В попытке скорректировать родительские патогенные мутации, используя технологию CRISPR-Cas9 у эмбрионов человека, Ma et al.¹ установили, что материнский аллель является эффективной матрицей для репарации при коррекции гена, включая и использование Cas9 у ооцитов в метафазе II (MII). Поскольку материнский и отцовский геномы подвергаются действию разных онтогенетических программ и находятся в разных ядрах до первого митотического деления, которое, по-видимому, предваряет взаимодействия между гомологами, мы предположили, что это является критическим для осуществления сложного анализа молекулярных исходов репарации разрывов двойных нитей (DSB) у эмбрионов человека. В отсутствие прямых молекулярных доказательств для предполагаемых событий, рассуждения об использовании таких методов коррекции зародышевой линии человека д. осуществляться с крайней осторожностью. Имеется ответ на это в комментариях Ma, H. et al. Nature 560, https://doi.org/10.1038/s41586-018-0381-y (2018).

Ma et al.1 использовали два подхода, чтобы попытаться скорректировать ген у эмбрионов человека. В одном подходе, который считался наиболее многообещающим, поскольку он повсюду давал не мозаичных эмбрионов, в ооциты MII инъецировали донорский спермий от носителя гетерозиготной мутации вместе с Cas9 комплексом, чтобы управлять делениями дробления мутантного отцовского аллеля. Около 72% эмбрионов, возникающих инъекции Cas9, оказывались дикого типа по сравнению с 50% контрольных эмбрионов. Авт. полагают, что этот избыток кажущихся дикого типа эмбрионов (22%) возникает в результате коррекции отцовского аллеля, использующей материнский аллель в качестве матрицы для репарации, процесс, назван inter-homologue homologous recombination (abbreviated here as IH-HR).

В др. подходе Ma et al.¹ снова использовали спермии от носителя мутации, чтобы оплодотворить дикого типа ооцит; когда зиготы на стадии пронуклеуса завершали S фазу, то в них инъецировали Cas9 комплексы, снова, чтобы управлять мутантным отцовским аллелем. В противоположность предыдущему подходу, эмбрионы, возникающие в результате оплодотворения мутантным спермием с уверенностью были идентифицированы как мозаичные эмбрионы. Некоторые клетки таких мозаичных эмбрионов содержали мутантный отцовский аллель или не модифицированный или с небольшими indels, вместе с дикого типа материнским аллелем. Др. клетки у этих мозаичных эмбрионов содержали только обнаруживаемый аллель дикого типа. Авт. полагают, что эти клетки возникают в результате IH-HR мутантного отцовского аллеля, использующего дикого типа материнский аллель в качестве матрицы, что и приводило к коррекции гена.

Рассматривая данные, предоставленные Ma et al.¹, возможно альтернативное объяснение для IH-HR. Генотипирование с привлечением амплификации фрагмента приблизительно в 534 пар оснований (bp), в котором мутация MYBPC3^ΔGAGT находится приблизительно в 200 bp одного из праймер-связывающего сайта. Делеции крупнее 200 bp д. быть достаточны для удаления этого праймер-связывающего сайта и для амплификации только материнского аллеля (Fig. 1a, b), давая неправильное представление о коррекции гена отцовского аллеля. Обычно не столь распространены малые indels, длинные делеции и др. события в культивируемых клетках , а также в зиготах мышей и свиней^2-4. Чтобы выявить длинные делеции, матрица пары праймера д. быть tiled на значительном расстоянии от обеих сторон мутации, анализ сцепления, проведенный на дальнего действия PCR продуктов, сможет подтвердить, происходит ли амплификация для обеих материнской и отцовской хромосом. В исследовании, подготовленном для оценки этих событий систематически, Cas9-индуцированные разрывы двойной нити в эмбриональных стволовых клетках мышей , как было установлено, превращаются в крупные делеции (250 - 9500 bp) приблизительно в 20% отредактированных клеток⁵. Этот подход остается несовершенным для детекции всех событий, однако, поскольку очень крупные делеции или др. события, такие как инверсии, транслокации, потери хромосом и крупные инсерции предупреждают амплификацию и поэтому будут избегать характеризации. В самом деле, в 19% редактируемых клеток по аутосомным локусам только один из двух аллелей может быть восстановлен⁵. Такая изменчивость исходов репарации DSB может быть результатом несовместимости генотипов в нормальным развитием, а значит необходимо их идентифицировать, чтобы исключить затронутые эмбрионы.

Fig. 1: Constraints on gene editing by inter-homologue homologous recombination (IH-HR) in the early human embryo.

a, Possible repair outcomes after a Cas9-induced DSB at the paternal MYBPC3ΔGAGT locus. Red and blue circles indicate unique maternal and paternal genetic variants, respectively. IH-HR results in gene conversion of the paternal allele by the wild-type (WT) maternal allele. The repair outcome can be a non-crossover or a crossover. Only one outcome of crossing-over is shown, in which the recombined chromosomes segregate to the same nucleus. The alternative is that the recombined chromosomes segregate to different daughter cells, such that loss of heterozygosity would occur on the chromosome from the point of the IH-HR event to the telomere in both daughter cells, one with homozygosity for the maternal chromosome and the other for the paternal chromosome. This outcome would be expected in half of the crossing-over events that underwent IH-HR in the G2 phase of the cell cycle. NHEJ can lead to small indels (not shown), but events are also possible that result in the deletion of a primer-binding site used for genotyping (as shown). b, Schematic of possible repair outcomes after Cas9 cleavage in the human zygote from panel a. m, maternal chromosome; p, paternal chromosome. c, Parthenogenesis after fertilization failure with (top) and without (bottom) second polar body (PB) extrusion. Outcomes of a-c are indistinguishable in genotyping assays using flanking PCR primers alone. d, Schematic of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) followed by progression through the first cell cycle during day 1 of development. The number of maternal and paternal genomes is indicated at each phase of the cell cycle. e, Immunofluorescence of a mouse zygote at telophase of the second maternal meiotic division. Note that only the maternal genomes are attached to microtubules, while the paternal genome begins to form an interphase nuclear membrane to replace the sperm membrane. BF, bright field. f, Progression of human zygotes through the first cell cycle from the two-pronuclear stage to prometaphase, when the two genomes can be removed from the egg by a needle. Note the separation of the two genomes (arrows and dashed circles). NEBD, pronuclear envelope breakdown. g, Cell cycle progression during day 1 in fertilized mouse zygotes. Of 23 mouse eggs, none showed direct contact between the maternal and paternal genomes. Scale bars, 10 microm. Images one and four (from the left) in f are from Egli et al.14; images four to six (from the left, top) in g are from Egli et al.13.

Дикого типа генотипы при методе PCR также могут возникать путем активации яиц во время инъекции Cas9, но не сопровождаться успешной интеграцией генома спермия, давая в результате гаплоидные или диплоидные партеногенетические клетки, содержащие только матерински геном⁶ (Fig. 1c). Отцовский вклад определялся с помощью цитогенетического анализа в некоторых из линий стволовых клеток, полученных из эмбрионов Ma et al.1, но авт. не определяли, действительно ли линии стволовых клеток дикого типа происходили из спермиев дикого типа или возникали за счет коррекции гена.

Чтобы прямо продемонстрировать коррекцию гена с помощью IH-HR, необходимы доказательства нового сцепления материнского и отцовского аллелей - т.е., включения последовательности дикого типа от одного из материнских гомологов в мутантную отцовскую хромосому в месте DSB (Fig. 1a). Новые ДНК сцепления могут быть определены с помощью фазового секвенирования ДНК или с помощью long-range PCR, использующей аллель-специфичные праймеры^7,8. Такой анализ гаплотипов особенно критичен в случае эмбрионов, полученных в результате инъекций в ооциты в фазе MII, в результате эмбрионы, происходящие от спермиев, несущих мутантный аллель, не было возможно определить.

Хотя IH-HR в оплодотворенных ооцитах и зиготах не может быть исключена, имеется несколько препятствий этому механизму. IH-HR после индукции DSB в митотических клетках млекопитающих описана¹¹, и наблюдалась также в недавнем исследовании с использованием CRISPR-Cas9 в эмбриональных стволовых клетках⁵, считается, что она менее частая, чем HR между сестринскими хроматидами или NHEJ. У млекопитающих IH-HR важна для редукционных делений, чтобы сформировать гаметы и вызывается большим количеством DSBs, которые вызываются, чтобы сформировать их на каждой хромосоме⁹. Важно отметить, однако, что мейотическая IH-HR возникают во время плодного развития у самок¹⁰ и если это т ак, то со временем они удаляются из событий, описываемых у Ma et al¹.

Физическое разделение материнского и отцовского геномов в оплодотворенной яйцеклетке, как полагают, д. быть существенной помехой для IH-HR во время первого клеточного цикла. После оплодотворения, самостоятельные материнское и отцовское ядра образуют (пронуклеусы), так что два генома разделены в клетке, которая более чем 100 µm в диаметре (Fig. 1d-g). Такое разделение может мешать инкорпорации отцовских хромосом в веретено ооцита MII (Fig. 1e). Во время первой интерфазы материнский и отцовский пронуклеусы мигрируют с места их образования к центру зиготы, но их целостность сохраняется в течение всей интерфазы (Fig. 1f, g), во время которой с индивидуальными ядрами можно манипулировать¹². В зиготах человека и мыши материнский и отцовский геном подвергаются репликации ДНК в отдельных ядрах и вступают в первый митоз как самостоятельные образования, в это время с ними всё ещё можно манипулировать (Fig. 1f, g). Под действием микротрубочек материнский и отцровский геномы собираются в общую метафазную пластинку для первого митоза^13,14, хотя они остаются в самостоятельных группах¹⁵. Следовательно, прямой контакт между материнским и отцовским геномами, необходимый для inter-homologue репарации, по-видимому, не происходит вплоть до первого митоза или позднее, когда эмбрион вступает в стадию двух клетокe и два генома упаковываются в одно и то же ядро. Относительно использования Cas9, это происходит. 24-30 ч после инъекций в MII и 6-12 ч после инъекций в зиготу.

Важно отметить разные исходы, получаемые Ma et al.¹ в отношении мозаицизма в зависимости от того инъецируется CRISPR-Cas9 в зиготы (высокая частота мозаицизма) или вместе со спермием в яйцеклетку в фазе MII (отсутствие видимого мозаицизма). Мозаицизм при инъекциях в зиготы согласуется с репарацией DSB, возникающей после репликации ДНК, тогда как отсутствие мозаицизма после инъекций в MII-фазе указывает, что репарация происходит до репликации ДНК и до первого митоза. В соответствии с этим инъекции CRISPR-Cas9 вместе со спермием в мышиные MII ооциты приводят к не мозаичным модификациями отцовского генома в течение только 3 ч благодаря NHEJ во время деконденсации хроматина спермия¹⁶. Безусловно, материнский геном, по-видимому, мало пригодный для редактирования во время выхода из мейоза. Разные исходы зависят от времени инъекции CRISPR-Cas9, это указывает на то. что редактирование генов в отцовском геноме во время деконденсации или после образования ядра может быть использовано в разных механизмах репарации.

Итак, прямое подтверждение коррекции генов и исключение др. возможных исходов необходимо для любого эмбриона, готовящегося к будущей имплантации. Редактирование генов обладает потенциалом уменьшения аллелей, вызывающих болезнь, но непредвиденные изменения в зародышевой линии человека, включая перестройки, длинные делеции и потерю гетерозиготности, напр., в результате IH-HR, могут иметь серьезные последствия, влияющие на развитие, предрасположенность к раку и плодовитость. Наше обсуждение результатов Ma et al.¹ демонстрирует необходимость более тщательной характеристики механизмов репарации у ранних эмбрионов и выявляет ключевые препятствия для терапевтического использования редактирования генов в зародышевой линии человека: разработка реальных подходов для отличия разных исходов репарации.