем активации signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3; Cartwright et al., 2005). Недавно было отмечено, что подавление lncDC, новой lncRNA, экспрессируемой в обычных дендритных клетках (DCs; Wang, Xue, et al., 2014) человека, нарушает дифференцировку DC из клеток костного мозга мышейin vitro и in vivo. Эти эффекты обеспечивались за счет активации транскрипционного фактора STAT3, за счет непосредственного связывания lncDC с STAT3 в цитоплазме, это способствует фосфорилированию STAT3. Эти находки согласуются с предыдущим исследованиями, демонстрирующими роль lncRNAs помимо ремоделирования хроматина. Идентификация специфичных для стволовых клеток lncRNAs может привести к характеризации lncRNAs, важных для идентификации качественных особенностей стволовых клеток и выявления новых барьеров, ограничивающих процесс репрограммирования в определенных старых клетках.
3.2. lncRNAs and epigenetic rewiring during reprogramming До открытия экстенсивной не-кодирующей транскрипции по всему геному с помощью высоко-производительного исследования, lncRNAs были уже давно известны как участвующие в эпигенетических процессах X-chromosome inactivation (XCI) и геномного импринтинга (Lee & Bartolomei, 2013). Геномный импринтинг является эпигенетическим феноменом, который затрагивает субнабор генов, моноаллельно экспрессирующихся в соответствии с их родительским происхождением (Barlow & Bartolomei, 2014). Эти гены часто располагаются в одних и тех же геномных регионах, известных как импринтируемые кластеры, организации обладающие общим механизмом регуляции импринтинга. В самом деле, все импринтируемые кластеры имели цис-действующие imprinting control regions (ICRs), которые эпигенетически дифференциально маркировались с помощью метилирования ДНК CpG в двух родительских аллелях. Интересно, что большинство импринтируемых кластеров имеют, по крайней мере, одну lncRNA, которая экспрессируется моно-аллельно и регулируется с помощью метилирования ДНК CpG. Эти lncRNAs могут быть межгенными или антисмысловыми к реципрокно импринтируемым генам. Они, как полагают, регулируют импринтируемую экспрессию соседних генов, действуя на саму транскрипцию или путем рекрутирования комплексов, модифицирующих хроматин, как это было описано в случаях Airnc, Kncq1ot1 и Meg3 lncRNAs (Kaneko, Son, Bonasio, Shen, & Reinberg, 2014; Latos et al., 2012; Nagano et al., 2008; Terranova et al., 2008). Эти исследования проложили путь для исследований роли многих lncRNAs и их связи с эпигенетическим аппаратом, а именно, энзимами метилирования и деметилирования и с хроматин-модифицирующими комплексами (Quinn et al., 2016). Эпигенетически родственные lncRNAs могут участвовать в процессе старения. Напр., Xist lncRNA, как известно, подавляется во время старения in vitro (Abdelmohsen et al., 2013). Недавние геномные исследования четко подчеркнули наличие эпигенетических часов в тканях мыши и человека, базируясь на связанных с возрастом изменениях в метилирования ДНК (Hannum et al., 2013; Horvath, 2013; Stubbs et al., 2017; Weidner et al., 2014). В самом деле, сигнатура метилирования ДНК при старении неприкрыта и способна предсказывать хронологический возраст и функциональное снижение данной ткани (Horvath, 2013; Stubbs et al., 2017). Действительно ли такие эпигенетические изменения вызывают или являются следствием процесса старения, всё ещё неясно.
Во время репрограммирования в iPSC происходит массивное переписывание программ дифференцировки в состояние, похожее на таковое в стволовых клетках, в течение короткого промежутка времени. Старые клетки сталкиваются с добавочным слоем эпигенетического преобразования, т.к. это необходимо не только для эпигенетической перестройки памяти донорских клеток, но и также для их специфичных для старения характеристик (Hochedlinger & Plath, 2009; Mertens et al., 2015). Это может объяснить их пониженную эффективность в репрограммировании, как это четко было продемонстрировано при изучении клеток мышей (Mahmoudi & Brunet, 2012). Напр., когда происходит полная реверсия специфичных для старения эпигенетических свойств (Mertens et al., 2015), то некоторые могут сохраняться (Lo Sardo et al., 2017), это может препятствовать возникновению плюрипотентности и качественных iPSCs, произошедших из старых донорских клеток.
Др. аспектом является то, что эпигенетически-чувствительные локусы, такие как импринтированные регионы могут быть дерегулированы во время этого процесса. В самом деле, ошибки импринтинга были задокументированы в iPSCs мышей и людей (Ma et al., 2014; Nazor et al., 2012; Stadtfeld et al., 2010; Sun et al., 2012), вызывающие несоответствующее молчание или биаллельную экспрессию импринтированных генов, включая импринтированные lncRNAs. В частности, эти ошибки периодически повторяются в Dlk1-Dio3 импринтированном кластере, где гиперметилирование приводит к потере экспрессии некоторых импринтированных не-кодирующих транскриптов, включая Meg3 и Meg8 lncRNAs (Ma et al., 2014; Stadtfeld et al., 2010). Как следствие эти iPSCs теряют признаки своей плюрипотентности. В самом деле, Meg3 OFF мыши hiPSCs вносят незначительный вклад в химерных мышей и неспособны генерировать "all-iPSC" мышей, наиболее точный тест на плюрипотентность (Carey et al., 2011; Liu et al., 2010; Stadtfeld et al., 2010). Сходным образом, MEG3 OFF человеческие iPSCs неспособны дифференцироваться в соотв. нейрональные клоны (Mo et al., 2015). Эти результаты показывают, что главной ролью для Dlk1-Dio3 является импринтинг в плюрипотентность и подтверждает участие импринтируемых lncRNAs в детерминации полностью развитого потенциала iPSCs. Могут ли эти стохастические эпигенетические ошибки влиять на импринтинг во время неэффективного процесса перепрограммирования в iPSC старых клеток и могут ли они объяснить до некоторой степени их пониженную неспособность становиться iPSCs и роль импринтируемых lncRNAs в этих процессах, всё это интересная область дальнейших исследований. 3.3. MET transition during reprogramming of aged cells
Мезенхимно-эпителиальные переход (MET) является первым важным решением, которое принимают клетки во время репрограммирования, необходимое, для преодоления (Sancho-Martinez & Izpisua Belmonte, 2013), особенно, если используются наиболее благоприятные происходящие из мезенхимы фибробласты в качестве клеток доноров (Li et al., 2010). Важно форсировать экспрессию E-cadherin (эпителиальные маркер) (Redmer et al., 2011) или регулируемый ниже Zeb2, который облегчает переход MET, повышает эффективность перепрограммирования (Wang, Guo, et al., 2013). Действительно ли MET может быть замедлен во время репрограммирования старых iPSCs и действует ли как aging барьер для репрограммирования, недавно было нами раскрыто (Bernardes de Jesus et al., 2018). Более того, мы установили, что lncRNA, наз. Zeb2-NAT, естественный анти-смысловой транскрипт Zeb2, выступает в качестве молекулярной мишени для улучшения репрограммирования старых клеток. (Mattick, 2010; Mercer & Mattick, 2013; Zhang, Yang, & Chen, 2014). NATs являются особой группой с очень интересными характеристиками, в частности, обусловленными анти-смысловой транскрипцией, с потенциальной регуляторной ролью смысловых белок-кодирующих генов (Beltran et al., 2008; Bernardes de Jesus et al., 2018; Matsui et al., 2008; Wang, Chung, et al., 2014; Zong et al., 2016). Это может быть общим регуляторным модулем, как известно, 72% геномных локусов мыши и человека транскрибируются со смысловой и анти-смысловой нитей (Werner, Carlile, & Swan, 2009). Zeb2-NAT перекрывает Zeb2 5'UTR регион и приводит к удержанию его первого интрона, который обладает последовательностью IRES, приводящей к функциональной трансляции Zeb2 белка. Интересно, что экспрессия Zeb2 и Zeb2-NAT, по-видимому, коррелируют с процессом старения, т.к. обнаруживают высокий уровень экспрессии в старых фибробластах. Кроме того, Zeb2-NAT, по-видимому, предшествует экспрессии РНК Zeb2 в протоколе дифференцировки (Bernardes de Jesus et al., 2018). В частности, наблюдалось, что экспрессия Zeb2-NAT предшествует экспрессии её анти-смысловой кодирующей пары Zeb2, указывая на разные регуляторные сети и указывая на функциональное участие анти-смысловой транскрипции в клеточном перепрограммировании и старении. В целом анти-смысловая транскрипция может действовать локально, вмешиваясь в функциональные уровни смысловых транскриптов или выступая в качестве регуляторных хабов (hubs), ответственных за дисперсию регуляторных сигналов на соседние гены (Pelechano & Steinmetz, 2013). Действительно ли смысловая и анти-смысловая транскрипция могут осуществляться в одной и той же клетке или в одно и то же время, только предстоит выяснить. Важность дивергентной транскрипции, наблюдаемой в sense-antisense транскрипционных парах, была недавно оценена Lou с колл., которые элегантно увязали дивергентные РНК с детерминацией клеточных клонов (Luo et al., 2016). Дивергентные lncRNAs, как было установлено, относительно многочисленны, так что совместно локализуются и ко-экспрессируются с онтогенетическими и регулирующими транскрипцию генами и оказываются ассоциированными с эпигенетическими маркерами, участвующими в дифференцировке регуляторных сетей (Luo et al., 2016). Zeb2-NAT lncRNA является примером lncRNA, экспрессирующейся в большей степени в старых клетках, чья экспрессия может быть смодулирована и может улучшать репрограммирование iPSC из старых клеток (Bernardes de Jesus et al., 2018). Очевидно, что могут существовать и др. lncRNAs со сходными характеристиками, это может быть установлено с помощью высоко чувствительных исследований транскриптома, таких как новая native elongating transcript sequencing technology (mNET-seq), которая обеспечивает разрешение в один нуклеотид (Nojima et al., 2015) или global run-on sequencing (GRO-seq) (Core, Waterfall, & Lis, 2008) среди прочих техник высокого разрешения. 4. LNCRNAS AS ANTI-AGING THERAPIES
Как упоминалось выше, lncRNAs выступают как потенциальные мишени для терапии старения. Их не-кодирующая природа и специфические особенности (такие как конформационная сложность, клеточная локализация или взаимодействия) необходимо принимать во внимание при разработке стратегий эффективной модуляции lncRNA.
Модифицированные олигонуклеотиды, по-видимому, наиболее охарактеризованные и целенаправленно воздействуют на lncRNAs. Антисмысловые олигонуклеотиды традиционно используются в качестве механизма для исследования функции некоторых lncRNAs in vitro и in vivo. Недавно выявлены новые олигонуклеотиды, обладающие доменами распознавания РНК или ДНК и доменами расщепления, они могут выступать в качестве новой мощной стратегии с повышенной специфичностью и стабильностью, чтобы воздействовать на lncRNAs независимо от их клеточной компартментализации (Bhartiya et al., 2012; Jadhav, Scaria, & Maiti, 2009; Lennox & Behlke, 2016; Suryawanshi et al., 2012), в особенности. когда включают модификации оснований, такие как locked nucleic acids (LNA). Пока всё ещё стоит вопрос об уровне доставки и целенаправленного воздействия, благодаря тому факту, что разные олигонуклеотиды работают клетках и тканях специфическим образом. Более того, пути доставки иногда неэффективны и могут приводить к побочным эффектам. Несмотря на это разработаны каталитические олигонуклеотиды, обладающие модификациями оснований, придающими устойчивость и специфичность в отношении lncRNAs, которые всё ещё являются наилучшей стратегией по достижению удовлетворительных уровней подавления зрелые lncRNAs, избегнувших генетических модификаций. Примеры включают стратегию, разработанную для целенаправленного действия на синдром Angelman у мышей (Meng et al., 2015). Синдром Angelman вызывается материнским дефицитом UBE3A, при этом отцовская копия UBE3A замалчивается с помощью lncRNA, наз. UBE3A-ATS (Tan & Bird, 2016). Целенаправленное воздействие на Ube3a-ATS с помощью antisense oligonucleotides (ASOs) устраняет до некоторой степени когнитивный дефицит, ассоциированный с болезнью (Meng et al., 2015). Можно ли использовать ту же самую стратегию у людей, пока неизвестно. Др. примером является SAMMSON, lncRNA, сцепленная с меланогенезом. Целенаправленное воздействие на SAMMSON посредством внутривенных вливаний ASO в модели человеческого ксенотрансплантата достоверно снижает рост опухоли и клеточную пролиферацию (Leucci et al., 2016; Matsui & Corey, 2017). Кроме того, модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды были использованы эффективного для лечения болезней человека, таких как hypercholesterolemia и inflammatory bowel disease (Marafini et al., 2015; Toth, 2013). Использование модифицированных анти-смысловых олигонуклеотидов при нейромышечных и нейродегенеративных болезнях с моногенными причинами, стали недавно предметом клинических испытаний (напр., Duchene muscular dystrophy; Koo & Wood, 2013; Wilton & Fletcher, 2005).
|