MicroRNAs (miRNAs) являются эндогенными молекулами РНК, участвующими в посттранскрипционной регуляции генов за счет точного и частичного совпадения последовательностей связывания с не-транслируемым регионом мишеней мРНК. Т.о., miRNAs способны соединяться со многими мишенями мРНК и считается, что они ингибируют экспрессию белков целой когорты генов.^1-5 Подходящие синтетические энхансеры (mimics) или ингибиторы (antagomiRs) подвигли к исследованию терапевтического потенциала miRNA. Поэтому miRNA терапия всё больше рассматривается как новая стратегия для лечения болезней, таких как остеопороз и остеоартриты ^6,7 , или предоставляют улучшенные стратегии по преобразованию костной ткани, нацеленные на глобальный рынок, оцениваемый в 2015 в $2.5 billion.^8,9 Недавний отбор miRNAs позволил идентифицировать те, что влияют на остеогенез¹⁰ и оказалось, что в зависимости от типа клеток и вида, определенные miRNAs могут быть приспособлены к определенным ролям и функциям.^11-13 Поэтому контроль над специфическими функциями, остается ключевым при использовании miRNA терапии, правда консенсус относительно оптимальной мишени остается недостижимым.

Одной из стратегий для контроля функции специфичности miRNA является использование локальной и ткане-специфической системы доставки.¹⁴ Ранее в нашей лаб. пористый коллагеновый каркас был приготовлен для целенаправленного воздействия для репарации костной ткани путем инкорпорации разных фаз и определенных форм hydroxyapatite (HA).^15,16 Такие составные collagen-HA каркасы обнаруживали достоверную эффективность в заживлении костей у животных.^17-22 Эти каркасы в дальнейшем были использованы в качестве платформ для доставки плазмидных (p) ДНК, кодирующих bone morphogenetic protein (BMP)-2 и vascular endothelial growth factor (VEGF)2^3-25, чтобы усилить репарацию кости. Один из вариантов, coll-nanoHA (nHA) каркас, недавно продемонстрировал эффективность по доставке репортра GAPDH-silencing miR-mimics и miR-16 ингибиторов²⁶ к мишеням. Однако, когда был использован для доставки ингибитора известной miR-133a, то эта каркасная платформа продемонстрировала также эффективность в отношении репарации кости²⁷ (Mencia Castano et al. 2015, Under Revision). В данном исследовании мы надеялись получить ответ, действительно ли высоко эффективное ингибирование miR-16 может быть использовано в качетве новой терапии, для улучшения остеогенеза с помощью human mesenchymal stem cells (hMSCs).

miR-16 активно исследовалась²⁸ и была использована приблизительно при 50 разных патологиях от разных типов раковых опухолей^29-33 до прогрессирования вирусных,³⁴ бактериальных,³⁵ и паразитических инфекций³⁶ и активации системы врожденного иммунитета,³⁷ и функции респираторного эпителия³⁸ и даже транспорта нейротрансмиттеров, таких как serotonin³⁹ или некоторых нейрологических болезней, таких как болезнь Паркинсона⁴⁰ или болезнь Альцгеймера.⁴¹ miR-16 обладает также хорошо известной анти-ангиогенной ролью^42,43 и, как было установлено, повышена у пациентов в ревматоидным артритом по сравнению со здоровым контролем^44,45 , тогда как её уровень понижен при одонтогенном кератоцитозе⁴⁶ и остеосаркоме.^47,48 На сегодня не определена роль miR-16 в остеогенезе, хотя Eguchi et al. рассматривали miR-16 как маркер поддержания стволовости, который удерживает созревание ооцитов при MSC остеогенезе.⁴⁹

Интересно, что онтогенетические исследования⁵⁰ или геномный скрининг⁵¹ подчеркнули две мишени, которые могут связывать miR-16 с остеогенезом: small mothers against decapentaplegic (Smad)-5 и activin receptor (AcvR)-2a, участвующие, соотв., в передаче сигналов BMP и nodal/transforming growth factor (TGF)-β/activin . Т.к. оба этих сигнальных пути участвуют во множественных процессах развития, они также тесно связаны с MSC остеогенезом. Прямое miR-16::Smad5 взаимодействие бцло описано на протеомном уровне в клетках HeLa,⁵¹, а участие miR-16 в передаче сигналов BMP было продемонстрировано на костных клетках мышей с использованием quantitative polymerase chain reaction (qPCR).⁵² Наконец, прямое целенаправленное взаимодействие miR-16::AcvR2a было продемонстрировано в исследовании клеток линии гепатокарциномы человека HepG2 и у эмбрионов Xenopus.⁵⁰ Если miR-16 ингибирует Smad5 и AcvR2a, которые играют позитивную роль в остеогенезе, то можно предположить, что воздействие antagomiR-16 может, в свою очередь, усиливать обе эти мишени и тем самым способствовать остеогенезу с помощью MSCs. Данное исследование имело целью выявить ингибирующую роль miR-16 в остеогенезе и оценить потенциал использования ингибирования miR-16 с не вирусной nHA системой доставки, чтобы в итоге продуцировать antagomiR-16-нагруженные collagen-nHA (coll-nHA) каркасы с потенциалом новой off-the-shelf платформы для улучшения преобразования костной ткани. Мы впервые поставили цель установить роль miR-16 в остеогенезе посредством биоинформационного анализа и затем определить способность доставки nHA-based antagomiR-16 в hMSCs для повышения уровня двух предполагаемых непосредственных мишеней, Smad5 и AcvR2a, и оценить способность этого лечения для улечшения остеогенеза не только монослойной культуре, но и когда antagomiR-16 доставляется с использованием coll-nHA каркаса off-the-shelf 3D платформ.

FIG. 1. Bioinformatic exploration of miR-16. (a) Predicted (top circle) versus validated (bottom circle) targets related to osteogenesis across human, mouse, and rat for miR-16. Overlapping sections of internal circles indicate that validation has been reported in both species. (b) miRNA:target interaction for (i) miR-16 and AcvR2a and (ii) miR-16 and Smad5 across hsa, mmu, and rno species. AcvR, activin receptor. Color images available online at www.liebertpub.com/tea

Первоначальные результаты показали, что доставка antagomiR-16 эффективно увеличивает относительные уровни обеих предполагаемых мишеней и Runx2, ключевого транскрипционного фактора остеогенеза, в то же время увеличивает уровни osteocalcin. Более того, достоверное увеличение отложений минерального кальция с помощью hMSCs было обнаружено в монослое и что важнее в базирующейся на каркасе остеогенной дифференцировке, демонстрируя в итоге, что подавление miR-16 ещё больше усиливает терапевтический потенциал каркаса вместе с известным потенциалом приложений для репарации кости и т.о., обладает достоверным терапевтическим потенциалом в качестве новой стратегии преобразования костной ткани. Более того, мы подтвердили наличие дополнительных функций к уже известным miR-16 путем внедрения или её энхансеров или ингибиторов, чтобы ткане-специфически влиять на каркасы, предоставляя важные возможности для разного рода терапевтических применений.