Посещений:
ВЫБОР ОБОНЯТЕЛЬНОГО РЕЦЕПТОРА НЕЙРОНОМ



Участие генов LHX2- and LDB1 и многочисленных энхансеров

LHX2- and LDB1-mediated transinteractions regulate olfactory receptor choice
• Kevin Monahan, • Adan Horta & • Stavros Lomvardas
Nature volume 565, pages448–453 (2019)

The genome is partitioned into topologically associated domains and genomic compartments with shared chromatin valence. This architecture is constrained by the DNA polymer, which precludes interactions between genes on different chromosomes. Here we report a marked divergence from this pattern of nuclear organization that occurs in mouse olfactory sensory neurons. Chromatin conformation capture using in situ Hi-C on fluorescence-activated cell-sorted olfactory sensory neurons and their progenitors shows that olfactory receptor gene clusters from 18 chromosomes make specific and robust interchromosomal contacts that increase with differentiation of the cells. These contacts are orchestrated by intergenic olfactory receptor enhancers, the 'Greek islands', which first contribute to the formation of olfactory receptor compartments and then form a multi-chromosomal super-enhancer that associates with the single active olfactory receptor gene. The Greek-island-bound transcription factor LHX2 and adaptor protein LDB1 regulate the assembly and maintenance of olfactory receptor compartments, Greek island hubs and olfactory receptor transcription, providing mechanistic insights into and functional support for the role of trans interactions in gene expression.
Мышиные обонятельные рецепторы (ORs) кодируются семейством более чем из 1000 генов1, которое организовано в гетерохроматические кластеры2, распределенные по хромосомам. Каждый зрелый сенсорный нейрон (mOSN) экспрессирует только один ген OR моноаллельным и случайным способом3,4. Активация OR нуждается в удалении гетерохроматиновых меток5 и сочетанное действие 63 меж-генных энхансеров, Greek islands, которые связаны с транскрипционными факторами LHX2 и EBF6,7. Экспрессия одного OR совпадает с ядерной конвергенцией кластеров OR генов8,9, это способствует меж-хромосомным взаимодействиям между Greek островками и выбранным OR геном6. Специфичность, с помощью которой Greek островки ассоциируют с активным OR аллелем, также как и значение их меж-хромосомных контактов при транскрипции OR, не выяснены. Хотя меж-хромосомные взаимодействия возникают и в др. системах10-14, беспристрастные подходы, такие как in situ Hi-C15, неспособны выяснить сильные trans контакты между не повторяющимися регионами16,17, возникает вопрос о частоте и биологической роли геномных взаимодействий между хромосомами17,18. Чтобы получить количественную и функциональную информацию о регуляции и функции мульти-хромосомных взаимодействий, мы осуществили in situ Hi-C в 10 отличающихся дикого типа и мутантных типах клеток из главного обонятельного эпителия (MOE) мышей (Extended Data Fig. 1a-d).

Trans compartments form during OSN differentiation


Во-первых, мы проанализировали fluorescence-activated cell (FAC)-sorted mOSNs, которые представляют собой окончательно дифференцированные, пост-митотические нейроны, которые гетерогенны в отношении качественных особенностей OR. In situ Hi-C на mOSNs выявило обширные меж-хромосомные взаимодействия, соответствующие 35.6% от всех Hi-C контактов (Extended Data Fig. 1e), что соответствовало изображениям от предыдущих результатов19. Расширенная геномная точка зрения показала наличие сильных, OSN-специфических trans контактов между кластерами OR генов (Fig. 1a, b) с медианой OR кластера приблизительно в 7.5% от всех Hi-C контактов, картирующих OR кластеры с разных хромосом (Extended Data Fig. 1f). Aggregate peak analysis (APA) и беспристрастное компартментное предсказание15 (Fig. 1b, Extended Data Fig. 1g, h) подтвердили, что большинство кластеров OR участвует в сборке OR-избирательных мульти=хромосомных компартментов. В частности, trans контакты между OR кластерами составляют только 0.25% от всех меж-хромосомных контактов в mOSNs, но достигают 50% из 1000 более сильных trans Hi-C контактов (Extended Data Fig. 1i). В horizontal basal cells (HBCs), в покоящихся стволовых клетках MOE, trans OR контакты почти отсутствуют, обнаруживаясь только у 2% из самых сильных 1000 trans контактов по всему геному, тогда как меж кластерами cis OR контакты были сильными, но менее специфичными, чем в mOSNs (Extended Data Fig. 2a-c, g-j). В более дифференцированных промежуточных нейрональных предшественниках (INPs)15, trans OR контакты были обильными, но менее частыми, чем в mOSNs; взаимодействия cis OR кластеров возникают на тех же самых уровнях, что и в mOSNs (Extended Data Fig. 2d-f, j). Т.о., компартменты OR генов формируются иерархическим способом, при этом cis контакты появляются первыми, а trans взаимодействия усиливаются по мере дифференцировки (Extended Data Fig. 2j-o). In vitro bacterial artificial chromosome (BAC) Hi-C и in silico Hi-C метод показали, что внутри кластеров Hi-C фрагменты не картируются с др. OR кластерами, это увеличивает возможность зависимых от гомологии артефактов картирования (Extended Data Fig. 3).

Fig. 1: Extensive interchromosomal contacts between OR gene clusters and focal interchromosomal contacts between Greek islands form during OSN differentiation.

a, In situ Hi-C contact matrix of chromosomes 2 and 9 in mOSNs shows highly restricted and frequent contacts between OR gene clusters in cis (arrows) and trans (arrowheads). b, APA shows strong focal contacts between OR gene clusters in mOSNs. c, The fraction of Hi-C contacts made to OR clusters located on a different chromosome is shown for every 25-kb bin along chromosome 2. For OR clusters, these contacts increase during differentiation from HBCs (bottom) to INPs (middle) to mOSNs (top). d, e, Pairwise views of OR gene clusters reveals a local maximum of in situ Hi-C interactions between Greek island loci (arrowheads) in cis (d) and trans (e). f, Left, for each Greek island, the fraction of total Hi-C contacts that are made to other Greek islands located in cis at short range (<5 Mb apart, grey), long range (>5 Mb apart, blue) and in trans (red). Right, mean fraction of Hi-C contacts across all Greek islands (two-sided, paired Wilcoxon signed-rank test, n = 59). g, For each Greek island bin (n = 59), the mean number of cis long-range (left) and trans (right) Hi-C contacts per billion made to every non-OR sequence (at 50-kb resolution), intergenic LHX2- and EBF-bound peak (outside OR clusters), or Greek island. Box indicates median, upper, and lower quartiles; whiskers indicate 1.5 ? the interquartile range. All panels present pooled data from two independent biological replicates that yielded similar results when analysed separately.

В OR компартментах 63 эухроматических Greek островков представлены Hi-C 'горячими точками' из специфических и частых cis и trans контактов (Fig. 1d, e, Extended Data Fig. 4a, b). Подобно взаимодействиям OR, контакты trans Greek островков не обнаруживаются в HBCs (Extended Data Fig. 4e, f), которые не экспрессируют ORs. Напротив, в INPs, в которых множественные OR гены слабо транскрибируются в каждой клетке2,20-22, Greek islands взаимодействуют др. с др. , но лишены распределения в фокальных контактах, обнаруживаемых в mOSNs (Extended Data Fig. 4c, d). Зависимые от дифференцировки усиление и спецификация trans взаимодействий являются свойствами большинства Greek islands (Fig. 1f, g, Extended Data Fig. 4g, h). В целом, 4.5% из Greek island Hi-C контактов в mOSNs формируются с др. Greek islands, при этом половина из этих контактов находится в транс-положении (Fig. 1f). Очевидно, это превосходит средние и кумулятивные частоты контактов, которые Greek islands образуют с LHX2 и EBF, чтобы одновременно связывать межгенные последовательности, присутствующие в cis (Fig. 1g, Extended Data Fig. 4i, j), это согласуется с зависимой от дифференцировки сборкой мульти-хромосомного хаба энхансеров, состоящего исключительно из Greek islands.

Greek islands promote compartmentalization


Чтобы механистически вычленить взаимодействия Greek островков, мы исследовали роль стержневых последовательностей из этих энхансеров. In situ Hi-C в mOSNs, несущих гомозиготную делецию островков H18 (2 kb), Lipsi6 (1 kb) и Sfaktiria (0.6 kb) (делеция трех энхансеров), показала сильное снижение trans взаимодействий между геномными bins, содержащими эти делеции и оставшимися Greek островками, эффект, который распространяется на значительные геномные расстояния (Fig. 2a-c, Extended Data Fig. 5a, b). Очевидно, что снижение кумулятивных контактов trans Greek островков коррелирует со снижением транскрипции OR генов, наблюдаемых в клетках, в которых Greek островки были делетированы (Fig. 2c). Если мы исключим Greek island bins (закрома) из этого анализа, то мы также наблюдаем снижение trans OR контактов (Fig. 2c, d, Extended Data Fig. 5c). Т.о., ДНК элементы, небольшие в 0.6 kb, координируют геномные контакты, распространяясь на сотни kilobases, подобно ZIP элементам, которые затрагивают позиционирование ядра у дрожжей23 или Igk энхансер, который затрагивает позиционирование локусов immunoglobulin в pre-B клетках24. Частичные эффекты делеции трех энхансеров на контакты во всем кластере подтверждают, что дополнительные последовательности участвуют во взаимодействиях между OR кластерами.

Fig. 2: Deletion of Greek islands disrupts local recruitment of trans Greek islands and impairs OR compartmentalization.

a, In mOSNs in which three Greek islands (H, Lipsi and Sfaktiria) are homozygously deleted (triple KO), the 50-kb regions containing the deleted islands have reduced trans Greek island contacts, expressed as fraction of total Hi-C contacts. Interactions among the remaining islands are not significantly different (P = 0.80, two-sided, paired Wilcoxon signed-rank test, n = 56). b, Pairwise heat map of Greek island contacts reveals that the 50-kb regions containing the deleted Greek islands (arrowheads) exhibit reduced contacts, plotted as log2(contacts in KO/contacts in control), across the full set of Greek islands. Greek islands are ordered by genomic position and colour bar indicates chromosome. c, The OR gene cluster containing Lipsi makes fewer Hi-C contacts with trans Greek islands and OR gene clusters in triple knockout mOSNs than in control mOSNs. Count data for trans Greek island contacts and trans OR cluster contacts from two biological replicates were analysed to identify loci with a significant difference in contacts between conditions (see Methods). Significantly changed regions, corrected for multiple comparisons, are indicated with asterisks (Padj < 0.05, Wald test). Lower panel, RNA-seq analysis of the expression of OR genes in triple knockout mOSNs relative to control mOSNs. Significantly changed ORs are red (P < 0.01, Wald test, five biological replicates for control mOSNs and four for knockout mOSNs). d, OR gene clusters containing the deleted Greek islands (red) make fewer contacts with trans OR gene clusters in triple knockout mOSNs, plotted as fraction of the total Hi-C contacts. Contacts made by the non-targeted clusters are not significantly different (P = 0.79, two-sided, paired Wilcoxon signed-rank test, n = 64). a, b and d present pooled data from two independent biological replicates that yielded similar results when analysed separately.

Protein regulators of compartmentalization


Затем мы исследовали роль связанных с Greek-island транскрипционных факторов в компартментализации ORs. Мы делетировали Lhx2 в HBCs, и затем использовали methimazole, чтобы побудить эти клетки к дифференцировке25,26. Используя интенсивность TdTomato в качестве маркера, мы идентифицировали две разные популяции, которые состоят из произошедших из HBC INPs и mOSNs (Extended Data Fig. 5d, e). РНК секвенирование (RNA-seq) FAC-рассортированных клеток показало, что ранняя делеция Lhx2 вызывает задержку развитии в клоне OSN и увеличивает INP-специфиеские маркеры (Extended Data Fig. 5f). При этом наблюдается дефицит дифференцировки и возможны изменения в характеристиках клеток, trans OR и trans Greek island контакты были сильно редуцированы в таких клетках по сравнению с mOSNs и даже с INPs (Fig. 3a-d, Extended Data Fig. 5g). Частоты меж-хромосомных взаимодействий остаются высокими у ранних нокаутных по Lhx2клеток, но OR-OR контакты составляют только 16% из 1000 самых сильных trans контактов (Extended Data Figs. 1e, 5h). Поздняя делеция Lhx2 в mOSNs7 (Extended Data Fig. 5i) также снижает trans OR контакты, но не настолько, как при ранней делеции (Fig. 3a, c). Однако, поздняя делеция Lhx2 уменьшает trans и на длинные расстояния cis контакты между Greek островками (Fig. 3b, d, Extended Data Fig. 5j), это согласуется с широко распространенным подавлением OR7.

Fig. 3: LHX2 is essential for the formation of OR compartments and the assembly and stability of Greek island hubs.

a, Pairwise views of Hi-C contacts between OR clusters located on different chromosomes in control (top), early Lhx2 knockout (middle) and late Lhx2 knockout (bottom) OSNs. A Hi-C hotspot between interacting Greek islands in control mOSNs (arrowhead) is absent in both early and late Lhx2 knockout cells. In addition, a strong reduction in the surrounding OR-OR contacts is observed in the early Lhx2 knockout cells. b, Pairwise heat maps of Greek island contacts reveal reduced Hi-C contacts across the full set of Greek islands in early and late Lhx2 knockout cells. c, Contacts made by each OR cluster (n = 67) to OR clusters located in trans, expressed as fraction of the total Hi-C contacts, in control mOSNs versus INPs, early Lhx2 knockout cells, and late Lhx2 knockout cells. Dashed lines are linear fits. d, As in c, but for trans contacts between Greek islands (n = 59). All panels present pooled data from two independent biological replicates that yielded similar results when analysed separately.

Чтобы понять, как LHX2 стабилизирует контакты Greek островков, мы исследовали, действительно ли LHX2 ( LIM доменовый белок) рекрутирует LIM-domain-связывающие белки27,28 (LDB1 и LDB2), которые, как известно, обеспечивают на большие расстояния геномные взаимодействия29-33. Chromatin immunoprecipitation and sequencing (ChIP-seq) для LDB134, который является единственным членом семейства, экспрессирующимся в mOSNs (Extended Data Fig. 6a, b), выявило тесное перекрывание с пиками LHX2 в mOSNs (Extended Data Fig. 6c-e). В соответствии с этим, каждый Greek островок связан с помощью LDB1 зависимым от LHX2 способом (Extended Data Fig. 6f). Greek островки представляют наиболее сильные пики LDB1 в геноме, указываяы тем самым, что LHX2 и EBF действуют синергично при рекрутировании LDB1 (Extended Data Fig. 6g, h). Greek островки и кластеры OR не связаны с помощью CTCF и cohesin субъединицы RAD21 (Extended Data Fig. 6i, j), и это не является неожиданностью, учитывая ингибирующую роль cohesin комплексов в формировании геномных компартментов35,36. Наконец, имеется очень небольшой сигнал LDB1 на промоторы OR генов (Extended Data Fig. 6k), даже для активного Olfr1507 промотора у OLFR1507+ OSNs (Extended Data Fig. 6l). Делеция Ldb1 в mOSNs (Extended Data Fig. 7a, b) вызывает сильное снижение взаимодействий в trans и long-range cis Greek островках (Fig. 4a, b, Extended Data Fig. 7c-f), значительно меньшее снижение взаимодействий между OR кластерами (Extended Data Fig. 7g, h) и даже более слабые эффекты по всему геному в trans (Extended Data Fig. 1e). Очевидно, RNA-seq показывает, что делеция Ldb1 вызывает широко распространенное подавление транскрипции ORs (Fig. 4c), которая, по-видимому, сильно ограничена семейством OR генов (Fig. 4d, Extended Data Fig. 7i).

Fig. 4: LDB1 is essential for the stability of Greek island hubs and for OR transcription.

a, Pairwise heat map of Greek island contacts reveals broad reductions in Hi-C contacts in Ldb1 knockout mOSNs. b, Left, for each Greek island, the fraction of total Hi-C contacts made to other Greek islands located in cis at short range (<5 Mb apart, grey), long range (>5 Mb apart, blue) and in trans (red). Top, control mOSNs; bottom, Ldb1 knockout cells. Right, the effect of Ldb1 knockout on the mean fraction of Hi-C contacts across all Greek islands (two-sided, paired Wilcoxon signed-rank test, n = 59). c, RNA-seq analysis of gene expression in Ldb1 knockout cells relative to control mOSNs. Significantly changed genes are coloured red (Padj < 0.05 for greater than 1.5-fold change, Wald test, n = 5 for control mOSNs and n = 4 for Ldb1 knockout cells). d, Effect of Ldb1 knockout on genes not associated with LDB1 ChIP-seq peaks (n = 9,548), genes located closest to a non-promoter LDB1 ChIP-seq peak (n = 5,624), genes with an LDB1 ChIP-seq peak within the promoter region (n = 1,640) and ORs (n = 1,135). The percentage of significantly changed genes in each category is shown (Padj < 0.05 for greater than 1.5-fold change, Wald test, n = 5 for control mOSNs and n = 4 for Ldb1 knockout cells). Box indicates median, upper, and lower quartiles; whiskers indicate 1.5 ? the interquartile range. a and b present pooled data from two independent biological replicates that yielded similar results when analysed separately.



Greek island hubs contact only the active OR gene


Чтобы протестировать, действительно ли хаб Greek островков регулирует транскрипцию OR за счет прямых взаимодействий с избранным OR геном, мы осуществили in situ Hi-C в OSNs, экспрессирующих OR гены Olfr16, Olfr17 и Olfr1507. В этих популяциях OSN, общая сеть из кластеров OR и взаимодействий Greek островков с основном одна и та же (Extended Data Fig. 8a-d), но специфическая для типов OSN изменчивость, также наблюдается (Extended Data Figs. 8e-m, 9a, b). Однако, в каждом типе OSN транскрипционно активный OR постоянно формирует частые взаимодействия с Greek островками. Напр., в OLFR16+ OSNs локус Olfr16 строго взаимодействует (5% от общего числа Hi-C контактов картируется на Olfr16) с длинного ранга cis и trans Greek островками (Fig. 5a, b, Extended Data Fig. 9c, d), тогда как в OLFR17+ и OLFR1507+ OSNs он взаимодействует преимущественно с соседними Greek островками (Fig. 5a, b). Очевидно, в OLFR16+ клетках, контакты Greek островков были специфически обогащены с локусом Olfr16 (Fig. 5b) относительно полного репертуара (Fig. 5c). Т.о., in situ Hi-C аккуратно идентифицирует транскрипционно активный OR из пула в более 1000 генов посредством его кумулятивных взаимодействий с Greek островками (Fig. 5c, Extended Data Fig. 9e-h).

Fig. 5: Greek island hubs interact specifically with the transcriptionally active OR locus.

a, Increased contacts between the active OR promoter and Greek islands located in short-range cis (<5 Mb, grey), long-range cis (>5 Mb, blue) and trans (red). Greek island interactions are expressed as the fraction of the total Hi-C contacts mapped to each promoter (5-kb resolution). b, Profile of the OR cluster containing Olfr16 reveals increased contacts, expressed as fraction of the total Hi-C contacts mapped to each position (5-kb resolution), between the Olfr16 locus and Greek islands in OLFR16-expressing cells. c, Manhattan plot of Greek island contacts with OR genes reveals that in OLFR16+ cells the Olfr16 locus is the OR gene most significantly enriched for Greek island contacts relative to heterogeneous mOSNs (see Methods). All panels present pooled data from two independent biological replicates that yielded similar results when analysed separately.



Discussion


Наши результаты выявили тип геномного компартмента с мультихромосомным составом и очень высокой эксклюзивностью. Геномные компартменты представляют собой более сложные ансамбли, чем просто сегрегацию продуктов из транскрипционно активного и неактивного хроматина15,37. Однако, демонстрация, что более 1000 генов из 18 хромосом формируют эксклюзивные компартменты, указывающие, что этот процесс регулируется очень точно, сравнимо со сборкой ядрышка, однако, OR компартменты и хабы (ступицы) из Greek островков регулируются с помощью белков с широко-распространенным связыванием в геноме OSN. В отсутствие OR-специфического связывания, которое д. объяснить специфичность контактов OR, мы предположили, что Greek островки связываются с помощью LHX2, EBF и LDB1, а OR гетерохроматин создает уникальный молекулярный 'штрих-код' который собирает OR-специфические компартменты. Эти гетерохроматиновые компартменты могут вызывать эффективное молчание, благодаря фазе разделения свойств HP139,40, но они также обеспечивают тесную близость Greek островков из разных хромосом6,8, заставляя их взаимодействовать. Как было предположено для супер-энхансеров 41,42, такое размещение может способствовать соседней эухроматиновой фазе, состоящей из локально сконцентрированных активаторов. Там, где две фазы несовместимы, то хаб из Greek островков д. обособить активный аллель OR от окружающей репрессивной среды, приводя к стабильному выбору OR (Extended Data Fig. 10). Принимая во внимание, что этот мульти-хромосомный супер-энхансер взаимодействует только с одним выбранным геном OR, а его нарушения вызывают пертурбации транскрипции OR, меж-хромосомные взаимодействия оказываются существенными регуляторами транскрипции OR6,7,43. Эта концепция улучшения с помощью транс воздействий столкнулась первоначально с затруднениями cis-only эффектов делеций энхансеров 18,44,45. Однако, демонстрация, что Greek островки способствуют компартментализации OR и рекрутируют trans Greek островки в направлении проксимальных ORs, объясняют, почему эти элементы являются в основном cis, но редкими trans, энхансерами. Поскольку дально-действующие геномные взаимодействия участвуют в транскрипционной стохастичности12,46,47, то специфичные для типа клеток меж-хромосомные контакты могут служить как дополнительный генератор молекулярного разнообразия.