Белок-кодирующие последовательности генов эукариот (экзоны) прерываются не-кодирующими элементами (интронами), которые могут быть удалены из пре-мРНК с помощью сплайсесом до начала трансляции белка рибосомами. Альтернативный сплайсинг модулирует функцию гена путем создания сплайс-вариантов с альтернативной функцией или с активностью не-кодирующей РНК. Альтернативный сплайсинг является очень сложным и стохастическим процессом, подверженным воздействию шумов, вмешательств и множественных кинетических переменных, включая скорость транскрипции pre-mRNA и сборки сплайсесом (Gallego-Paez et al., 2017; Park et al., 2018; Wan and Larson, 2018). Дополнительные механизмы, регулирующие альтернативный сплайсинг, включают: (1) распознавание иерархических сплайс-сайтов; (2) ткане-специфическую модуляцию факторов, регулирующих сплайсинг; и (3) вторичная структура РНК, которая модулирует взаимодействия между транскриптами pre-mRNA, факторами сплайсинга и некодирующими, регуляторными РНК (напр. miRNAs) (Zaharieva et al., 2012; Wan and Larson, 2018). Растет интерес к сообщениям о роли болезней (напр. рака) и химических воздействий, участвующих в изменениях событий сплайсинга pre-mRNA (Cooper et al., 2009; Tang et al., 2013; Wong et al., 2018; Song et al., 2018). Ксенобиотики и химиотерапевтические агенты (Zaharieva et al., 2012; Lambert et al., 2017), UV-B облучение (Sprung et al., 2011), оксидативные стрессы (Cote et al., 2012; Melangath et al., 2017) и тяжелые металлы (Jiang et al., 2017; Li et al., 2018; Wang et al., 2018a) обладают потенциалом вызывать отклонения в характере сплайсинга pre-mRNA посредством множественных механизмов, включая изменение активности чувствительных к сплайсингу транскрипционных факторов (Kornblihtt et al., 2013). Клеточные факторы, регулирующие альтернативный сплайсинг pre-mRNA выяснены не полностью, но всё увеличивается интерес к разработке фармакотерапевтических стратегий, которые целенаправлено воздействовали бы на альтернативный сплайсинг транскриптов, связанных с раком и родственными нарушениями (Mart?nez-Montiel et al., 2017; Liu et al., 2018; Urbanski et al., 2018; Hepburn et al., 2018; Read and Natrajan, 2018).

Использование splice-switching oligonucleotides (SSO) представляет собой выдающийся подход по коррекции нарушений сплайсинга (Bauman et al., 2009), А клиническая надежность и эффективность pre-mRNA транскриптами управляемых antisense oligonucleotides (ASO) усиливает этот прогресс (Reautschnig et al., 2017). ASO-индуцируемый альтернативный сплайсинг может супрессировать трансляцию транскриптов или способствовать включению альтернативных экзонов в преобразованный транскрипт (Croft et al., 2000; Kole et al., 2012; van Roon-Mom and Aartsma-Rus, 2012). Лекарства, вызывающие пропуск экзонов, были разработаны для лечения некоторых редких болезней человека, включая мышечную дистрофию Дюшена (DMD) (McClorey et al., 2006; Adams et al., 2007; Koo and Wood, 2013). Осенью 2016 FDA позволило ускоренное использование Eteplirsen для лечения DMD (Syed, 2016), это сделало его первым SSO Лекарством, разрешенным в США (Aartsma-Rus and Krieg, 2017).

Наша группа исследует механизмы, с помощью которых внешнесредовые стрессы и воздействие ксенобиотиков может изменять паттерн сплайсинга pre-mRNA и как SSO технология может быть использована для коррекции или модификации профиля экспрессии чувствительных к сплайсингу транскриптов, связанных с болезнями (Iversen et al., 2012; Heald et al., 2014; Mourich et al., 2014; Heald et al., 2015). В данном исследовании мы манипулировали со структурой экзона vitamin D receptor (VDR), чтобы прояснить его чувствительность к событиям альтернативного сплайсинга и разработать структурные детерминанты как лиганд-зависимой, так и лигенд независимой функции, связанной с включением альтернативных экзонов. Мы полагали, что пропуск экзонов, укороченные формы VDR, отсутствие или функционального ДНК-связывающего домена (DBD) или лиганд-связывающего домена (LBD) сможет осуществлять или доминант-негативные или лиганд-независимые функции. В androgen receptor (AR) аберрантный сплайсинг способствует экспрессии лиганд-независимых AR вариантов, которые управляют прогрессированием рака простаты человека (Dehm et al., 2008; Daniel and Dehm, 2017; Guo and Qiu, 2011). Этот феномен представляет собой пример вклада регуляции сайта сплайсинга в расширение функции гена во время схватки с повышенным стрессом или болезнью (Chen and Weiss, 2015). Поскольку все 48 членов сверхсемейства NR обладают общей молекулярной структурой (Germain et al., 2006; Rastinejad et al., 2013; Bennesch and Picard, 2015), мы задались вопросом, может ли включение альтернативного экзона в VDR создавать фенотипы с избытком или потерей функции, пригодными для лечения или диагностики болезней.

VDR является внутриклеточным рецептором NR, который избирательно соединяется с гормоном vitamin D, чтобы трансдуцировать как геномный, так и не геномный сигнальные каскады (Norman, 2006). Этот класс II NR обычно гетеродимеризуется с retinoid X receptor (RXR), чтобы целенаправленно воздействовать на vitamin D response elements (VDRE) в генах мишенях, чувствительных к vitamin D гормону (Pike et al., 2014). Были предприняты значительные усилия, чтобы охарактеризовать его структуру и функцию, изучив свыше 100 кристаллических структур DBD ил LBD, доступных для изучения (Rochel et al., 2000; Shaffer and Gewirth, 2004; Orlov et al., 2012; Moln?r, 2014). Полиморфизмы гена VDR ассоциированы с болезнями человека, включая хроническую почечную болезнь (CKD) (Zmuda et al., 2000; Zhou et al., 2009) и некоторые формы рака(Köstner et al., 2009; Gandini et al., 2014). Существует более 10 естественных сплайс-вариантов VDR, меняющих структуру и функцию DBD ил LBD (Hughes et al., 1988; Kristjansson et al., 1993; Whitfield et al., 2001), однако, сложность VDR транскриптома как в нормальных, так и раковых клетках остается плохо изученной (Campbell, 2014; Long et al., 2015).

Было исследовано функциональное значение альтернативного сплайсинга гена VDR и изучен терапевтический потенциал SSO, нацеленный на изменения сигнальных каскадов VDR in vitro. VDR сплайс-варианты, лишенные экзон-специфических сегментов DBD или LBD не были идентифицированы, однако, существуют строгие доказательства, что др. стероидные рецепторы являются предметом такого типа базирующейся на сплайсинге регуляции, которая способствует лиганд-независимому способу активации генов (Bennesch and Picard, 2015). Были идентифицированы постоянно активные сплайс-варианты класса class I андрогенного рецептора (Dehm et al., 2008; Guo and Qiu, 2011; Daniel and Dehm, 2017), и минерал-кортикоидного рецептора (Zennaro et al., 2001) и постоянно активный вариант aryl hydrocarbon receptor (AhR), лишенный дискретного сегмента LBD (McGuire et al., 2001). Лиганд-независимые функции class I эстрогенового рецептора (ER) также были распознаны (Stellato et al., 2016), а усиление знания регуляции ER сплайс-варианта стало важным для использования в лечении рака груди (Heldring et al., 2007; Al-Bader et al., 2011; Zhu et al., 2018). Не было описано вариантов с избыточной функцией или постоянной актинвостью для класса II NR семейства, куда входит и рецептор тироидного гормона (TR), рецептор ретиноевой кислоты (RAR) и VDR, среди прочих. Однако, известны множественные предполагаемые механизмы, лежащие в основе лиганд-независимых функций класса II NRs, включая VDR (Castillo et al., 1999; Skorija et al., 2005; Dowd and MacDonald, 2010; Malloy and Feldman, 2013; Bikle et al., 2015; Lee and Pike, 2015) и рецептор тироидного гормона (TR) (Moriyama et al., 2016; Cvoro et al., 2016; Takamizawa et al., 2018).

Итак, искусственно созданные конструкции VDR, лишенные экзона 3 (Dex3-VDR), кодирующие часть DBD, и экзона 8 (Dex8-VDR), кодирующего часть LBD, были временно трансфицированы в DU-145 клетки и стабильно интегрированы в Caco-2 клетки для изучения их эффектов на экспрессию генов и клеточную жизнеспособность. Изменения в передаче сигналов промотора VDR были отслежены по экспрессии генов мишеней (напр. CYP24A1, CYP3A4 и CYP3A5). Лиганд-зависимая передача сигналов VDR наблюдалась в вариантах, лишенных экзона 8, а достоверная потеря функции супрессии генов была выявлена для вариантов, лишенных экзона 3. Поведение избыточной функции варианта Dex8-VDR была воспроизведено in vitro, используя ASO, который индуцировал пропуск экзона 8 в дикого типа VDR. Целенаправленное воздействие ASO на сайт сплайс-акцептора экзона 8 существенно стимулировало лиганд-независимую активность VDR репортера и индукцию CYP24A1 выше контрольного уровня. Эти результаты демонстрируют, как альтернативный сплайсинг может репрограммировать функцию гена NR, подчеркивая новые механизмы токсичности и новые возможности для использования SSO в медицине.