Посещений:
ЭМБРИОГЕНЕЗ МЛЕКОПИТАЮЩИХ



Молекулярная регистрация процессов

Molecular recording of mammalian embryogenesis
Michelle M. Chan, Zachary D. Smith, Stefanie Grosswendt, et al.
Nature volume 570, pages77–82(2019)

Развитие многоклеточного организма из одной клетки является удивительным процессом. Классические эксперименты по отслеживанию клонов с использованием Caenorhabditis elegans дали неожиданные результаты, которые включали различия между клонами и функциональным фенотипом, но несмотря на это успешно развивались благодаря высоко детерминистической природе развития у данного организма1. Более сложные виды генерируют крупные и более разработанные структуры, которые проходят через множественные превращения, которые ставят вопросы о координации между спецификацией и детерминацией, чтобы гарантировать полное воспроизведение в точности плана тела2,3. Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) делают возможными беспрецедентные исследования гетерогенности типов клеток и дают профили развития плоских червей4,5, лягушек6, рыбок данио7,8 и мышей9,10. Недавно базирующиеся на CRISPR-Cas9 технологии были использованы для выяснения клеточных клонов11-14, и в комбинации с scRNA-seq, чтобы генерировать карты судеб у рыбок данио15-17. Однако, эти технологии включают только одну или две взрывные генерации разнообразия штрих-кодов, которые могут быть ограничены для использования др. подходами или организмами.
В идеале молекулярный регистратор (recorder) для решения онтогенетических вопросов в сложных многоклеточных организмах л. обладать следующими характеристиками: (1) минимальное воздействие на клеточный фенотип; (2) высоко-информативное содержимое, отвечающее за сотни тысяч клеток; (3) считывание с одиночных клеток для одновременного профилирования функционального состояния15-17; (4) гибкой скоростью записи, которая может быть настроена на широкие временные рамки; и (5) непрерывная генерация отличий в ходе эксперимента. Последний момент особенно важен для развития млекопитающих, у которых пространственные планы постепенно и непрерывно специфицируются и многие возникают из небольших, временных полей предшественников. scRNA-seq выявляет популяции клеток, которые имеют непрерывный спектр фенотипов, которые указывают, что дифференцировка не происходит мгновенно и подчеркивают необходимость регистрации в ходе развития18.
Мы создали и оценили метод одновременной регистрации клеточных состояний и истории клонов у мышей. Наш, базирующийся на CRISPR-Cas9 регистратор способен генерировать высоко-информационное содержание и может осуществлять много-канальную запись, способную подстраиваться под величины мутаций. Мы использовали регистратор в качестве постоянно действующего трассера клонов, чтобы наблюдать карты судеб, которые лежат в основе эмбриогенеза мыши в ходе гаструляции, воспроизводя канонические образцы и иллюстрируя как информация о клонах может облегчить идентификацию новых типов клеток.

A transcribed and evolving recorder


Чтобы достичь нашей цели подстраиваемой молекулярной записи, способной создавать высоко-информативное содержание, мы использовали Cas9 для генерации разрывов двойной нити, которые приводят к наследуемым инсерциям или делециям (indels) после репарации11-17. Мы осуществляли регистрацию внутри в 205-пар оснований 'сайта мишени' синтетической ДНК, которая содержит три 'cut sites' и статический в 8 пар оснований 'интеграционный штрих-код', которая доставляется в виде множественных копий с использованием piggyBac переноса (Fig. 1a, b). Мы внедряли эту последовательность в 3' не транслируемый регион постоянно транскрибируемого флуоресцентного белка, чтобы осуществлять получение профилей транскриптома. Вторая кассета кодировала три независимо транскрибируемые и комплементарные гид (guide) РНК, чтобы осуществлять запись множественных отличающихся сигналов19 (Fig. 1a, b).



Fig. 1: Optimization of a multi-purpose molecular recorder.

a, Target-site (top) and three-guide (bottom) cassettes. The target site consists of an integration barcode (intBC) and three cut sites for Cas9-based recording. Three different single-guide RNAs (sgRNAs) are each controlled by independent promoters (in this study, mouse U6, human U6 and bovine U6). FP, fluorescent protein; sites 1-3 are indicated. b, Molecular recording principle. Each cell contains multiple genomic, intBC-distinguishable target-site integrations. sgRNAs direct Cas9 to cognate cut sites to generate insertion (red) or deletion mutations. Here Cas9 is either ectopically delivered or induced by doxycycline. c, Percentage of uniquely marked reads recovered after recording within a K562 line with ten intBCs for six days. Information content scales with number of sites and presence of the intBC. All, all three cut sites. d, sgRNA mismatches alter mutation rate. Seven protospacers (bri1, bam3, ade2, white-O, white-B, white-L and chrl_106412) were integrated into the coding sequence of a GFP reporter to infer mutation rate by the fraction of GFP-positive cells over a 20-day time course. Single or dual mismatches were made in guides according to proximity to the protospacer adjacent motif: region 1 (proximal), region 2 and region 3 (distal). Guides against Gal4-4 and the GFP coding sequence (sgGFP) act as negative and positive controls. Sequence names in black were incorporated into the target site. P, perfect complementarity between guide RNA and protospacer; 3, mismatch in region 3; 1, mismatch in region 1; 1,2, simultaneous mismatches in regions 1 and 2.

Наша система способна хранить много информации благодаря разнообразию исходов наследуемой репарации и большому количеству сайтов мишеней, которые могут быть отличены с помощью интеграционного штрих-кода (Fig. 1c). Репарация ДНК генерирует сотни уникальных indels, и распределение каждого сайта разрыва (cut site) отличается и не является униформным; некоторые регионы приводят к очень тенденциозным исходам, тогда как др. создают отличающиеся серии20-22 (Fig. 1c, Extended Data Fig. 1). Чтобы идентифицировать последовательность, которая может тонко управлять скоростью мутирования (mutation rate), определяемой нашим регистратором на временной шкале и которая не предопределена (и может длиться от дней до мес.), мы осуществляли скрининг нескольких серий guide RNA, которые содержали не подходящие последовательности к их мишеням23 путем мониторинга их активности на GFP репортере в течение 20 дней. Мы отобрали те серии, которые демонстрировали широкие динамические пределы (Fig. 1d). Медленная скорость разрезания может также улучшать жизнеспособность in vivo, т.к. часто Cas9-вызываемые разрывы двойной нити могут вызывать токсичность в клетках24,25. Чтобы продемонстрировать информацию, записанную с транскриптомов одиночных клеток, мы стабильно трансдуцировали K562 клетки с помощью нашей технологии и генерировали первичный пул клеток с штрих-кодом кДНК посредством 10x Genomics платформы, которая позволяла нам оценить глобальный транскриптом и специфически амплифицировать мутантные сайты мишени (Extended Data Fig. 1c).

Tracing cell lineages during development


Мы использовали нашу технологию для картирования судеб клеток во время раннего развития у мышей, начиная с тотипотентности. Мы интегрировали множественные сайты мишени в геноме, доставляли постоянно закодированные Cas9-GFP спермии в ооциты, чтобы инициировать разрезы и изолировали эмбрионов для анализа приблизительно на день эмбриогенеза (E)8.5 или E9.5 (Fig. 2a, Supplementary Methods). Чтобы подтвердить нашу способность к отслеживанию клонов, мы амплифицировали сайты мишени из большей части плаценты, желточного мешка и трех эмбриональных фракций, начиная с E9.5 эмбрионов, и воспроизвели ожидаемые их взаимоотношения, используя сходства их пропорций indel (Fig. 2b, Extended Data Fig. 2).

Fig. 2: Lineage tracing in mouse from fertilization through gastrulation.

a, Lineage tracing in mouse experiments. The target site (within the 3? untranslated region of mCherry) and the three-guide array are encoded into a single piggyBac transposon vector. The vector, transposase mRNA and Rosa26::Cas9:eGFP sperm are injected into oocytes to ensure early integration and tracing in all subsequent cells after zygotic genome activation. Transferred embryos are then recovered after gastrulation. ITR, inverted terminal repeat. b, Pearson correlation coefficient heat map of indel proportions recovered from bulk tissue of an E9.5 embryo (see Extended Data Fig. 2). c, Indel frequency distribution estimated from 40 independent target sites from all embryos. Each site produces hundreds of outcomes for high-information encoding. See Extended Data Fig. 4 and Supplementary Methods for frequency calculation. The indel code along the x axis is as follows: alignment coordinate: indel size:indel type (red I, insertion; blue D, deletion). d, Proportion of indels that span one, two or three sites, shown per site. Each dot denotes 1 of 40 independent intBCs and sums to 100% across site-spanning indels. Colours indicate the guide array: P, no mismatches; 1, mismatch in region 1; 2, mismatch in region 2. e, Percentage of cells with mutations according to guide complementarity. Indel proportions within one mouse depend on timing: mutations that happen earlier in development are propagated to more cells. Dots represent site-1 measurements from independent intBCs; n = 4, 24, and 18 for no mismatches, region-2 and region-1 mismatches, respectively. f, Indel diversity is inversely related to cutting efficiency for site 1, as in e. Early mutations owing to fast cutting are propagated to more cells, which leads to smaller numbers of unique indels.

После такой проверки принципа in vivo мы генерировали данные по одиночным клеткам от дополнительных эмбрионов (Extended Data Fig. 3). Мы собрали scRNA-seq данные для 7364-22264 клеток от 7 эмбрионов (приблизительно 15.8% и 61.4% от общего количества подсчитанных клеток) и выявили 167-2461 уникальных клональных характеристик (~1 сайт мишень зарегистрированный у 15-75% клеток от 3 до 15 интеграционных штрих-кодов, Extended Data Fig. 4). Многие сайты мишени были отловлены на низких уровнях или были представлены гетерогенно, поэтому мы улучшили подход заменив укороченную форму EF1α на более длинную версию, которая содержала интрон26 (see embryo 7 in Extended Data Fig. 4).
Мы подсчитали вероятность распределения indels путем комбинирования данных от всех 7 эмбрионов. Многие indels были общими для K562 клеток; однако, их вероятности различались, это указывает на то, что типы клеток или онтогенетический статус могут влиять на исход репарации20 (Fig. 2c, Extended Data Figs. 1, 4f). Наша способность независимо измерять и контролировать скорость разрезов сайтов мишеней сохраняется in vivo и обнаруживается минимальные помехи между сайтами разрезов за исключением, когда используются комбинации более быстрых гидов (guides), что может приводить к соединению концов при одновременных разрывах двойной нити (Fig. 2d). Самые быстрые резаки приводят к высокой пропорции клеток с идентичными indels, указывая, что мутации, возникают рано в развитии и соотв. снижают разнообразие indel (Fig. 2e, f). Важно, что трассер клонов сохраняет способность регистрировать вне временного интервала, который мы исследовали, т.к. большинство эмбрионов всё ещё содержат клетки с не модифицированными сайтами разрезов (Fig. 2e).

Simultaneous scRNA-seq to assign state


Чтобы выяснить клеточную функцию, мы затем использовали аннотации из справочника по гаструляции у мышей дикого типа (E6.5-E8.5). Мы оценивали клетки от клонально-отслеживаемых эмбрионов путем определения их близости к каждой сигнатуре клеточного состояния экспрессии и определяли возраст каждого эмбриона путем их тканевых пропорций в сравнении с показателями у дикого типа27 (Fig. 3a-c). Мы проделали это с 6 из наших 7 эмбрионов, т.к. они выглядели морфологически нормальными и содержали каждый из ожидаемых типов тканей: два были картированы близко в ст. E8.5 и остальные 4 картированы на ст. E8.0 (Extended Data Fig. 5). Плацента не была специфически изолирована, но она присутствовала у 4 из 6 эмбрионов и служила в качестве ценной outgroup для установления нашей способности отслеживать переходы на более ранних бифуркациях.

Fig. 3: Assigning cellular phenotype by scRNA-seq.

a, Images of a lineage-traced E8.5 embryo (embryo 2 of 7 for which single-cell data were collected, see Extended Data Fig. 3), including for Cas9:eGFP and the mCherry target site. Scale bar, 0.2 mm. b, t-SNE plot of scRNA-seq from embryo in a. Only large or spatially distinct clusters are labelled. Inset, pie chart of germ layers. Lighter and darker shades represent embryonic and extra-embryonic components, respectively. Mesoderm is further separated to include blood (red). See Extended Data Fig. 5b for additional embryos. n = 22,264 cells. c, Dot plot of canonical tissue-specific markers. Grouping clusters of diverse tissue types into germ layers reduces the fraction of marker-positive cells, but the specificity to their respective states remains high-especially when considered combinatorially. The size of the circle denotes the fraction of marker-positive cells, and colour intensity indicates normalized expression (cluster mean). Ecto, embryonic ectoderm; EEcto, extra-embryonic ectoderm; EEndo, extra-embryonic endoderm; endo, embryonic endoderm; meso, embryonic mesoderm; EMeso, extra-embryonic mesoderm; PGC, primordial germ cell; NMPs, neuromesodermal progenitors; UMI, unique molecular identifier.

Мы также получили селекционных мышей, пригодных для изучения всех ст. развития путем введения сайтов мишеней в Cas9- фоны. Такой подход существенно увеличил количества стабильно интегрированных сайтов мишеней (до ~20). Возникающие в результате мыши были скрещены с Cas9-экспрессирующими линиями, чтобы получить жизнеспособных Cas9+ F1 потомков, которые сохраняли непрерывную, стохастическую генерацию indel у взрослых, это демонстрирует, что разрезы не значительно вмешиваются в нормальное развитие мышей (Extended Data Fig. 6).

Single-cell lineage reconstruction


Мы разработали стратегию филогенетической реконструкции, чтобы специфически эксплуатировать характеристики нашего клонального трассера: присутствие безусловных indels, необратимость мутаций и наличие отсутствующих значений (Extended Data Fig. 7, Supplementary Methods). Мы установили наилучшую реконструкцию путем суммирования логорифмических правдоподобий для всех indels, которые появляются в древе, используя подсчитанные вероятности из данных эмбрионов (Extended Data Figs. 4, 7). Когда характеристики клеточных типов из scRNA-seq накладывали на древо, то мы наблюдали функциональные ограничения во время развития и немногие типы клеток оказывались репрезентативными по мере продвижения от корня к листьям (Fig. 4a, b, Extended Data Fig. 8).

Fig. 4: Single-cell lineage reconstruction of mouse embryogenesis.

a, Reconstructed lineage tree comprising 1,732 nodes for embryo 2, with example lineages highlighted. Each branch represents an indel generation event. b, Example paths from tree in a highlighted by colour. Cells for each node in the path are overlaid onto the plot from Fig. 3b, and tissue proportions are shown as a pie chart. Tissue representation decreases with increased tree depth, which indicates functional restriction. Bifurcating sublineages are included for the top and bottom paths. In the top (red) path, this bifurcation occurs within the final branch after primitive blood specification. In the bottom (blue) path, bifurcation happens early within bipotent cells that become either gut or visceral endoderm. c, Violin plots of the pairwise relationship between lineage and expression for single cells. Lineage distance uses a modified Hamming distance normalized to the number of shared cut sites. Pearson correlation decreases with increasing lineage distance, which shows that closely related cells are more likely to share function. Red dot highlights the median, edges show the interquartile range and whiskers show the full range. d, Comparison of shared progenitor scores (log2-transformed) between our two most information-dense embryos (embryo 2, n = 1,400 alleles; embryo 6, n = 2,461 alleles). Cells from closely related transcriptional clusters (for example, between the early and late states of either the primitive blood or the visceral endoderm) derive from common progenitors and score as highly related in both embryos. We also observe a close link between mesoderm and ectoderm that may reflect shared heritage between neuromesodermal progenitors and more-posterior neural ectodermal tissues, such as the future spinal cord43.

Стратегии для упорядочивания клеток, базирующиеся на scRNA-seq, такие как trajectory inference, обычно исходят из функционального сходства, отражающего близость клонов18. Чтобы исследовать этот вопрос непосредственно, мы использовали модифицированные Hamming дистанции до измеряемых в парах клональные расстояния и сравнивали их с RNA-seq корреляциями. В целом, клетки, которые разделены самыми маленькими клональными расстояниями имеют профили транскрипции, которые более сходны др. с др., хотя подобное взаимоотношения ясны для некоторых эмбрионов, чем для др. (Fig. 4c, Extended Data Fig. 9). Этот результат согласуется с мнением постоянного ограничения потенции по мере дифференцировки клеток в прогрессивно всё более специализированные типы.
Мы также разработали коллективные метки предшественников, которые подсчитывают степень общего происхождения между разными тканями путем оценки количества и специфичности общих узлов в этом древе (Supplementary Methods). Несмотря на стохостичность времени формирования inde, этот подход может воспроизводимо восстанавливать внезапно всплывающие тканевые взаимоотношения, такие как возможное общее происхождение между передними сомитами и paraxial мезодермой или между нейро-мезодермальными предшественниками и будущим спинным мозгом (Fig. 4d). Полная карта общих меток предшественников может быть собрана в кластеры, чтобы создать всеобъемлющую картину взаимоотношений тканей во время развития (Extended Data Fig. 8d).

State and lineage do not always conform


Хот наши реконструированные взаимоотношения тканей в целом воспроизводят канонические знания, внеэмбиональная энтодерма и эмбриональная энтодерма обнаруживают существенное и неожиданно близкое сходства, несмотря на их независимое происхождение из гипобласта и ограниченного эмбрионом эпибласта, соотв. (Fig. 5a, Extended Data Fig. 9). Ручная проверка древа выявила субпопуляцию клеток, которые выглядят транскрипционно как эмбриональная энтодерма, но которые клональный анализ помещает внутри внеэмбриональных веточек (показано голубым на Fig. 4b). В соответствии с этой находкой предыдущие целенаправленные исследования с использованием отслеживания маркерами меченных клонов идентифицировали латентный внеэмбриональный вклад в развитие задней кишки во время гаструляции28.

Fig. 5: Disparities between transcriptional identity and lineage history within the endoderm.

a, Shared progenitor-score heat map for embryo 2 reconstructs expected relationships. The number of nodes that include cells from different lineages is highlighted (heterogeneous nodes). See Extended Data Fig. 9 for additional embryos. n, number of cells assigned to each tissue. b, For cells from embryo 2, the relative distance from the mean expression profile of either the endoderm or the extra-embryonic endoderm cluster according to origin (endo or EEndo). c, Endoderm-cell lineage tree from embryo 2 with expression heat map for two extra-embryonic marker genes. Middle bar indicates lineage: dark blue, extra-embryonic; light blue, embryonic; grey, ambiguous. d, Expression box plots for Trap1a and Rhox5 confirms consistent differential expression across lineage-traced embryos according to their embryonic or extra-embryonic ancestry. Red line highlights median, edges show the interquartile range, whiskers show the Tukey fence, and crosses denote outliers. n values give the number of recovered endoderm cells of either embryonic (E) or extra-embryonic (X) origin per embryo. Numbers above plots indicate the embryo replicate number.

В этом исследовании профили scRNA-seq, которые мы получили в тандеме с регистрацией клонов позволили нам оценить степень конвергенции в отношении сигнатуры функциональной энтодермы и идентифицировать отличающие гены. Клетки, классифицируемые как энтодерма, происходящие из внеэмбрионального источника были наиболее схожи с энтодермальными типами клеток, но также обладали слегка более высоким сходством с желточным мешком, который не видим внутри t-distributed stochastic neighbour embedding (t-SNE) проекций всего эмбриона (Fig. 5b, Extended Data Fig. 10). Принимая во внимание независимое происхождение внеэмбриональной и эмбриональной энтодермы, мы можем ожидать тонкие, но персистирующие транскрипционные сигнатуры, отражающие их самостоятельную онтогенетическую историю. Если мы разделим энтодермальные клетки в соответствии с их клонами, то мы идентифицируем два сцепленных с Х хромосомой гена - Trap1a и Rhox5, которые являются общими маркерами для внеэмбриональной ткани29,30 - которые постоянно активны у эмбрионов в энтодерме внеэмбрионального происхождения (Kolmogorov-Smirnov test, Bonferroni-corrected P < 0.05, Fig. 5c, d). В др. исследованиях RNA-seq эти взаимоотношения не были выявлены путем кластрирования всего эмбриона и были обнаружены только с помощью специфического исследования задней кишки9,31 (Extended Data Fig. 10). Эти наблюдения подтвердили, что наш трассер клонов успешно засек случай конвергентной регуляции транскрипции.

Towards a quantitative fate map


Одновременное отслеживание клонов одиночных клеток с транскрипционным фенотипом предоставляет возможность сделать вывод о клеточной потенции и спецификации, исходя из пристрастий родоначальных клеток, как это демонстрируют наши карты судеб32,33. Каждый узел внутри древа представляет собой уникальную клональную характеристику, которая происходит из одиночной реконструированной клетки предшественника, это позволяет нам подсчитать нижние границы размера области предшественников (Supplementary Methods). Мы исследовали количество основателей из предшественников во время самых ранних переходов в потенциале клетки. Мы определили тотипотентность, как узел, которые дает как эмбриональные, так и плацентарные типы клеток, а затем распределить плюрипотентность на 'раннюю' и 'позднюю' в соответствии с присутствием внеклеточной энтодермы34 (Fig. 6a). Вклады этих двух основателей в существующие клоны асимметричны, это указывает на то, что предшественники могут быть склонены к направлении специфических судеб, но сохзраняют способность генерировать др. типы клеток. Оценка по минимуму, исходя из наших данных подтверждает диапазон из 1-6 тотипотентных клеток, 10-20 ранних плюрипотентных предшественников и 18-51 поздних плюрипотентных предшественников (Fig. 6b). Варьирующие количества мультипотентных клеток на этих стадиях могут отражать закодированную устойчивость (robustness) которая гарантирует успешную сборку функционального организма - особенно принимая во внимание, что одиночная плюрипотентная клетка может генерировать все соматические клоны эмбриона35. Будущие исследования с использованием большего числа реплик, генерируемых разведением, может сделать возможными статистические подходы для оценки этих на организменной шкале онтогенетических рассуждений.

Fig. 6: Lineage bias and estimated size of progenitor fields.

a, Relative tissue distribution of cells descended from reconstructed or 'profiled' pluripotent progenitor cells for embryo 2. 'Profiled' is a unique lineage identity comprised of multiple cells that are directly observed in the data. Pluripotent cells form all germ layers but show asymmetric propensities towards different cell fates; this possibly reflects positional biases. Nodes highlighted in grey (with asterisk above the bar) give rise to primordial germ cells (lineages 1, 4 and 5 include 9, 1 and 1 PGCs each, respectively). Colour assignments as in Fig. 3. n, number of cells. b, Estimated progenitor field sizes for three types of early developmental potency for the six embryos analysed in this study. Totipotent cells give rise to all cells of the developing embryo, including trophectodermal (TE) lineages. Pluripotent progenitors are partitioned into early and late by the generation of extra-embryonic endoderm in addition to epiblast (epi). Dots represent single embryos; solid grey line connects estimates from the same embryo.



Discussion


В данном исследовании мы представили карты клеточных судеб, которые лежат в основе гаструляции млекопитающих, используя технологию высоко-информативной и непрерывной регистрации. Возникло несколько идей, включая трансформативную природу CRISPR-Cas9-управляемых мутаций, комбинируемых со считыванием scRNA-seq15-17, как информация об истории клеток, записанная с помощью этой технологии может дополнить профили RNA-seq, чтобы охарактеризовать типы клеток и ранние основы для количественного понимания стохастических переходов во время развития млекопитающих.
Блочность нашего регистратора (recorder) делает возможными замены, которые будут увеличивать широту охвата приложений. Здесь мы использовали три постоянно экспрессирующиеся guide РНК, чтобы записывать постоянно во времени, но будущие модификации смогут использовать промоторы, чувствительные к окружению, воспринимающие стрессы, потенциалы действия нейронов или межклеточные контакты36, или эти подходы будут скомбинированы для мультифакториальной регистрации. Сходным образом, Cas9-происходящие редакторы оснований37 - включая те, которые создают разные мутации38 - сделают возможной запись содержимого клеток, которые особенно чувствительны к nuclease - управляя разрывами двойной нити ДНК24,25.
Наша карта клеточных clet, идентифицирует фенотипическую конвергенцию независимых клонов клеток, которые демонстрируют силу беспристратсного отслеживания клонов в организме, которые разделяют популяцию, которая выглядит сходной при только scRNA-seq. Специально мы подтвердили внеэмбриональное происхождение субнабора клеток, которые напоминают эмбрионалную энтодерму. Хотя инициальная спецификация этих клонов, как известно, базируется на избыточности регуляторных программ, эти клоны разделены по времени в несколько дней, возникают из транскрипционно и эпигенетически разных предшественников и формируют окончательные типы клеток с очень отличающимися функциями. Идентификация высоко предказуемых маркеров, которые не обнаруживаются в разных источниках, таких как Trap1a, предоставляет четкий контур будущих исследований пространственной транскриптомики39-41. Наш подход может быть использован для изучения и др. конвергентных процессов или различать гетерогенные клеточные состояния, которые имеют устойчивые сигнатуры независимых путей развития, которые могут оказаться критическими для сборки всестороннего клеточного атласа 42. Метки транс-дифференцировки в онтогенезе млекопитающих остаются в основном неиспользуемыми, но могут использоваться практически в нашей системе.
Наша технология разработана, чтобы количественно исследовать ранее затемненные вопросы онтогенеза. Высокого порядка вопросы организменной регуляции - такие как расположение, время и точность онтогенетических узких мест, а также соотв. вероятности переходов состояний к разным клеточным фенотипам - могут быть смоделированы из ансамбля исторических взаимоотношений. Our hope is that characterization of these attributes will lead to insights that connect large-scale developmental phenomena to the molecular regulation of cell-fate decision-making.