Посещений:
ДЕТЕРМИНАЦИЯ ПОЛА ГОНАД



Механизмы предопределения пола

Genetic Control of Gonadal Sex Determination and Development
IsabelleStevant, SergeNef
Volume 35, Issue 5, May 2019, Pages 346-358 } https://doi.org/10.1016/j.tig.2019.02.004

Новые технологии предоставили возможность получения новой информации о механизмах, управляющих судьбами клеток предшественников и транскрипционной эпигенетической динамики, лежащих в основе предопределения пола.
Единственна популяция мультипотентных клеток предшественников подвергается ограничению выбора судеб и дифференцировки в или поддерживающие клетки или интерстициальные и стромальные предшественники гонад. Поддерживающие клетки дифференцируются из этих ранних предшественников в два последовательных шага, при этом первый это детерминация в направлении поддерживающего клеточного клона, следующего пол-специфической дифференцировке в направлении pregranulosa и клеток Сертоли.
Накапливаются доказательства, подтверждающие, что эпигенетические механизмы вносят вклад в становление судьбы самцов. Экспрессия гена, детерминирующего мужской пол, Sry регулируется модификацией гистона и метилированием ДНК.
Детерминация пола является процессом, в ходе которого бипотентные гонады развиваются или в семенники или яичники. При этом два отличающихся потенциальных исхода, зачатки гонад предоставляют уникальную модель для изучения спецификации судеб клеток и того, как различные популяции клеток дивергируют из мультипотентных предшественников.
Фундаментальной целью биологии развития является установление механизмов, лежащих в основе детерминации судеб клеток и дифференцировки клеток предшественников в определенные типы клеток. У млекопитающих семенники и яичники первоначально развиваются из бипотентных зачатков, представленных клетками предшественниками, которые дифференцируются в клетки семенников или яичников. Этот процесс наз. детерминацией пола гонад (see Glossary).
Решение выбора судьбы семенников или яичников базируется на мощных генетических сетях, а также на деликатном балансе уровней экспрессии факторов для зачатков семенников и зачатков яичников. В частности инициация мужского пути в XY гонады управляется активацией пути семенников и одновременно супрессии пути яичников, тогда как детерминация XX гонад в направлении женской судьбы в основном зависит от непрерывной активации генов, способствующих становлению самок [1]. Подтверждается, что эпигенетическая регуляция также вносит вклад в бипотентное состояние развивающихся гонад и является ключевым элементом тонко управляющим уровнями экспрессии пол-детерминирующих генов.

Establishment of the Bipotential Gonad Prior to Sex Determination


У млекопитающих генитальные гребни или бипотентные гонады, представляют собой зачатки, из которых дифференцируются яичники и семенники. У мышей они развиваются примерно на E9.5 день эмбриогенеза в строго определенном регионе на вентральной поверхности первичных почек (mesonephros) (Figure 1A,B) и формируют парные узкие полоски из пролиферирующих клеток по обеим сторонам от дорсальной части брыжейки (Figure 1C). Рост генитального гребня осуществляется за счет пролиферации целомического эпителия (CE) и в последствии за счет фрагментации подлежащей базальной мембраны оказывается возможным отслоение пролиферирующих CE во внутренний мезенхимный регион мезонефросов (Figure 1C) [2]. Пока неясно, является ли фрагментация активным или пассивным механизмом, инициируемым за счет увеличения количества клеток. Утолщение генитального гребня начинается на ст. E10.3, вдоль переднезадней оси (Figure 1B). Одновременно с утолщением генитальные гребни колонизируются мигрирующими в них примордиальными зародышевыми клетками (Figure 1C) 3-7.

Figure 1.

Gonad Formation. (A) Schematic representation of a urogenital ridge showing the pronephros, mesonephros, and metanephros. The gonads (in green) develop from the thickening of the coelomic epithelium (CE) on the ventromedial surface of the mesonephros. Adapted from [78]. (B) Whole Tg(Nr5a1-GFP) mouse embryo at E10.5 (merge of bright field and UV light). GFP fluorescence is localized in the somatic cells of the developing gonads. (C) Schematic representation of a transverse section of the genital ridge during gonadal formation. The growth of the genital ridges occurs by the proliferation of the CE (shown in green) and subsequently by the fragmentation of the underlying basement membrane (pink broken line), allowing the delamination of the proliferating CE into the inner mesenchymal region of the mesonephros. Concurrently with the thickening, the genital ridges are colonized by the migrating primordial germ cells (shown in purple). Adapted from [79].

Точный молекулярный механизм, определяющий расположение гонад на поверхности мезонефросов ещё предстоит установить. Интересной инициативой может служить недавнее исследование эмбрионов кур, в котором было предположено, что передача сигналов Sonic Hedgehog , обеспечиваемая с помощью цитокина bone morphogenetic protein 4 (BMP4), инициирует гонадогенез путем становления формирования дорсо-вентрального паттерна мезодермы и путем индукции вторжения (ingression) целомических клеток [8]. Активация передачи сигналов Hedgehog в клетках предшественниках мезонефрической капсулы (эпителиальных клетках, расположенных на флангах генитальных гребней) индуцирует формирование эктопических гонад. Однако, имеются достоверные отличия между морфогенезом гонад у мышей и кур [9].
Полное развитие гонадных гребней требует правильной ингрессии и пролиферации целомических эпителиальных клеток для становления пула клеток предшественников соматических гонад до предопределения пола гонад. Многие важные факторы, участвующие как в ингрессии, так и в пролиферации клеток, были идентифицированы при изучении мутантных мышей (Table 1). Согласно нашим знаниям, GATA4 является самым ранним транскрипционным фактором, экспрессирующимся специфически в генитальных гребнях. GATA4 присутствует в CE клетках ростральной части генитальных гребней уже на ст. E10.0 и его экспрессия распространяется вдоль рострокаудальной оси до ст. E10.4 [2]. Он участвует в инициации формирования генитальных гребней путем контроля фрагментации базальной мембраны и пролиферации CE клеток. Он также контролирует экспрессию Nr5a1 (известен также как Sf1) и Lhx9. Действует ли он при этом прямо или косвенно остается неясным. Эти два критических гена экспрессируются также специфически у клетках предшественниках гонад10-12 (Table 1), а паттерн их экспрессии соответствует экспрессии Gata4 с незначительной задержкой. Следует отметить, что отсутствие экспрессии этих двух генов обнаруживается при делеции гена Gata4 [2]. Источник и происхождение клона клеток соматических гонад установлены не до конца. Эксперименты по отслеживанию клонов in vitro до детерминации пола гонад показали, что в XX и XY гонадах, ингрессия CE клеток составляет наиболее важный источник соматических клеток гонад у обоих полов и вносит вклад в поддерживающие клетки и стероидогенные клеточные клоны13, 14. Эти результаты подкрепляются транскриптомной реконструкцией траекторий дифференцировки гонадных CE клеток, которая показывает, что как поддерживающие, так и стероидогенные клетки предшественники происходят из общей популяции клеток предшественников15, 16. Это указывает на то, что CE клетки являются мультипотентными и что их судьба контролируется или с помощью асимметричных клеточных делений, управляемых молекулярными детерминантами или с помощью внешних сигналов от др. клеток гонад13, 17-19. Недавно, NUMB - ингибитор передачи сигналов Notch - как было установлено, участвует в становлении полярности CE клеток. NUMB распределяется асимметрично в дочерних клетках во время клеточных делений. Его разрушение в XY бипотентных гонадах приводит к накоплению недифференцированных клеток, а также к редукции клеток Сертоли и Лейдига [20]. Очевидно, что поддерживающие клетки происходят из CE, а клоны стероидогенных клеток возникают из множественных источников. Исследования продемонстрировали, что поскольку огромное большинство предшественников стероидогенных клеток, присутствующих в гонадах, может происходить из CE, a существенная пропорция (~30%) возникает из клеток, мигрирующих из мезонефросов после детерминации пола гонад13-27. Этот феномен наблюдается у обоих полов, указывая тем самым, что они возможно происходят из общих ниш мезонефрических стероидогенных предшественников.

Table 1. Critical Factors Involved in the Genital Ridges and Early Gonadal Development 
Gene        Full name        Phenotype        Refs  
 

Gata4        GATA-binding protein 4        Conditional knockout of Gata4 induced at
 E8.75 impairs epithelial proliferation and basement membrane fragmentation;
  Gata4 controls the expression of Nr5a1 and Lhx9        [2]

Nr5a1 (Ad4BP,Sf1)        Nuclear receptor subfamily 5, group A, member 1
        Constitutive knockout of Nr5a1 causes the degeneration of the gonadal ridge
         by apoptosis and complete absence of both the adrenal glands and the
          gonads        10, 11

Wt1        Wilms' tumor 1        Constitutive induced mutation of Wt1 leads to a
 disruption of urogenital development, in particular to the absence of gonads,
  caused by increased cell death        48, 80

Lhx9        LIM homeobox 9        Constitutive Lhx9 knockout mice show absence of
 gonads due to coelomic epithelial cell proliferation failure at E10.5        [12]

Emx2        Empty spiracles homeobox 2        Constitutive Emx2 knockout mice
 display absence of gonads caused by impaired epithelial cell migration through
  the basement membrane, but adrenal gland development is not affected        [81]

Six1 and Six4        SIX homeobox 1 and 4        Six1/Six4 double knockout results in
 smaller gonads with male-to-female sex reversal due to impaired Sry expression;
  Six1/Six4 regulates Nr5a1 and Zfpm2, a direct regulator of Sry        [82]

Insr and Igf1r        Insulin receptor and IGF receptor 1        Insr and Igf1r double
 knockout affects the expression of Nr5a1 and reduces the proliferation rates of
  the somatic progenitor cells in both XX and XY prior to gonadal sex
   determination; mice exhibit male-to-female sex reversal and complete absence
    of adrenal glands        83, 84

Numb        NUMB endocytic adaptor protein        Conditional knockout of Numb
 and Numbl at E8.25 using tamoxifen-inducible ROSA-CreER leads to disrupted cell
  polarity in the CE, reduce numbers of supporting and steroidogenic cells, and
   accumulation of undifferentiated cells in the developing gonad        [20]

Nrg1        Neuregulin 1        Conditional Nrg1 knockout using WT1-CreTg/+ results
 in a decrease of coelomic epithelial cells and a reduced number and delayed
  differentiation of Sertoli cells        [85]

Sry        Sex-determining region of the Y chromosome        Sry initiates a dramatic
 increase in somatic cell proliferation at the CE of XY gonads starting at E11.25 in
  two distinct stages; proliferation was observed initially largely in NR5A1-positive
   cells and contributed to the Sertoli cell population, and later in NR5A1-negative
    cells below the CE that did not give rise to Sertoli cells        13, 14, 86

Rspo1 and Wnt4        R-spondin 1 and Wingless-type MMTV integration site family,
 member 4        Constitutive knockout of Wnt4 and Rspo1 results in impaired
  proliferation of the cells of the CE in XY gonads leading to a reduced number of
   Sertoli cells and the formation of a hypoplastic testis        [87]


Несмотря на значительные успехи, детали формирования генитальных гребней и характеристики соматических клеток, составляющих бипотентные гонады, остаются мало понятными. Это в основном обусловлено отсутствием специфических маркерных генов и репортеров, малыми размерами ткани и трудностями их оценки. Новые технологии, такие как RNA-seq (scRNA-seq) одиночных клеток и флуоресценция циклической одиночной молекулы при гибридизации in situ [28] обладают большим потенциалом для изучения клеток из целого региона мезонефросов во время формирования генитальных гребней, включая мезонефросы, мезонефрический проток и генитальный гребень.

Transcriptional Events Underlying Gonadal Sex Determination and Sex-Specific Cell Differentiation


Поскольку детерминация пола гонад в основном процесс клеточно-автономный, управляемый антогнонистическими генными программами, были предприняты значительные попытки, чтобы установить динамику генной экспрессии во время выбора пола и установить половой диморфизм. Временные ряды транскриптомных исследований XX и XY гонад мыши во время детерминации пола впервые были получены при использовании технологий микромассивов (microarrays) 1, 29-34 и недавно с использованием высоко-производительных технологий, таких как RNA-seq [35] и scRNA-seq15, 16 (Figure 2). Хотя оценка динамики генной экспрессии во время детерминации пола гонад натолкнулась на технические трудности (Box 1 и Figure 3), эти дополнительные исследования внесли большой вклад в наше понимание генетических программ, управляющих детерминацией пола соматических клеток гонад.

Figure 1.

Figure 2. Description of the Existing Large-Scale Transcriptomic Studies of Mouse Gonadal Sex Determination. The blue and pink dots indicate the embryonic time points covered by the studies (in XY and XX gonads, respectively), while the pale-colored rectangles inform about the method employed [microarrays, RNA-seq or single-cell (sc) RNA-seq]. The input cells for each study are indicated on the right of the graph. See also [1,15,16,29-35].

Box 1 Technical Challenges in Gonadal Sex Determination

The developing testis and ovary are complex organs comprising numerous cell lineages that evolve rapidly during the process of gonadal sex determination. The biggest challenges to the study of gonadal sex determination resides in the cell heterogeneity in the developing gonads, as well as in the asynchrony of cell differentiation at any given time point. Performing a classical transcriptomic analysis on the whole gonad can lead to averaging artifacts. Specific reporter genes or markers can be used to purify cell types prior to transcriptomic analysis; however, unknown cell populations are excluded from the analysis, and the specificity of the reporter has to be verified to avoid contamination. Moreover, the transcriptomic information obtained for each cell type still represents a mixture of asynchronous differentiating cells, masking the precise chronology of gene expression. Finally, the exogenous sources of gonadal cells should not be neglected as it has been recently shown that a significant proportion of fetal Leydig cells, peritubular myoid cells, endothelial cells, and pericytes are derived from migrating cells of the adjacent mesonephros [46]. In this particular context, scRNA-seq represents a technology of choice to explore the cellular landscape of the differentiating gonads and precisely reconstruct the transcriptomic events driving sex determination (Figure 3). The big advantage of performing RNA-seq in a tissue with nonsynchronous cells is that it allows the collection of snapshots of cells at different differentiation stages. Because cell differentiation is a continuous process, it is possible to order cells by looking at expression transitions of hundreds of genes from one state to another. Following this concept, time-series scRNA-seq in a nonsynchronous tissue represents in silico cell lineage tracing.




Supporting-Cell Commitment and Differentiation


Т.к. бипотентные гонады формируются на ст. E10.5, то клетки гонад ещё не обладают каким-либо половым диморфизмом на транскриптомном уровне, за исключением немногих генов, расположенных на половых хромосомах30, 35. Происходящие из CE клетки соматических предшественников (экспрессирующие Gata4 и Sf1) экспрессируют гены, связанные с эпителий подобными стволовыми клетками, а также гены, связанные с пролиферацией и пока еще не выявлена какая-либо транскриптомная сигнатура детерминации в направлении судеб поддерживающих или стероидогенных клеток15, 16. Детерминация поддерживающих клеток и пол-специфическая дифференцировка происходят последовательно, при этом первоначальное решение XY и XX мультипотентных предшественников принять судьбу поддерживающих клеток, обладая сходной транскриптомной идентичностью, в соответствии с пол-специфической дифференцировкой, в клетки Сертоли и pregranulosa клетки15, 16. Точнее, примерно на ст. E11.0-E11.5 детерминация клона поддерживающих клеток из мультипотентных клеток соматических предшественников обеспечивается с помощью общей генетической программы, представленной активацией сотен генов ака в XX, так и в XY15, 16. Эта программа обеспечивает экспрессию pro-Sertoli (Fgf9, Dmrt1) и pregranulosa (Wnt4, Runx1 и Dax1) генов в начале детерминации поддерживающих клеток1, 16, 34. Более того, такая активация генов также совпадает с активацией пол-детерминирующего региона Y хромосомы (Sry) гена и с его прямым целенаправленным воздействием на SRY-related high mobility group (HMG) box 9 (Sox9) в XY поддерживающих клетках15, 16. Скорее всего, генетическая программа, заставляющая клетки превращаться в клон поддерживающих клеток, также наделяет (confers) их бипотентными свойствами. Это подтверждается тем фактом, что трансгенная экспрессия Sry в XX поддерживающих клетках в тот же самый временной промежуток, что и в XY поддерживающих клетках достаточна для управления развитием клеток Сертоли36, 37. На ст. E12.5, предшественники поддерживающих клеток приобретают соотв. полу качественные особенности, позволяющие им дифференцироваться в клетки Сертоли у XY и прегранулезные клетки у XX. Дифференцировка поддерживающих клеток в клетки Сертоли или прегранулезные клетки осуществляется разными способами. У XY наблюдается массивная волна активации специфичных для самцов генов, таких как Amh и Dhh между ст. E11.5 и E12.5, вскоре после экспрессии Sry и активации Sox9. Параллельно большая пропорция генов, активирующихся во время детерминации поддерживающих клеток подавляется на этой стадии1, 15, 16, 34, 35. В XX предшественниках поддерживающих клеток, специфичные для самок гены, такие как Foxl2, активируются, начиная со ст. E12.5 и наблюдается репрессия меньшего количества генов по сравнению с XY16, 34, 35. Дальнейший анализ выявил, что XX и XY бипотентные предшественники поддерживающих клеток на ст. E11.5 обнаруживают преимущественную склонность к экспрессии генов самок, подтверждая, что естественным ходом этих предшественников является приобретение качественных особенностей самок, несмотря на активацию SRY, вызывающей репрессию женской программы и способствующей дифференцировке клеток Сертоли [34]. Транскриптомный анализ гранулезных клеток на поздней эмбриональной стадии (E13.5 и E16.5) и первые постнатальные дни (P6) выявил, что дифференцировка гранулезных клеток происходит в течение нескольких дней. Это контрастирует с клетками Сертоли, которые дифференцируются в течение 24-ч. Между E12.5 и E16.5, прегранулезные клетки постепенно активируют специфические для самок гены, а также прогрессивно подавляют определенный набор генов, которые быстро подавляются в предшественниках клеток Сертоли между E11.5 и E12.5 [16]. После рождения гранулезные клетки завершают свою дифференцировку, т.к. начинается процесс фолликулогенеза. Итак, временные различия в экспрессии генов, наблюдаемые между XX и XY предшественниками поддерживающих клеток, скорее всего, обусловлены задержкой дифференцировки в прегранулезных клетках по сравнению с клетками Сертоли.

Interstitial/Stromal Cell Specification as Steroidogenic Progenitors


Параллельно с дифференцировкой поддерживающих клеток, остальные происходящие из CE клеток предшественников также подвергаются транскриптомным изменениям во время развития гонад15, 16, 34. В раннем развитии семенников эти клетки предшественники, ограничены кишечным компартментом, тогда как клетки Сертоли огораживают зародышевые клетки, чтобы сформировать зачатки яичек. В ранних развивающихся яичниках пока отсутствуют особенные структуры и клетки предшественники выглядят как как клетки, смешанные с прегрануолезными клетками и зародышевыми клетками, но позднее обнаруживаются в стромальном компартменте яичников во время фолликулогенеза. Интерстициальный и стромальный компартменты представлены гетерогенными популяциями клеток. Они, как полагают, являются основным источником клеток стероидогенных предшественников, которые дифференцируются в клетки Лейдига у плодов, начиная со ст. E12.5 в семенниках и theca клетки во время первой постнатальной недели в яичниках. Они также являются источником развития сосудистой сети, из мигрирующих мезонефрических эндотелиальных клеток18, 38-40.
Изучение интерстициальных и стромальных клеток затруднено из-за их гетерогенности и отсутствия специфических маркеров (Box 1). Первые транскриптомные исследования пытались выделить такие клетки с помощью Mafb-eGFP трансгена [34]. Они установили, что интерстициальные и стромальные клетки постепенно приобретают половой диморфизм между E11.5 и E13.5, частично обеспечиваемый дифференцировкой плодных клеток Лейдига среди Mafb-eGFP позитивных клеток [34]. Более изысканные исследования использовали scRNA-seq клеток, экспрессирующих Nr5a115, 16 и показали, что происходящие из CE интерстициальные и стромальные клетки предшественники постепенно активируют гены, известные как маркеры стероидногенных клеток предшественников, такие как Pdgfra, Arx и Ptch1 41-44. Прогрессирование XX стромальных клеток осуществляется с незначительной задержкой по сравнению с таковым XY интерстициальных клеток. Постепенное становление транскриптомного полового диморфизма начинается со ст. E12.5, одновременно с дифференцировкой поддерживающих клеток. Однако, обнаруживаемый половой диморфизм управляется за счет различий в уровне экспрессии генов скорее, чем экспрессии специфических генов у одного или др. пола. К сожалению, небольшие количества плодных клеток Лейдига вместе с отсутствием клеток theca препятствует изучению программ дифференцировки стероидогенных клеток. Остается неясным, действительно ли клетки стероидогенных предшественников, мигрирующие из мезонефросов, обладают сходной прогрессией транскриптома.

Alternative Splicing (AS) and Sex Determination


AS является повсеместным регуляторным механизмом, участвующим в выборе специфических экзонов и интронов при продукции разных транскриптов с одного гена, расширяя тем самым сложность протеома45, 46. Поскольку хорошо известно, что AS играет главную роль в развитии различных органов и вносит вклад в клеточную дифференцировку и детерминацию клонов [47], то степень AS, имеющая место во время процесса детерминации пола гонад и его функциональное значения остаются неясными. Недавно исследование RNA-seq, осуществленное на гонадах плодов мышей во время процесса половой детерминации, выявило широко распространенные стадио- и пол-специфическую регуляцию изоформ транскриптов, используемую во время развития гонад [35]. Хотя остается трудным предсказать точные молекулярные последствия этих событий дифференциального сплайсинга, AS, как было установлено, на известных генах выполняет важные функции в развитии гонад. Сюда относится Wilms' tumor супрессорный ген Wt1 [48] и FGF9 рецептор fibroblast growth factor receptor 2 (Fgfr2) [49], также как и Lef1, ключевой медиатор пути канонической передачи сигналов WNT50-55. В целом эти находки подтвердили важность регуляторной роли AS в предопределении пола и раннем развитии гонад.
Оценка динамики экспрессии генов во время детерминации пола гонад позволила нам лучше понять, как устанавливаются половые диморфизмы вплоть до морфологических изменений гонад и выявить сложность транскриптомных программ, действующих во время развития семенников и яичников. Однако, всё ещё необходимы усилия для выяснения сетей генов, ответственных за выбор половой судьбы и в частности понять механизмы активации и экспрессии генов.

Mechanisms of Gene Expression Regulation during Gonadal Development


Транскриптом является непосредственным местом считывания генетических программ, ответственных за выбор клетками судеб и дифференцировку, но они так являются результатом множества вышестоящих событий, возникающих на уровне ДНК, чтобы поспособствовать или предупредить транскрипцию. Транскрипционные факторы выполняют ключевые роли по контролю экспрессии генов путем связывания энхансерных и промоторных регионов. Доступность энхансерных регионов является важным механизмом регуляции экспрессии генов. Это обеспечивает 3D конформации ДНК, модификации хроматина и деметилирование ДНК. Растут доказательства роли эпигенетических и ДНК регуляторных элементов в детерминации пола гонад, начиная с активации самого семенники-детерминирующего фактора Sry [56].

Regulation of Sry Expression


Механизмы, контролирующие точную пространственно-временную экспрессию Sry, пока не установлены полностью [57]. Bisulfite секвенирование подчеркивает два вышестоящих над Sry локуса, которые обнаруживают динамический статус метилирования в период времени, который совпадает с экспрессией Sry58-60 (Figure 4A). Первый регион перекрывается с местом старта транскрипции (TSS) не транслируемой циркулярной Sry РНК (region I), тогда как второй перекрывается с TSS транслируемого Sry транскрипта, который экспрессируется во время детерминации пола гонад (region II). Эти два региона обладают CpG гиперметилирования динуклеотида на ст. E8.5, когда Sry ещё не экспрессируется. Около ст. E11.5, оба региона оказываются гипометилированными в гонадах, тогда как статус гиперметилирования сохраняется в др. тканях. На ст. E15.5, region I остается гипометилированным, тогда как регион II оказывается снова гиперметилированным58, 60. Эти результаты подтверждают, что метилирование ДНК может быть ответственным за тканевую специфичность и временную регуляцию Sry путем защиты цис-регуляторных регионов.

Figure 3.

Comparison of the Information Obtained from Transcriptomic Studies Using a Bulk of Whole Gonadal Cells (Left), a Bulk of Sorted Cell Populations (Center), or Isolated Single Cells (Right).

Figure 1.

Epigenetic Regulation of Sex Determination. (A) Dynamic of the accessibility of the cis-regulatory regions controlling Sry expression. Prior to sex determination (E8.5), the cis-regulatory regions upstream to the Sry gene exhibit high DNA CpG methylation and dimethylated state of lysine residue 9 on histone H3, a histone modification associated with transcriptional repression. These marks prevent access to the region by transcription factors and thus inhibit Sry expression. Around E11.5, the same regulatory regions appear demethylated and histone H3 is demethylated by the action of JMJD1A. Thereby, transcription factors have access to the cis-regulatory regions and trigger the expression of Sry [61]. (B) Overexpression of Sox9 in XY is controlled by the TESCO enhancer regions but also by the recently identified Enh13 region, which is preferentially bound by SRY. Deletion of Enh13 is sufficient to cause male-to-female sex reversal in XY mice [65]. (C) In XY mice, CBX2 prevents the activation of the Lef1 gene via the Wnt pathway by acting as a protector of DNA compaction. This allows stabilization of the male pathway and assures normal testicular development. In XX and in XY mice lacking Cbx2, Wnt signalling activates Lef1 gene expression, causing upregulation of the female pathway and the development of ovaries [74].

Помимо деметилирования ДНК, экспрессия Sry нуждается в деметилировании dimethylated Lys9 гистона 3 (H3K9me2), гистоновой метки, ассоциированной с транскрипционной репрессией, с помощью histone demethylase JMJD1A (Figure 4A). Разрушение Jmjd1a приводит к частому обращению пола из-за накопления H3K9me2 вокруг промотора Sry, приводя к низкой экспрессии [61]. Вместе с деметилированием H3K9 промотор Sry содержит многочисленные пермиссивные гистоновые метки, включая H3 Lys4 trimethylation (H3K4me3) и H3 acetylation (H3ac) [60].
Одновременные ДНК метилирования и гистоновые модификации активно участвуют в пространственно-временной экспрессии Sry, делая энхансеры и промоторы доступными для соединения со многими транскрипционными факторами (reviewed in [62]).

Sox9 Cis-Regulatory Regions


Во время детерминации пола гонад самцов SRY активирует Sox9 путем целенаправленного воздействия на экспрессию testis-specific enhancer of Sox9 (TES), который имеет стержневой элемент TESCO [63]. Делеция TES и TESCO у XY мышей снижает экспрессию Sox9 примерно на 50% , не вызывая обращения пола [64]. Эти результаты подтверждают важную роль TES/TESCO в контроле уровней экспрессии Sox9 в семенниках и подтверждают присутствие дополнительных энхансеров, которые ещё предстоит идентифицировать. Недавно применен комбинированный метод для хроматина, доступного для transposase с использованием секвенирования (ATAC-seq), на XY и XX гонадах на ст. E10.5 и E13.5 с ChIP-seq для H3K27ac, чтобы искать новые предполагаемые энхансеры Sox9. 16 кандидатов на роль энхансерных регионов были скринированы с использованием трансгенных мышей, несущих энхансерные регионы выше LacZ репортера. Два из 16 кандидатов обнаруживали тестис-специфическую активность (Enh13 и Enh14). Делеция Enh14 не приводила к альтерациям экспрессии Sox9. Однако, гомозиготная делеция Enh13, 557-bp элемента, расположенного 565 kb выше Sox9 TSS, приводит к полному обращению пола XY самцов в женский пол (Figure 4B). Это исследование также продемонстрировало, что SRY преимущественно соединяется с Enh13 скорее, чем с TESCO, демонстрируя, что Enh13 является критическим для активации Sox9, тогда как TESCO ответственен за стабилизацию активного состояния Sox9 [65].

Stabilization of Male and Female Fate


Клетки Сертоли и гранулезные клетки происходят из общей популяции клеток предшественников и сохраняют способность к трансдифференцировке в их противоположный пол даже после рождения66-70. Хотя многие транскрипционные факторы контролируют дифференцировку клеток Сертоли, но как они контролируют выбор клетками судьбы остается малопонятным.
Эпигенетический регулятор chromobox protein homolog 2 (CBX2) является частью polycomb repressive complex 1 (PRC1), который соединяется с триметилированным Lys27 гистона 3 (H3K27me3) , чтобы поддерживать компакцию хроматина и репрессировать экспрессию генов [71]. Разрушение Cbx2 у XY эмбрионов мыши приводит к развитию яичников72, 73. Первоначально было предположено, что Cbx2 действует как активатор выбора мужской судьбы за счет косвенной позитивной регуляции Sry56, 73. Однако, недавние находки показали, что вместо этого Cbx2 необходим для стабилизации мужской судьбы путем блокирования активации бивалентных женский пол детерминирующих генов [74]. За счет непосредственного соединения с Lef1, нижестоящей Wnt мишенью в XY гонадах, CBX2 подавляет передачу сигналов Wnt и способствует стабилизации мужской судьбы и дифференцировке клеток Сертоли. В XX E13.5 гонадах или в XY гонадах, которые лишены Cbx2, Lef1 способствует активации женского пути развития, что противодействует приобретению мужской судьбы, делая возможной дифференцировку прегранулезных клеток (Figure 4C).
Два комплементарных исследования недавно отслеживали регионы открытого хроматина (используя DNAseI-seq и ATAC-seq) и гистоновые модификации, указывающие на активные энхансеры и промоторы (ChIP-seq для H3K27ac) в очищенных поддерживающих клетках XX и XY гонад до (E10.5) и после (E13.5 and E15.5) детерминации пола гонад у мышей75, 76. На ст. E10.5, XX и XY клетки предшественники имеют одинаковые ландшафты доступности хроматина, что согласуется с их состоянием транскрипции1, 30. Дифференцировка поддерживающего клона в клетки Сертоли или гранулезные клетки сопровождается увеличением активности в открытых регионах хроматина, которые соседствуют с генами, способствующими возникновению клеток Сертоли и гранулезных клеток, соотв. Эти регионы открытого хроматина обогащены транскрипционным фактором, связывающим мотивы, которые, как известно способствуют развитию поддерживающих клеток. Интересно, что в клетках Сертоли granulosa-способствующие гены обладают доступными, но неактивными регуляторными регионами (т.e., истощены по H3K27ac гистоновой модификации), которые обогащены по связывающим мотивам для DMRT1 и SOX9. Это указывает на то, что прегранулезные гены оказываются репрессированными с помощью транскрипционных факторов клеток Сертоли непосредственно после детерминации пола гонад, чтобы ограничивать клеточные судьбы клетками Сертоли. Эти находки согласуются с данными по экспрессии, показывающими, что детерминация мужской судьбы нуждается как в активации генов, способствующих Сертоли, так и в одновременной репрессии генов, способствующих гранулезным клеткам [1].
Вплоть до недавнего времени большая часть наших знаний об антагонистических генетических программах, лежащих в основе детерминации пола гонад, базировались на наблюдениях перемены пола, вызываемого с помощью целенаправленного нокаута генов. Интеграция геномного скрининга состояний хроматина и транскрипционных факторов, связывающих места стартов, чтобы открыть регуляторные сети, контролирующие тонко контролируемую во времени экспрессию генов, наблюдаемую во время детерминации пола гонад.

Concluding Remarks


Although we have limited the scope of this review to embryonic sex determination, it is now evident that the initial decision for gonads to differentiate into either testes or ovaries is not permanent and has to be actively maintained throughout life 68, 70. Disruption of the delicate balance of the genetic programs required to maintain cell identity in adult gonads results in a change of fate of somatic gonadal cell types, with Sertoli cells transdifferentiating into granulosa cells and vice versa. Unfortunately, there is only scarce information about the epigenetic and transcriptional changes driving adult transdifferentiation and how similar/divergent they are compared with the process of embryonic sex determination. With the emergence of scRNA-seq as well as other genome-wide techniques describing the chromatin landscape at single-cell resolution (e.g., single-cell ATAC-seq), it is now possible to reconstruct the transcriptomic programs and the dynamics of chromatin regulatory landscapes driving transdifferentiation of adult testis and ovarian cells.
It is likely that future progress in our understanding of the transcriptomic and epigenetic mechanisms regulating embryonic sex determination and adult testis and ovarian cell transdifferentiation will improve our capacity to identify causative variants in patients with disorders of sex development (DSDs). Currently, the majority of DSD cases related to defects in gonadal development and differentiation do not receive a genetic diagnosis [77]. It is hypothesized that a significant proportion of pathogenic variants or in/dels may be localized in critical regulatory intergenic regions that are not covered by classical exome sequencing. We expect that a better understanding of the regulatory regions controlling the fine balance of expression of key sex-determining genes, in the mouse as well as in humans, will improve the success rate for the identification of causal variants in patients with DSDs.