Клональная история и дивергенция предшественников зародышевых слоёв у ранних эмбрионов может быть описана с помощью профилей генной экспрессии во временном (developmental) и пространственном (location) измерении. Анализ РНК секвенирования (RNA-seq) одиночных клеток позволяет реконструировать онтогенетические траектории эмбриональных клеток, но при этом отсутствует пространственная и временная привязка^9-13. Чтобы осуществить считывание пространственных данных транскриптома эпибласта, был осуществлен геномный анализ транскриптома в географически определенных популяциях клеток эпибласта с использованием низкого уровня RNA-seq по Geo-seq протоколу на поздней стадии срединной полоски эмбриона¹⁴. Здесь Geo-seq анализ пространственного транскриптома был расширен на ряд пост-имплантационных стадий развития от пре-гаструлы (день эмбриогенеза (E)5.5) до поздней гаструлы (E7.5) на все зародышевые слои собственно эмбриона (Fig. 1a and Extended Data Fig. 1a-c). Такой пространственно-временной транскриптом дискретных популяций из 5-40 клеток предоставил обстоятельный каталог транскриптов в тканях зародышевых слоев эмбриона беспрецедентных по глубине и качеству (Extended Data Fig. 1d, e and Supplementary Table 1). Непосредственное описание этого пространственно-временного транскриптома предоставило богатую базу данных динамических профилей экспрессии кодирующих и не кодирующих транскриптов в определенных местах зародышевых слоев эмбрионов E5.5 - E7.5 мышей, которые могут быть представлены в цифровой форме для визуализации в высоком разрешении 2D corn plots (Fig. 1b and Extended Data Fig. 1f-i) и в виде 3D анатомической матрицы¹⁴ (Methods). Идентификация регион-специфических транскриптов представляет молекулярную точку входа для функционального анализа. Напр., нокаут концентрирующихся сзади long non-coding RNAs (lncRNAs) 310004A29Rik и RP23-458G12.2 (Extended Data Fig. 2) приводит к нарушению регуляции генов, связанных с мезодермой, в дифференцирующихся эмбриональных стволовых клетках, это указывает, что эти не-кодирующие транскрипты участвуют в регуляции дифференцировки клеточных клонов, происходящих из задней части эпибласта.



Fig. 1: Analysis of the spatiotemporal transcriptome of post-implantation mouse embryos by Geo-seq.

a, The spatial and temporal coverage of Geo-seq samples of E5.5-E7.5 embryos (Methods). A, anterior; P, posterior; L, left lateral; R, right lateral; L1, anterior left lateral; R1, anterior right lateral; L2, posterior left lateral; R2, posterior right lateral; Epi1 and Epi2, divided epiblast; M, whole mesoderm; MA, anterior mesoderm; MP, posterior mesoderm; En1 and En2, divided endoderm; EA, anterior endoderm; EP, posterior endoderm. S, sample section; R, reference section. Sn: sample section of level n. b, Corn plots showing the spatial pattern of expression of T and Mixl1, which marks the length of the primitive streak for developmental staging of gastrulation. Solid circles, epiblast-ectoderm; black outlined rhombus, mesoderm; black outlined circles, endoderm; grey hollow circles, no sample. n > 2 for each gene. c, The phylogenetic tree shows the classification of embryonic tissues from pre-implantation to gastrulation.

Для анализа траекторий клонов мы обогатили Geo-seq массив данных данными RNA-seq ст. E2.5 морулы, E3.5 внутренней клеточной массы бластоциста и E4.5 эпибласта и примитивной энтодермы¹⁵ , чтобы сопоставить континуум транскриптома по мере пре- и пост-имплантационного развития мышиного эмбриона. Мы использовали информацию single-cell regulatory network inference and clustering (SCENIC)¹⁶, чтобы измерять регулоны (regulon) активностей в выборках из клеточных популяций (Extended Data Fig. 3a and Methods). Базирующееся на regulon филогенетическое древо показало, что выборки могут быть подразделены на 6 групп, которые представляют основные типы тканей ранних эмбрионов: pre- and peri-implantation, эпибласт, первичная полоска, эктодерма, мезодерма и энтодерма (Fig. 1c). Конечно, клетки первичной полоски на ст. E6.5-E7.0 отделены от первичной полоски E7.5, это указывает на то., что первичная полоска гетерогенна во времени в начале и конце гаструляции. Выборки энтодермы на ст. E5.5-E7.5 формируют самостоятельный кластер, отдельный от эпибласта, эктодермы и мезодермальной ткани. Кроме того, кластер энтодермы ближе к pre- и peri-имплантационным эмбрионам, чем эмбрионам на ст. гаструляции. Формирование кластеров также указывает, что мезодерма, связанна с клетками задней части эпибласта, содержащего первичную полоску на ст. E7.5, и эктодерму, возникающую из передней части эпибласта (Fig. 1c and Extended Data Fig. 3b). Следовательно, regulon представляет собой пространственно-временной транскриптом, снабженный аннотацией о потенциальной онтогенетической связанности клеточных популяций у ранних эмбрионов.

Анализ активности регулонов в выборках тканей на ст. E2.5 - E7.5 выявляет 9 групп регулонов, управляемых транскрипционными факторами, ассоциированных с 6 основными клональными кластерами (Fig. 2a and Supplementary Table 2). Используя биологически обусловленные признаки, определяемые с помощью SCENIC, мы осуществили principal component analysis (PCA) и t-distributed stochastic neighbour embedding (t-SNE) тканевых выборок на базе показателей активности regulon. Мы установили, что онтогенетическое время и клональные пути были в основном уже вычленены в первых двух пространствах принципиальных компонент (principal-component space) (Fig. 2b and Extended Data Figs. 3c, 4a). Энтодермальные ткани были на одной линии с примитивной энтодермой и были отделены от эпибласта и производных эпибласта. Мезодерма и эктодерма были в онтогенетической траектории на ст. E4.5 ветви эпибласта и были тесно связаны со многими регуляторными состояниями, общими двум этим клонам. Чтобы сделать видимым удивительное расхождение мезодермы и эктодермы, были предприняты анализы PCA и t-SNE выборок, которые исключали энтодерму. Результаты показали четкую дивергенцию мезодермы и эктодермы на ст. E7.5 (Extended Data Fig. 3d). Далее мы анализировали взаимоотношения энтодермы, мезодермы и первичной полоски. В противовес превалирующему мнению, что дефинитивная энтодерма возникает в основном из первичной полоски, мы обнаружили, что энтодерма гаструлирующего эмбриона транскрипционно более сходна с примитивной или висцеральной энтодермой, чем с первичной полоской (Fig. 2b and Extended Data Fig. 3e, f). Однако, мезодермальные ткани в дистальных регионах эмбриона на ст. E7.0 и E7.5 обнаруживали regulon connectivity с соседней энтодермой (напр., G3 and G4 in Extended Data Fig. 3g, h), подчеркивая потенциальное расположение происходящей из эпибласта энтодермы^13,17.



Fig. 2: Developmental regulons.

a, The BIC-SKmeans heat map (on the basis of regulon activity scores; Methods) showing nine regulon groups in tissue samples of E2.5 to E7.5 embryos (ordered on the basis of Fig. 1c) with listing of examples of regulon transcription factors (numbers of predicted target genes by SCENIC in the brackets) for G1-G9 and the enriched Gene Ontology (GO) terms for each regulon group. Right column heat map: contribution of each regulon to the principal component 1-4 (PC1-4). Bottom row heat map: projection scores of each sample on the PC1-4. b, PCA plot based on the regulon-activity matrix of tissue samples showing separate developmental trajectories (arrows) across the E2.5 to E7.5 timelines (n = 226). c, Two-dimensional PCA plots (n = 226) and corn plots showing the averaged regulon activities of regulon group G1 and G5 in embryonic tissues. PI, pre-implantation; END, endoderm; PS, primitive streak; EPI, epiblast; ECT, ectoderm; MES, mesoderm.

Кривые (Plotting) распределения средней активности групп regulon, определяемые с PCA и corn plots, выявили связанные с популяциями и связанные с зародышевыми слоями детерминанты (Fig. 2c and Extended Data 4b). Напр., G1 regulon обогащен в выборках E7.5 мезодермы и задней части эпибласта и в первичной полоске, G9 был особенно богат в клетках пре-имплантационных эмбрионов, а G6, содержащий сеть транскрипционных факторов , ассоциированных с Sall2, Sox2 и Otx2 - был обогащен в пери-имплантационных выборках. Так, клеточный цикл обогащающий G4 regulon был ассоциирован с большей частью тканей пост-имплантационного эпибласта за исключением энтодермы, указывает на возможное предпочтение в пролиферативной активности среди зародышевых слоёв. С помощью PCA выявляемые группы regulon, также выявляли ассоциацию G3 и G5 с сегрегацией ранней и поздней энтодермы, соотв. Дальнейший анализ взаимодействий regulons с использованием индекса специфичности соединений¹⁸ идентифицировал характерные regulons (напр., Sox17, Foxa2 и Gata4), которые обнарживали наиболее количество связей с др. regulons (Extended Data Fig. 4c and Supplementary Table 3). Эти regulons были заполнены множеством известных клон-специфичных генов, а некоторые члены regulon были ассоциированы с мутантными связанными с зародышевыми листками фенотипическими отклонениями (Extended Data Fig. 4c, d and Supplementary Table 4), это подтверждает вклад в формирование эмбрионального паттерна во время гаструляции. Чтобы исследовать, действительно ли предсказываемые транскрипционные факторы регулонов являются существенными для развития специфических тканевых клонов, три транскрипционных фактора (Sp1, Hmga2 и Hmgb3) в группах regulon G7, G8 и G1, соотв., были подвергнуты нокауту в эмбриональных стволовых клетках. Устранение Sp1 способствовало выходу из нативной плюрипотентности в формативную плюрипотентность во время дифференцировки эмбриональных стволовых клеток (Extended Data Fig. 5a, b). Нокаут двух, связанных с мезодермой, транскрипционных факторов (Hmga2 и Hmgb3) приводил к аберрантной экспрессии примитивных гематопоэтических и кардиальных генов, соотв., демонстрируя, что эти два транскрипционных фактора регулонов могут играть роль в направлении дифференцировки мезодермы (Extended Data Fig. 5c-g and Supplementary Videos 1 and 2). Поэтому пространственно-временной транскриптом информирует о генетической активности, регулирующей сегрегацию клонов и управляющей дифференцировкой зародышевых листков при пост=имплантационном развитии.

Пространственно-временной транскриптом пост-имплантационных эмбрионов позволил нам внимательно рассмотреть архитектуру и молекулярные атрибуты плана тела. Пространственные домены дифференциально экспрессирущихся генов (DEGs) были идентифицированы у эмбрионов на каждой ст. развития (Supplementary Table 5). Анализ формирования кластеров выявил в целом гомогенность эпибласта на ст.E5.5 и E6.0 эмбриогенеза (Extended Data Fig. 6a, b). На ст. E6.5, эпибласт оказывался подразделенным на передний и задний домен, при этом задний домен был маркирован экспрессией генов первичной полоски, таких как T, Mixl1 и Mesp1 (Extended Data Fig. 6c). Во время гаструляции эпибласт компартментализовался далее на передний, задний и латеральные домены (Extended Data Figs. 6e, 7a). Мезодерма подразделялась на передний и задний домены на ст. E7.5 (Extended Data Fig. 7a). Эти пространственные домены также подчеркивают существование уникальных эмбриональных структур; напр., узелка, который обнаруживает ограниченную экспрессию G5 DEG группы на ст. E7.5 впереди первичной полоски, и в ткани соседней энтодермы (Extended Data Fig. 7b-d). Отслеживание экспрессию сигнатурных генов, таких как Noto, Nodal и Foxj1, выявило генез организатора гаструляции^19,20.

В энтодерме присутствовали клеточные популяции, экспрессирующие маркеры, специфические для дистальной висцеральной энтодермы и передней висцеральной энтодермы на ст. E5.5-E6.5 (Extended Data Fig. 1g, h), при этом не выявлялось характерной регионализации популяций передней висцеральной энтодермы и дистальной висцеральной энтодермы (Extended Data Fig. 6a-c). Определение места передней висцеральной энтодермы осуществлялось только после соучастия (guilt-by-association) совместной экспрессии, чтобы обогатить набор генов регионализации (Extended Data Fig. 6d). Первые признаки проксимо-дистальной компартментализации энтодермы становились очевидными со ст. E6.0 (Fig. 3a). Чтобы выявить гетерогенность популяций энтодермы в прокисмо-дистальных доменах, мы исследовали 384 одиночных клеток из энтодермы ст. E7.0 (Extended Data Fig. 7e, f). Мы нашли тесно связанные кластеры одиночных клеток с характеристиками висцеральной энтодермы, но уровни экспрессии Sox17 и Sox7 варьировали после удаления небольшого кластера, экспрессирующего маркеры первичной полоски (T и Mixl1) (Fig. 3b, c and Extended Data Fig. 7g, h). С помощью деконволюционного анализа Geo-seq выборок энтодермы с использованием типов клеток, определяемыми с помощью RNA-seq одиночных клеток, мы определили расположение кластера одиночных клеток (SC-En1 и SC-En2) в пространственных доменах энтодермы (E1 и E2) и определили относительные фракции каждого типа клеток. Проксимальный и дистальный домены энтодермы эмбрионов ст. E7.0 были заняты исключительно этими двумя кластерами одиночных клеток энтодермы, соотв., тогда как популяции с промежуточными свойствами наблюдались в регионе соединения двух Geo-seq доменов энтодермы (Fig. 3a, d).



Fig. 3: The molecular architecture and spatial relationship of the germ-layer tissues.

a, The spatial domain of cell populations that are defined by the expression profile of the DEGs in the tissue and germ layers of E5.5-E7.5 embryos. b, Clusters of single cells (SC-C1, SC-C2 and SC-C3) from the E7.0 endoderm (left, n = 345; right, n = 295), reclustered into SC-En1 and SC-En2. c, Expression of Sox17 and Sox7 in single cells (n = 295). d, Deconvolution analysis inferred the proportion of two endoderm cell types in Geo-seq endoderm samples. Colour bar indicates the cell-type frequency. e, The connection of spatial domains based on the correlation of averaged regulon activities in the tissues of E2.5-E7.5 embryos. f, The connectivity of tissues underscored by the continuity of the regulon groups (G1-G9). MOR, morula; ICM, inner cell mass; PrE, primitive endoderm; TE, trophectoderm. Spatial domains: epiblast (Epi), Epi1-3; endoderm (En), E1-3; ectoderm, Ect1-3; mesoderm, M, MA and MP.

Общее расположение пространственных доменов обнаруживает значительное постоянство между эмбрионами (Extended Data Fig. 8 and Supplementary Table 6), это подтверждает высокую синхронность в формировании эмбрионального паттерна клеточных популяций в зародышевых листках во время гаструляции. Корреляции показателей активности регулонов с пространственными доменами DEG на последовательных ст. развития (Fig. 3e, Methods and Supplementary Table 7) указывают на регуляторную сеть, которая составляет фундамент молекулярной архитектуры по траектории развития от морулы в направлении 9 главных популяций зародышевых листков на ст. E7.5 (Fig. 3a, e). Конечно на ст E7.5 задняя энтодерма и задняя мезодерма обнаруживают общие взаимоотношения с клетками первичной полоски ст. E7.0. Показатели высокой активности T и Sox2 в передне-дистальном регионе E7.0 первичной полоски (Extended Data Fig. 6f), подчеркивают презумптивное существование neural-mesodermal предшественников²¹. До ст. E7.5, энтодерма состоит в основном из клеток, связанных примитивной и висцеральной энтодермой (Fig. 3e). Однако, принимая во внимание присутствие клеток типа, сходных с первичной полоской, среди трех кластеров из одиночных клеток энтодермы ст. E7.0 (Extended Data Fig. 7f-h), и то что дистальная часть энтодермы на ст. E7.5 (E1) связана с мезодермой (Fig. 3e), клетки E1-энтодермы могут представлять энтодерму, происходящую из первичной полоски и выходящую через мезодерму на поздней ст. гаструляции^13,17,22. Эти находки подтверждают исследования по отслеживанию клонов, сообщающих о конвергенции клеток вне-эмбрионального происхождения с состоянием эмбриональной энтодермы²³. В целом паттерн переключения регулонов в точках расхождения и последовательность переходов regulon подчеркивают прирожденный и динамический молекулярный контроль спецификации судьбы ткани во время развития зародышевых слоёв (Fig. 3f).

Чтобы идентифицировать ключевую сигнальную активность, регулирующую формирование тканевого паттерна, мы осуществили enrichment анализ сигналов, передаваемых генами мишенями, сопоставляя их с данными по regulon (Methods) для 9 групп regulon. Активация и подавление активности 6 сигнальных путей были регионализованы в зародышевых слоях (Fig. 4a, b and Extended Data Fig. 9a, b). Однако, только мезодермальные и связанные с энтодермой regulon группы G1, G3, G5 и G8 обнаруживали достоверное обогащение активной передачи сигналов (Extended Data Fig. 9a). Сигнальный путь Hippo-Yap, который играет роль в сегрегации трофэктодермы²⁴, но менее всего охарактеризован у гаструлирующих эмбрионов, концентрировался (enriched) исключительно в энтодерме (Fig. 4a, b). Канонические факторы пути Hippo-Yap, такие как Tead1, Tead4 и Ctgf экспрессировались специфически в энтодерме, хотя Yap1 экспрессировался широко (Extended Data Fig. 9c, d). Блокирование сигнальной активности в эксплантах энтодермы YAP ингибитора verteporfin приводила к подавлению маркеров висцеральной энтодермы и связанного с ранней энтодермой regulon G3, но не меняло генов поздней энтодермы (Extended Data Fig. 9e-i). Эта находка подтверждает, что передача сигналов Hippo может участвовать в регуляции развития ранней энтодермы.



Fig. 4: Relationship of regionalization of signalling activity and transition of pluripotency state with cell fates in the post-implantation embryos.

a, Corn plots showing the activities of the target genes related to the activated and inhibitory states of the Hippo-Yap signalling pathway in the germ layers of E5.5 to E7.5 embryos. b, Spatial territory of active bone morphogenetic protein (BMP), Wnt, fibroblast growth factor (FGF), Hippo-Yap, Notch and Nodal signalling in the three germ layers of E5.5 to E7.5 embryos. c, Gene-set activity analysis of the expression domains of genes associated with naive, formative and primed pluripotency states in E2.5 to E7.5 stage embryos. d, The transition of pluripotency states in the epiblast-ectoderm of E5.5 to E7.5 embryos.

На основании пространственного паттерна средних уровней экспрессии и показателей активности известных маркеров зародышевых листков (Extended Data Fig. 10a, b), была сконструирована серия карт молекулярных судеб для эпибласта (Extended Data Fig. 10c(i), (ii) and Methods). Карты показали, что передняя часть эпибласта приобретает расширенный потенциал эктодермы на ст. E7.0 и E7.5. Задняя дистальная часть эпибласта приобретает потенциал мезодермы-энтодермы на ст. E7.0 и преимущественно потенциал мезодермы на ст. E7.5. Предшественники поверхностной эктодермы располагаются в передней проксимальной части эпибласта (at E7.0) , а затем в проксимально-латеральной части эпибласта (на ст. E7.5). Эти карты молекулярных судеб широко воспроизводят ранее установленные карты клеточных судеб²⁵ (Extended Data Fig. 10c(iii)).

Континуумом плюрипотентности обладают эмбриональные клетки во время около-имплантационного развития¹. Профилирование экспрессии генов в отношении регуляторной сети плюрипотентности¹⁵ (Supplementary Table 8) показало, что транскрипционная активность в нативном состоянии регуляторной сети плюрипотентности теряется после имплантации (Fig. 4c). Транскрипция генов, ассоциированных с созидательным состоянием плюрипотентности, обнаруживается в эпибласте на ст. E5.5 и сначала регионализуется в передней части эпибласта (E6.5) и сохраняется в передней части эпибласта-эктодермы (E7.0-E7.5) (Fig. 4c). Приобретение primed состояния плюрипотентности происходит на ст. E6.5 в задней части эпибласта, что совпадает с концентрацией генов, ассоциированных с эпителиально-мезенхимным переходом в задней части эпибласта (Extended Data Fig. 10d), это указывает на инициацию детерминации зародышевых слоёв. Переход к primed плюрипотентности продолжается в задней части эпибласта на ст. E7.0 и снижается на ст. E7.5 (Fig. 4c). Следовательно, переход к и выход из плюрипотентности - предваряет дифференцировку клонов - соответствует регионализации и асинхронности среди клеточных популяций эпибласта (Fig. 4d).

Пространственно-временной транскриптом открывает путь к использованию молекулярной активности при клональной дифференцировке и формированию тканевого паттерна во времени и пространстве, выявляя принципиальные регуляторные механизмы управления клональным развитием^26,27 и позволяя выявлять молекулярную архитектуру и траектории развития в производных зародышевых слоев в беспрецедентных деталях. Эти данные будут ценным ресурсом для проведения будущих исследований по выяснению молекулярных механизмов клональной дифференцировки и морфогенеза у пост-имплантационных эмбрионов и управляемой дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток.