Развитие - хорошо отрежессированный процесс, контролируемый в первую очередь с помощью регуляторов транскрипции, таких как микроРНК (miRNAs), играющих важную роль в тонком контроле динамики экспрессии генов. MicroRNAs - это небольшие в ~22 нуклеотида (nt) эндогенные не кодирующие РНК, регулирующие экспрессию генов, за счет пост-транскрипционной деградации мРНК или путем препятствования трансляции белков (Bartel, 2004; He & Hannon, 2004). Их биогенез происходит в несколько этапов, начиная с транскрипции обычных полиаденилированных первичных miRNA (pri-miRNA) транскриптов (>200 nt), иногда обозначаемых как "host genes". pri-miRNA имеет характерную шпилечную структуру, которая расщепляется в ядре ферментом Дроша в pre-miRNA (~60 nt), которая экспортируется в цитоплазму перед окончательным преобразованием в 21-24 nt зрелую miRNA с помощью фермента Dicer (Han et al., 2006). первая miRNA была открыта у нематоды C. elegans (Lee, Feinbaum, & Ambros, 1993) и с тех пор тысячи miRNAs были открыты у разных растений, многоклеточных и некоторых вирусов (Kozomara & Griffiths-Jones, 2011).

Многие исследования показали, что делеция ключевых игроков в биогенезе miRNA, таких как Ago2, Dicer1 и Dgcr8 приводит к эмбриональной летальности и аресту (Alisch, Jin, Epstein, Caspary, & Warren, 2007; Bernstein et al., 2003; Morita et al., 2007; Wang, Medvid, Melton, Jaenisch, & Blelloch, 2007). Однако, потеря одиночных miRNAs не приводит к драматическому эффекту, как. нокаут всех miRNAs в организме (Park, Choi, & McManus, 2010). Это может быть обусловлено перекрываемостью miRNA - взаимодействия мРНК, как и каждая мРНК могут подвергаться воздействию множественных miRNAs и поэтому отсутствие одной из miRNA может быть компенсировано др. Поэтому имеется строгое обоснование изучения роли микроРНК как функциональной группы или единицы. Исследования показали, что большинство генов являются потенциальными мишенями для miRNAs (Friedman, Farh, Burge, & Bartel, 2009) и что miRNAs участвуют в регуляции разных клеточных процессов во время развития и гомеостаза (Vidigal & Ventura, 2015). Нарушение регуляции экспрессии miRNAиз лежит в основе многочисленных болезней и дефектов развития, таких как рак (Lin & Gregory, 2015), сердечно-сосудистые болезни (Romaine, Tomaszewski, Condorelli, & Samani, 2015; Zhao et al.,2015) и нейрологические болезни (Cao, Li, & Chan, 2016).

Получены профили MicroRNAs в разных тканях и первичных клетках многоклеточных и растений (Ehrenreich & Purugganan, 2008; Lagos-Quintana et al., 2002; Wienholds et al., 2005). Mineno с колл. и использовали технологию massively parallel signature sequencing (MPSS), чтобы получить профили miRNAs у целого эмбриона мыши во время 3-х эмбриональных стадий (e9.5, e10.5 и e11.5) и обнаружили 390 разных miRNAs (Mineno et al., 2006). Chiang с колл. расширили эту работу по секвенированию малых РНК из головного мозга, яичников и семенников, эмбриональных стволовых клеток, на эмбриональных стадиях всего эмбриона на 3-х ст. развития и у целых новорожденных и выявили экспрессию 398 уже известных и 108 новых miRNAs (Chiang et al., 2010).

Landgraf с колл. клонировали и секвенировали более 250 малых РНК из 26 разных органов и типов клеток от человека и грызунов, чтобы получить профили экспрессии miRNA и описали разнообразные др. характеристики miRNA (Landgraf et al., 2007). Совсем недавно проект FANTOM5 создал атлас экспрессии miRNA, используя данные глубокого секвенирования РНК из 396 выборок от человека и 47 мышей (De Rie et al., 2017); однако, многие из этих мышиных выборок были просто копиями горстки линий мышиных клеток с и без стимуляции. Предыдущие усилия ENCODE Consortium были сфокусированы на мета-анализе ранее опубликованных 501 человеческих и 236 мышиных данных секвенирования малых РНК из разных источников, чтобы охарактеризовать происходящие в результате сплайсинга miRNAs (mirtrons) в человеческом и мышином геномах (Ladewig, Okamura, Flynt, Westholm, & Lai, 2012). Однако, разнообразие тканей источников и разные лежащие в основе протоколы от несоизмеримых первичных источников осложняют любую сортировку с помощью систематического количественного анализа. Не в последнюю очередь, многие отдельные исследования были сосредоточены на экспрессии определенных микроРНК в определенных тканях немногих (обычно 2-3) временных точках развития мыши. Поэтому полный и систематический атлас экспрессии miRNA во время развития в тканях, представляющих основную систему органов и большое количество эмбриональных стадий мыши, всё ещё отсутствует. С увеличением доказательств критической роли miRNAs в гомеостазе и болезнях, были разработаны многие техники для получения профилей экспрессии зрелых miRNAs, каждая со своими сильными сторонами (Mestdagh et al., 2014). RNA-seq обычно касается профилирования экспрессирующихся транскриптов в 200 nt или длиннее, включая мРНК и длинные не-кодирующие РНК (lncRNA) (Mortazavi, Williams, McCue, Schaeffer, & Wold, 2008), которое в данной работе будет означать мРНК секвенирование (mRNA-seq), в то же время существует множество протоколов специфического секвенирования miRNA (Roberts et al., 2015) и секвенирование коротких РНК (Fejes-Toth et al., 2009). Существуют также базирующиеся на гибридизации методы, такие как microarrays, а также подсчет молекул, такой как NanoString, использующий гибридизацию color-coded молекулярных штрих-кодов (Geiss et al., 2008; Wyman et al., 2011). Т.к. зрелые miRNAs, преобразующиеся из длинных хозяйских pri-miRNAs и считающиеся pri-miRNAs, являются преимущественно белок-кодирующими или lncRNA транскриптами (Cai, Hagedorn, & Cullen, 2004), поэтому мы предполагаем, что mRNA-seq сможет определять профиль экспрессии pri-miRNAs. Однако, существует значительное количество miRNAs, чьи хозяйские гены пока не охарактеризованы. Более того, возникает вопрос, действительно ли экспрессия pri-miRNAs может действительно предсказывать экспрессию соотв. зрелых miRNAs. Это позволило бы одновременно профилировать экспрессию зрелых miRNA вместе с мРНК используя mRNA-seq. Предыдущие исследования попытались ответить на этот вопрос на специфических типах клеток (Zeng et al., 2016). Возможность сопоставления данных mRNA-seq и microRNA-seq для одной и той же выборки в нашем исследовании предоставило уникальную возможность отвуетить на этот вопрос. Более того, соотв. данные мРНК могут пролить свет на целенаправленное действие этих miRNAs и их функциональную роль во время эмбрионального развития.

Каждая miRNA целенаправленно воздействует на ряд мРНК посредством Watson-Crick спаривания между запальной зоной (seed region) (позиции 2-7 от 5' конца) miRNA и сайтами связывания на их мишенях (Bartel, 2009). Такое спаривание комплементарных оснований используется, чтобы с помощью компьютера предсказать мишени для miRNA (Bartel, 2009). Экспрессия miRNAs и мРНК в сочетающихся выборках было использовано для идентификации miRNA-mRNA взаимодействий, напр., при раке (McLendon, 2008). Некоторые методы, такие как biclustering (Jin & Lee, 2015) были использованы, чтобы вычленить miRNA-mRNA взаимодействия из данных по экспрессии генов. Однако, уровни экспрессии мРНК часто затрагиваются многими факторами и сравнение экспрессии мРНК и miRNA не может установить функциональные взаимоотношения с помощью их самих. Поэтому подход, который интегрирует экспрессию miRNA и мРНК и предсказывает их взаимодействия, д. предоставлять более точные заключения о сетях их функциональных взаимодействий.

Мы предоставили один из примеров интегративного анализа данных microRNA-seq с соотв. ENCODE mRNA-seq (и ChIP-seq) данными, чтобы сравнить характеристики и динамику экспрессии miRNA и охарактеризовать изменения в общей тканевой специфичности определенных microRNAs во время развития мыши. В частности мы подсчитали количества предсказываемых компьютером мишеней miRNA в определенных тканях мышей одновременно с negative partial корреляционным анализом кластеров экспрессии miRNA и mRNA во время развития мыши, чтобы идентифицировать онтогенетические процессы, находящиеся под влиянием miRNAs и показали, что группы miRNAs, экспрессируются в одной или более тканей, целенаправленно воздействуют на группы онтогенетически важных мРНК, экспрессирующихся на высоком уровне в разных тканях.