Искусственный контроль варьирующей пространственно-временной экспрессии генов давняя цель исследователей. На сегодня доступны открытого доступа, дружественные платформы, позволяющие нам выявлять какие-либо части генетической информации генома. Подобная информация о геноме может использоваться для идентификации хорошо известных мишеней для разработки лекарств, хотя пока разработка лекарств на базе малых молекул, способных целенаправленно модулировать терапевтически важные гены, всё ещё неразвита. Поэтому необходимо использовать потенциал программируемых, sequence-специфических связывателей ДНК и улучшать их для разработки лекарств модуляторов генов.

Pyrrole-imidazole polyamides (PIPs) представляют собой наиболее охарактеризованный класс малых молекул, которые могут быть модифицированы для соединения с какой-либо предопределенной последовательностью ДНК и регулировать DNA sequence паттерны экспрессии генов в отсутствие трансгена и рентабельным способом [1,2]. Простой бинарный код был установлен, чтоабы коррелировать ДНК последовательность мишени DNA с помощью бок-о-бок антипараллельного спаривания между pyrrole (Py) и imidazole (Im) при физиологических условиях, т.е., Py/Im распознают пары C/G, а Py/Py распознают вырожденные (degenerate) A/T и T/A пары [3].

PIPs были активно использованы для регуляции экспрессии специфических генов, поскольку они могут соединяться с соотв. последовательностью ДНК и менять её взаимодействие с естественными транскрипционными факторами (TFs), которые, в свою очередь, модулируют транскрипционные сети и эпигенетический ландшафт, управляющие судьбами клеток. У эукариот TFs играют важную роль в пространственно-временной регуляции транскрипции генов, что предопределяет судьбу клеток путем модуляции генетических программ, ассоциированных с определенным фенотипом. Более 1000 TFs распознают около 200-300 коротких мотивов ДНК в промоторных и энхансерных регионах, рекрутируя гены коактиваторы или корепрессоры и трансформируя так, что генетическая информация делает возможным статус ON/OFF [4]. Специфические TFs ответственны за определенны биологические функции, а блокирование связывания таких TFs с определенным мотивом ДНК может нарушить их биологическую функцию и вызвать выраженный физиологический эффект. Напр., SOX2, Yamanaka фактор, существенный для плюрипотентности стволовых клеток и нарушение его связывания с sequence-specific DNA binder может менять судьбу дифференцировки стволовых клеток и они не будут соответствовать соотв. клону [5].

Более важно то, что PIPs служат в качестве ценной ДНК связывающей платформы, чтобы достигать биологических функций высшего порядка запрограммированным способом. Во-первых, закрепление epi-лекарств на ДНК binders, ограниченное фармакологией этих лекарств локусами мишенями, оказывает мощный эффект на ген мишень с минимальными побочными эффектами. Во-вторых, PIP-alkylating агенты способны блокировать активность RNAP в кодирующем регионе генов мишеней, чтобы sequence-специфически подавлять экспрессию генов мишеней, а пре-клинические исследования показывают, что они обладают обнадеживающим противоопухолевым эффектом. Более того, разработка ковалентных и особенно не-ковалентных conjugates для PIPs с дополнительными DNA binders возникает как новая область исследований, которая помогает преодолевать некоторые ограничения обычных PIPs. Наконец, базирующиеся на PIP флуоресцентные зонды являются важными инструментами для sequence-специфических изображений ДНК в живых клетках.

Принимая во внимание хорошо известные методы работы с использованием недавних достижений по ген-специфической модуляции с помощью биомолекул и некоторые недавние нововведения в PIPs, мы воспроизвели недавние успехи в этой области, включая разработку PIPs в качестве искусственных генетических переключателей и флуоресцентных зондов и подчеркнули трудности и будущие проблемы по их использованию в качестве лекарств. ..

При устойчивом прогрессе по достижению более высокого сродства связывания ДНК и специфичности, ковалентное сцепление PIPs с др. DNA binders, такими как such низкомолекулярные DNA binders, ДНК связывающие белки, аналоги нуклеиновых кислот и неканонические DNA binders, экстенсивно использовалось в попытках воздейсатвовать на более длинные последовательности ДНК (Fig. 6a).

/

Fig. 6. (a) Schematic illustration of covalent conjugates-based DNA binding modes.

(a1) PIP-Ht conjugates targeting PLK1 promoter. (a2 and a3) PIP-peptide conjugates binding both DNA minor and major grooves simultaneously. (a4) PIP-PNA conjugates. (a5) PIP-G4 binder hybrids binding G-quadruplex (G4) and its proximal dsDNA simultaneously. (a6) G4 induction by a hybrid PIPs binding two adjacent dsDNA sites. (b) Noncovalent cooperative DNA binding modes. (b1) Schematic illustration of DNA binding with DNA minor groove binders supplemented with metal ion-ligand interaction. Host-guest interaction assisted cooperative DNA binding with DNA binding peptides (b2), PIP-peptide conjugates (b3), and PIPs-based Pip-HoGu system (b4). (b5) Schematic illustration of Pip-NaCo system.

Низко-молекулярный ДНК связывающий аналог Hoechst (Ht), флюоресцентная окраска для ДНК, обладает строгой избирательностью к A- и T-богатым последовательностям ДНК минорной борозды. PIPs, добавленные к Ht (PIP-Ht) распознают более длинные последовательности ДНК, обнаруживают повышенную проницаемость в клетки и обладают соотв. свойствами флуоресценции для легкого определения локализации в клетке [145]. Линейные Py trimer-Ht конъюгаты соединяются с dsDNA путем формирования 1:1 комплексов с длиной распознавания до 9-bp [146]. Hairpin PIP-Ht конъюгаты целенаправлено действуют на Plk1 промотор специфически подавляя регулируемую клеточным циклом экспрессию Plk1 и тем самым задерживая рост опухолевых клеток в концентрациях 10 µM после воздействия в течение 48 ч., тогда как оставшиеся не опухолевые клетки остаются неповрежденными (Fig. 6a1). Исследования in vivo ксенотрансплантов рака челдовека мышам показали, что подкожные инъекции PIP-Ht конъюгатов приводят к достоверной супрессии роста опухолей при низкой токсичности для хозяина и при 50% - 70% снижении экспрессии Plk1 [147]. Недавно PIP-Ht конъюгаты были успешно использованы для супрессии репликации Epstein-Barr virus (EBV). Путем уничтожения EBV эписом в EBV-позитивных клетках соединение избирательно ингибирует пролиферацию EBV-позитивных клеток и замедляют EBV-позитивный опухолевый рост [148]. PIP-Ht конъюгаты на сегодня представляют кандидатов на роль базирующегося на ДНК целенаправленного лечения. Между тем исследования in vitro и in vivo специфичности их мишеней и потенциальной цитотоксичности гарантируют доказательства их терапевтической ценности.

Хотя соединяющиеся с минорной бороздой ДНК PIPs могут в принципе нарушать связывание с большой бороздой TF благодаря аллостерическим изменениям ДНК, DNA binders способны синергично контактировать как с малой, так и с большой бороздой, обнаруживая тем самым дополнительные преимущества для вмешательства во взаимодействия TF-DNA [145]. Простое внесение protonated заместителя N-propylamine в остов PIP приводит к электростатическому взаимодействию со связями DNA phosphodiester на интерфейсе между минорной и большой бороздой, приводя к усилению на три порядка величин ингибирующей активности в большой борозде взаимодействий TF-DNA [145,149,150]. Mascarenas' группа описала PIP-соединяющиеся с ДНК пептидные конъюгаты, где distamycin был ковалентно связан с ДНК-связывающими доменами TFs GCN4 и GAGA (Fig. 6a2, 3). Такие конъюгаты одновременно соединялись с большой и малой бороздой ДНК, обнаруживая значительно более высокое сродство к своим соотв. мишеням последовательностям ДНК, чем к соотв. их пептидным частям (~60-кратно) [151,152]. Олигонуклеотидами управляемое образование тройной спирали хорошо известно, как не-биологический подход для sequence-специфического распознавания ДНК и было впервые использовано для усиления сродства связывания PIP, распознавания длины и специфичности последовательностей [153]. Peptide nucleic acid (PNA) хорошо охарактеризованный DNA binder, обладающий высокой связывающей способностью при формировании из тройной (triplex) или из двойной нити интеркаляций. В присутствии псевдокомплементарной нити (pcPNA), ковалентные конъюгаты PNA-PIP (в концентрациях 0.5 µM), как было установлено, соединяются и разрезают ДНК с помощью процесса, при котором PNA соединяется с ДНК посредством интеркаляции double-duplex нити (Fig. 6a4). Сродство связывания и эффективность расщепления в отсутствие нити pcPNA или укороченных конъюгатов отсутствуют для PNA или PIP половинок [154]. Остаются нерешенными вопросы. такие как химический синтез, клеточное потребление и биологическая стабильность, которые необходимо решить до преклинических и in vivo испытаний.

Недавно базирующиеся на PIP ковалентные гибриды были успешно использованы для индукции и стабилизации ДНК G-quadruplex (G4). G4 является неканонической вторичной структурой нуклеиновой кислоты, содержащей богатые гуанином последовательности и, как полагают, регулирующей различные биологические и фармакрологические процессы [155]. Несмотря на увеличение сообщений о G4 лигандах, специфичность к мишеням индивидуальных G4 остается спорной из-за топологического сходства скелета разных G4s [156]. Путем использования специфической последовательности соседнего duplex ДНК, генерируется молекула ковалентного гибрида путем закрепления cIKP (G4 binder) на PIP , это делает возможным сочетанное распознавание G4 и его проксимального duplex (Fig. 6a5). Синергичный эффект каждого компонента связи приводит к высокому сродству связывания и умеренной специфичности последовательностей для c-myc промотора [157]. В параллельном исследовании вместо прямого связывания G4, альтернативная стратегия был нацелена на две локальные соседние последовательности dsDNA, что ещёt больше повышало специфичность распознавания индивидуальных G4 в более крупном контексте. Ковалентный PIP димер с соотв. линкером был продемонстрирован как обладающий мощной способностью управлять двумя dsDNAs closer и запускать конформационный коллапс центрального G-rich комплекса ДНК вследствие формирования G4 с эффективностью ~31% при концентрации 1 µM (Fig. 6a6) [158]. В качестве проверки концепции полученные результаты подчеркивают, что PIP димеры могут быть использованы для индукции структур G4 в нативных последовательностях и оценки стратегии по использованию димеров PIP, чтобы вызывать изменения в структурах ДНК самого высокого порядка. Эти две стратегии, осуществленные нашей группой открывают возможности по контролю биологической роли индивидуальных G4s в специфических местах генома. Дальнейшие исследования по оценке функционального потенциала в живых клетках смогут подтвердить их клинический потенциал по изменению G4-родственных раковых генов, таких как c-MYC, RAS, BCL-2 и KIT.