С момента открытия циркулирующей свободно ДНК плодов в кровообращении в конце 1990s, разработан неинвазивный пренатальный скрининг (NIPS) для детекции распространенных хромосомных анеуплоидий с использованием простых проб крови от беременных женщин^4-7. NIPS обладает значительно более высокой чувствительностью, чем традиционный скрининг материнской сыворотки на трисомию 21, 18 и 13 (refs. 1,2,8). NIPS также вмё чаще используется для скрининга анеуплоидии и микроделеций половых хромосом^9-12. Кроме того, скрининг популяции носителей осуществляется с 1970s, для тяжелых рецессивных моногенных болезней^13,14. Мы установили, что почти 60% от тяжелых постнатальных моногенных болезней являются доминантными нарушениями, при этом большинство из них вызывается мутациями de novo¹⁵, но базирующийся на популяции пренатальный скрининг для таких болезней пока недоступен, несмотря на их относительно высокую встречаемость³. Секвенирование следующего поколения (NGS) представляет собой аккуратный и гибкий подход к неинвазивной пренатальной диагностике распространенных скелетных дисплазий¹⁶. Целенаправленное неинвазивное пренатальное тестирование разработано для моногенных нарушений с использованием digital PCR, Sanger sequencing или NGS для небольшого количества вариантов или генов^16-18. Эти методы используют локус-специфические primers, которые предупреждают конкурентную детекцию многих спорадических мутаций в сильно фрагментированных cfDNA.

Мы описали новый NIPS подход для выявления de novo или 30 вариантов генов отцовски наследуемых болезней, часто ассоциированных с доминантными моногенными болезнями человека, которые могут приводить к значительным вредным для здоровья результатам с куммулятивным показателем ~1 на 600 (Supplementary Table 1). Чтобы снизить последствия шумов^19-22 мы использовали технику уникального молекулярного индексирования (UMI или молекулярное штрих-кодирование) для NGS анализа (Fig. 1a,b). Ошибки, вносимые во время подготовки библиотеки NGS и на ступени секвенирования существенно снижались с помощью метода UMI для вариантов аллельных фракций ~2.5% (P < 0.05, Fig. 1d). Затем мы разработали метод подсчета, базирующийся на single nucleotide polymorphism (SNP), fetal fraction (FF) , используя информативные родительские аллели в плодной cfDNA, присутствующие в материнской плазме (see Methods and Supplementary Table 2).

Итак, мы разработали и оценили с помощью ранних клинический экспериментов новый подход для неинвазивного пренатального секвенирования панели причинных генов для частых моногенных доминантных болезней. Свободная от клеток ДНК (cfDNA) экстрагировалась из материнской плазмы, подвергалась штрих0кодированию, обогащению и затем анализировалась с помощью NGS по определенным регионам. Низко-уровневые плодные варианты были идентифицированы с помощью статистического анализа, приспособленного для NGS read count и плодной фракции. Патогенетические или, скорее всего, патогенетические варианты были подтверждены с помощью вторичного amplicon-based теста cfDNA. Клиническое тестирование было осуществлено при 422 беременностях при наличии или отсутствии аномальных ультразвуковых находок или при наличии семейной истории. В случаях исследований с известными исходами полученные результаты подтвердили 20 действительно позитивных, 127 действительно негативных, отсутствие ложно-позитивных и ноль ложно негативных результатов. Это первоначальное клиническое исследование продемонстрировало, что неинвазивный тест предоставлять ценную молекулярную информацию по детекции широкого спектра доминантных моногенных болезней, в добавок к современному скринингу анеуплоидий или скринингу носителей рецессивных нарушений.

Fig. 1: Development of non-invasive prenatal sequencing by applying UMI.

a, Design of UMI for the test. Single DNA molecules were first tagged through ligation with custom-designed Y-shaped adapters with a UMI which consists of 6-bp degenerate nucleotides as molecular barcode or unique molecular index. The individual samples were then indexed using Illumina primers containing 8-bp sample indexes by PCR. b, Diagram depicting molecular indexing and library construction for error suppression. A deduplication algorithm was used after sequencing for the consolidation of NGS reads sharing the same UMI. Variant calling was then performed based on consensus reads after deduplication. c, Distribution of duplicated NGS reads with the same UMIs in four distinct representative samples used to test when the NGS reads had high duplication rate. Adequate sequencing depth was achieved such that most UMI-labeled DNA molecules had at least two duplicated reads. Experiments were performed in three independent runs demonstrating similar results. d, The number of background noise variant calls (analytical false variant calls) was reduced by the application of UMIs. The means in each group with different VAFs is shown in bar graphs with error bars representing s.d. (n = 4). Statistical significance was determined by an unpaired Student's t test. Data were considered significant when the two-tailed P values were <0.05 (95% confidence interval, df = 6) as shown in those variants (labeled with *) called with VAF≤2.5% (P_VAF0.5 = 0.004, P_VAF1.0 = 0.0007, P_VAF1.5 = 0.0001, P_VAF2.0 = 0.04, P_VAF2.5 = 0.03, P_VAF5.0 = 0.4, P_{VAF 10.0} = 0.05). e, Z-value plot for de novo, paternally inherited and false analytical variants in a representative validation sample. The value on the x-axis is the sequencing depth (total counts of the UMIs) at a locus where a variant is called.

Fig.3. A total of 458 clinical samples were received from 131 clinics in the United States, Europe, and Asia in this study. Of these samples, 422 met the acceptance criteria to complete the analysis. The sample rejection criteria as well as a summary for the negative or positive results are shown.