Поразительно, формирование из одной клетки, зиготы, целого организма, происходит в результате сложных серий событий делений и дифференцировки, напоминающих древо с зиготой в основании и ответвлений в виде клональных линий, заканчивающихся окончательными типами клеток на верхушке. Характеризация этого онтогенетического древа уже давно привлекает интерес, а комбинация современного геномного инженеринга и технологий секвенирования обещает стать мощной стратегией: штрих-кодированием in vivo. Для штрих-кодирования in vivo индуцируются наследственные случайные мутации, которые накапливаются во время развития и секвенируются после этого, чтобы реконструировать клональное древо. Демонстрации этого в основном сконцентрированы на низших позвоночных и были использованы элементы штрих-кода с ограниченным промежутком активности для клонального отслеживания индивидуальных клеток или типов клеток.
Чтобы подобраться к сложному развитию млекопитающих, мы предложили использовать множественные независимые элементы штрих-кодирования
in vivo, которые могли бы развертываться параллельно с экспоненциальным расширением их силы регистрации (recording power). Независимость требует как отсутствия общения между элементами, так и отсутствия взаимного влияния между их мутационными эффектами (outcomes). Системой с потенциалом обеспечения этих потребностей является homing CRISPR, модифицированная версия канонической CRISPR, при этом направляющая на собственную ДНК homing guide RNA (hgRNA) комбинируется с CRISPR-Cas9 нуклеазой для повторного целенаправленного воздействия на свой собственный локус, приводя к разнообразным мутационным изменениям (outcomes). Поэтому в мышиных эмбриональных стволовых клетках мы рассеивали множественные hgRNA локусы с разными спейсерами (spacers) в геноме, которые служили элементами штрих-кода. При таком распределении каждая hgRNA действовала независимо в результате своей уникальной спейсерной последовательности, а нежелательные события делеции для множественных соседний сайтов разрезов оказывались маловероятными. Используя такие клетки мы сгенерировали химерных мышей с 60 hgRNAs в качестве основателей MARC1 (Mouse for Actively Recording Cells 1) линии, это позволило штрих-кодировать и регистрировать клеточные клоны.
RESULTS
В отсутствие Cas9, hgRNAs являются стабильными и дремлющими; чтобы инициировать штрих-кодирование мы скрещивали MARC1 мышей с Cas9 knock-in мышами. в возникающем потомстве hgRNAs активировались, создавая разные мутации, которые создавали 1023 разных комбинаций штрих-кода, которые могли быть сгенерированы только 10 hgRNAs. Более того, hgRNAs обнаруживали профили ранговой активности, при этом некоторые мутации возникали вскоре после оплодотворения, тогда как др. обнаруживали низкую активность в течение большей части периода беременности. Эти ранги давали устойчивое штрих-кодирование в ходе беременности и характеризовали онтогенетические клоны: Каждая клетка наследовала набор уникальных мутаций, которые передавались их дочерним клеткам, при этом могли добавляться уникальные мутации. Соотв., на каждой стадии у таких онтогенетически штрих-кодированных мышей близко родственные клетки имели сходные профили мутаций, или штрих-код, по сравнению с более удаленными др. от др. Эти коды оставались внедренными в геномы клеток и могли быть определены с помощью секвенирования.
Мы использовали эти регистрации (recordings) для создания от основания до верхушки клонального древа мыши, начиная с первых ответвлений, которые возникают после зиготы и наблюдали устойчивую реконструкцию точного древа. Мы также исследовали ось развития в головном мозге путем секвенирования штрих-кодов на левой и правой половинах регионов переднего, среднего и заднего мозга. Мы установили, что штрих-коды левой и правой половин одного и того же региона схожи сильнее, чем у разных регионов головного мозга; это подтверждает. что в предшественниках головного мозга детерминация передне-задней оси устанавливается раньше, чем детерминация латеральных осей.
Итак, эта система предоставляет надежную и многостороннюю основу для штрих-кодирования
in vivo и отслеживания клонов в модельных системах млекопитающих. С её помощью можно создавать онтогенетически штрих-кодированных мышей, у которых клональная информация предварительно записана в геномах клеток. Комбинируя множественные независимо действующие молекулярные записывающие устройства можно усилить их способность и это позволит получить реальную информацию и реконструировать мельчайшие веточки древа.
Developmental barcoding and lineage reconstruction in mice.
Crossing the MARC1 mouse line, which carries multiple hgRNAs, with a CRISPR-Cas9 mouse line results in developmentally barcoded offspring that record lineages in their cells. These recordings were extracted and used to reconstruct lineage trees. A combination of the trees extracted from different developmentally barcoded mice is shown. ICM, inner cell mass; E0, embryonic day 0.
Штрих-кодирование может быть естественным (Е) в ходе развития и искусственным (экспериментальным)(Э) для определенных целей
Штрих-кодирование геномов индивидуальных клеток (Э)
Подходы по отслеживанию клонов, включают штриховое кодирование (barcoding) и использование естественным образом возникших мутаций ДНК. Напр., искусственный локус рекомбинации ДНК (наз. Polylox) был недавно использован для штрихового кодирования, базируясь на Cre-loxP рекомбинации22. Polylox рекомбинация in situ генерирует несколько сотен тысяч штрих-кодов, позволяющих метить одиночные клетки мышей. Эти штрих-коды затем были использованы для картирования судеб гематопэтических стволовых клеток, которые продемонстрировали, что компартмент гематопоэтических стволовых клеток взрослых представляет собой мозаику клонов, которые присутстсвуют у эмбрионов и что большинство клонов у взрослых обладает потенциалом мультиклональной дифференцировки. Вновь разработанная CRISPR-Cas-based система может быть использована для генерации крупно-масштабных карт клеточных клонов в мультиклеточных системах для анализа нормального развития и болезней23.
Pei, W. et al. Polylox barcoding reveals haematopoietic stem cell fates realized in vivo. Nature 548, 456–460 (2017).
Mechanisms of signalling and biased agonism in G protein-coupled receptors Denise Wootten, Arthur Christopoulos, Maria Marti-Solano, M. Madan Babu & Patrick M. Sexton Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 19, pages638–653 (2018)
"Накапливаются доказательства, что индивидуальные лиганды могут индуцировать специфические паттерны фосфорилирования рецепторов (обозначаются как штрих-коды фосфорилирования
47), сцепленных со специфическими поставками GRK
13,48 которые контролируют как силу взаимодействия аррестина с GPCR, так и последующее рекрутирование нижестоящих эффекторов
13,46-52." (Е)
Inf Недавнее исследование также установило структурное объяснение, почему определенные рецепторы обладают способностью соединяться с одними и теми же самыми типами G белков, но не с др. Детализация последовательностей и структурный анализ человеческих GPCRs и G белков выявил существование паттернов аминокислот, наз. G белковыми избирательными штрих-кодами, на каждом из 16 человеческих Gα белков, которые могут быть распознаны за счет определенных регионов среди приблизительно 800 человеческих рецепторов. Важно, что некоторые позиции в штрих-коде сильно законсервиованы, тогда как др. являются уникальными для индивидуальных G белков. В то время как сильно законсервированные позиции в избирательности штрих-кода позволяют рецепторам соединяться с и активировать G белки сходным способом, уникальные позиции распознаются с помощью специфических рецепторов благодаря определенным остаткам и только некоторые штрих-коды могут быть распознаны любым данным рецептором. Эту ситуацию можно сравнить со сценарием, имеющим множественные ключи (рецепторы), открывающими один и тот же замок (G белок), используя не-идентичные паттерны. Более того, было показано, что изучение эволюционной истории GPCRs позволяет идентифицировать эти избирательно детерминирующие остатки на рецепторе20.
