Большинство исследований регенерации поджелудочной железы сконцентрировано на эндокринных островках. Исторически, исследования регенерации островков базировались на повреждениях у модельных грызунов, включая удаление поджелудочной железы, перевязку панкреатических протоков и химическое удаление клеток островков. При удалении 90% поджелудочной железы крыс не влияло на гомеостаз глюкозы, указывая тем самым на большие резервы, поскольку 10% массы островков были достаточны для поддержания контроля глюкозы в крови6,7,8. Напротив, резекция 50-60% поджелудочной железы у человека вызывала инсулин-зависимый диабет^9,10. Молодые грызуны демонстрировали тканевой рост и разрастания от поверхности разреза после эктомии поджелудочной железы^6,7. Наблюдались и редкие примеры роста ткани у детей после эктомии поджелудочной железы¹¹. Способность такого типа регенерации, однако, резко снижается у взрослых животных и отсутствует у взаимодействия людей^8,10,12.

Второй моделью повреждений, используемой для изучения регенерации поджелудочной железы, является перевязка протока, воспроизводящая обструктивный панкреатит. Физическая перевязка протоков поджелудочной железы вызывает распространенную гибель ацинарных клеток, но эндокринные островки сохраняются и не обнаруживается существенной эндокринной регенерации^13,14. В третей модели повреждений панкреатических β-клеток вызывается специфическое устранение с помощью streptozotocin (STZ) или alloxan, химических токсинов, структурно воспроизводящих глюкозу и избирательно экспортируемых в β-клетки. В зависимости от дозы лекарства вся масса β-клеток может быть частично или почти полностью устранена в течение нескольких дней. Не обнаружено убедительных доказательств при этом регенерации β-клеток у взрослых животных после химического устранения^12,15.

Несмотря на отсутствие существенной регенерации островков у моделей с повржденими, гиперплазия островков наблюдается во время беременности, при ожирении или при резистентности к инсулину у животных моделей^16-19.Напр., масса панкреатических β-клеток мышей увеличивается в 3-5-раз во время беременности, стимулируемая, по крайней мере, частично гормонами беременности плацентарными lactogen и prolactin, с участем передачи сигналов посредством serotonin, Menin и FoxM1^20-23. Богатая жиром диета вызывает ожирение у мышей, она также сопровождается впечатляющим увеличением массы клеток островков²⁴. Экспериментально индуцированная резистентность к инсулину, напр., с помощью нокаута печень-специфических рецепторов инсулина, вызывает 10-кратное увеличение массы β-клеток²⁵. Молекулярные пути, которые управляют подобным увеличением массы β-клеток при ожирении и резистентности к инсулину, пока полностью не установлены.

Скорость пролиферации β-клеток довольно высока у молодых грызунов, но быстро снижается с возрастом^26,27. Напр., в одном исследовании подсчитана скорость пролиферации приблизительно в 4% ежедневно у мышей в возрасте 1 мес. и в 0.5% ежедневно 7-мес. крыс²⁸. Кроме того, заметная гиперплазия островков может быть индуцирована у взрослых животных при беременности и ожирении. Каков же источник этих дополнительных клеток островков? В важном исследовании по отслеживанию генетических клонов у мышей с использованием специфичных для β-клеток драйверов, было установлено, что главным механизмом для восполнения β-клеток при гомеостазе или после повреждений является репликация предсуществующих β-клеток²⁹ (Fig. 1). Роль репликации менее ясна у людей, поскольку наблюдается очень мало репликации β-клеток человека (оценивали с помощью биологического окрашивания пролиферативными антигенами, такими как Ki-67 и PCNA) в выборках поджелудочной железы при аутопсии здоровых, поврежденных, беременных или тучных взрослых людей,^10,30,31.

Fig. 1: Natural regenerative responses of the endocrine pancreas. The adult endocrine pancreas (islets of Langerhans) is made up of four major endocrine cell types with each secreting a major hormone: insulin (β-cells), glucagon (α-cells), somatostatin (δ-cells), and pancreatic polypeptide (PP cells). Animal studies have shown that β-cell replication is a major mode of regeneration and repair in homeostasis, injury, pregnancy, obesity, and insulin resistance. Conversion of islet δ- and α-cells intoβ-cells has been reported after extreme β-cell loss using specific ablation methods in animal models. Significant regeneration of the endocrine pancreas is largely restricted to young children and young animals. Adult animals and adult humans have little, if any, ability to regenerate the endocrine pancreas.

5 принципиальных типов клеток островков β-, α-, δ-, PP b ε-клетки, по-видимому, высоко стабильны при нормальном гомеостазе и в разных моделях повреждений. Напр., избирательное устранение β-клеток с помощью STZ или alloxan не оказывает существенного влияния на количества или фенотипы др. клеток островков. Это кажется неожиданным, что когда используется вызываемое дифтерийным токсином устранение β-клеток для устранения более 99% β-клеток у мышей, то обнаруживается медленное, но достоверное восстановление массы β-клеток в течение нескольких мес.³². Исследования по отслеживанию клонов подтвердили, что новые инсулин-продуцирующие клетки возникают благодаря превращению панкреатических α-или δ-клеток в зависимости от возраста мышей^32,33. Молекулярный механизм подобного превращения между типами клеток островков неизвестен, также как и то, происходят ли подобный превращения у людей. Нет четких доказательств такого типа превращения у пациентов с T1D, или потому, что этого не происходит или потому, что преобразованные клетки элиминируются в результате действия аутоиммунного процесса. Тем не менее эти исследования подтверждают др. механизм, который может в принципе регенерировать часть эндокринного компартмента (Fig. 1).

Существует давняя гипотеза, что панкреатические стволовые клетки и клетки предшественники могут существовать у взрослых животных или даже в поджелудочной железе людей³⁴. Эта гипотеза первоначально базировалась на гистологических наблюдениях одиночных клеток островков и небольших островков, внедренных в или тесно ассоциированных с панкреатическими протоками у взрослых грызунов и людей (наз. neogenesis)³⁴. Однако, генетическое отслеживание клонов с использованием экзокринных драйверов (Muc1-CreER), специфичных для ацинусов драйверов (Cela-CreER, Ptf1a-CreER), и специфичных для протоков драйверов (Sox9-CreER, Hnf1b-CreER)^35-39 четко показывает редкое или полное отсутствие вклада экзокринного в эндокринный компартмент во время нормального гомеостаза или в разных моделях повреждений. Гипотеза неогенеза была подтверждена в сообщении, что перевязка протоков поджелудочной железы у мышей дает редкую популяцию NGN3+ эндокринных клеток предшественников, возникающих в структуре протоков⁴⁰ и в наблюдениях NGN3+ клеток вокруг островков и протоков у экспериментальных моделей трансдифференцировки α-клеток в β-клетки^41,42.

Экзокринные клетки поджелудочной железы состоят из ацинарных клеток и клеток протоков. Наиболее частым повреждением экзокринной части поджелудочной железы является панкреатит, болезненное воспаление, вызываемое различными средовыми факторами (повреждения, алкоголь, диета, богатая жиром, и т.д.) или генетическими (напр., кистозный фиброз)⁴³. Понимание экзокринных нарушений и регенерации возникло в основном из исследований на грызунах экспериментального панкреатита, наиболее распространенным из которых является супра-физиологическая стимуляция ацинарной секреции с помощью caerulein, мышиного аналога гормона cholecystokinin^44,45. Воздействие Caerulein приодит к бsscтрому апоптозу или некрозу ацинарных клеток и кроме того некоторые ацинарные клетки теряют свои многочисленные зимогенные гранулы и существенно сморщиваются, напоминая клетки протоков в процессе, наз. ацинарно-протоковая метаплазия⁴⁶. Животные быстро восстанавливаются от остроuо панкреатита. В течение нескольких недель экзокринная часть поджелудочной железы полностью восстанавливает свою нормальную клеточную архитектуру и функцию. Исследования экзокринной ткани человека от пациентов с панкреатитом также обнаруживают метаплазию в протоки и клеточную пролиферацию^47,48. хотя пациенты с острым панкреатитом могут достигать полного восстановления, остается неясным, действительно ли их экзокринная часть поджелудочной железы подвергается сходной спонтанной репарации и регенерации, что и у животных моделей.

Два отличающихся способа регенерации могут осуществляться в моделях панкреатита⁴⁹ (Fig. 2). При классическом способе регенерации новые ацинарные клетки продуцируются в результате пролиферации предсуществующих ацинарных клеток^35,50,51. При втором способе регенерации лишенные гранул подобные протоковым ацинарные клетки ведут себя как 'redifferentiate' и возвращаются к нормальному и функциональному ацинарному состоянию. Дедифференцировка ацинарных клеток была выявлена по клональному маркеру и и их повторная дифференцировка, по-видимому, осуществляется косвенным образом. Механистические исследования на животных моделях идентифицировали несколько генов и путей, необходимых для экзокринной регенеративной реакции при панкреатите. Делеция ключевых компонентов Hedgehog, Notch и Wnt путей в ацинарных клетках сильно нарушает экзокринную регенерацию^52-54, как это происходит при делеции транскрипционных факторов, ограниченных ацинусами, NR5A2 и PTF1A^55,56. Состояние дедифференцировки ацинарных клеток, по-видимому, представляет собой ранимость, при которой средовые и генетические факторы могут совместно индуцировать неопластическую трансформацию в направлении смертельного рака поджелудочной железы^57,58. Механизмы, которые контролирую регенерацию в противовес неопластической трансформации, пока неизвестны.

Fig. 2: Regeneration of the exocrine pancreas.

The exocrine pancreas is composed of acinar cells that synthesize and secrete digestive enzymes, ductal cells that funnel the enzymes into the small intestine, and central acinar cells. The exocrine pancreas can regenerate spontaneously and robustly in both animals and humans. Inflammatory injuries to the exocrine pancreas such as acute pancreatitis lead to acinar cell death and acinar dedifferentiation, which is characterized by degranulation and morphological transformation into duct-like cells in a process termed acinar-to-ductal metaplasia. Once inflammation subsides, acinar cells can rapidly regenerate by self-replication and possible redifferentiation of the metaplastic duct-like cells back into a normal and functional acinar state.

В то время как панкреатические островки взрослых мышей обнаруживают мощную регенерацию при физиологических проблемах, таких как ожирение, резистентность к инсулину или беременность, существует неопределенность, действительно ли поджелудочная железа взрослых людей может обладать адаптивной регенеративной реакцией, и если это так, то то эти реакции определенно неспособны вызывать существенное физиологическое влияние. В то же самое время, клинические потребности в регенеративной терапии с помощью β-клеток огромны. Приблизительно 2.5 миллионов людей с США (и более 20 миллионов во всем мире) страдают от T1D и несколько миллионов пациентов с T2D имеют дефицит панкреатических β-клеток. Обе популяции пациентов смогли бы извлечь пользу от восстановления массы функциональных β-клеток, освобождая их от ежедневных инъекций инсулина и избегая серьезных осложнений от неправильной дозировки. Необходимость в регенерации β-клеток у пациентов с T1D особенно необходима при этой болезни, которая преимущественно затрагивает детей, а тяжелое отсутствие β-клеток при T1D может вызывать опасные для жизни колебания глюкозы в крови^59,60.

Десятилетия клинических исследований установили, что трансплантации островков трупов могут быть благоприятны у пациентов с T1D, при этом некоторые пациенты могут оставаться без инсулина годами^61,62. Тем не менее трансплантации островков от трупов используются только в незначительной степени из-за отсутствия пригодных трупных островков и необходимости долговременной супрессии иммунитета для борьбы с ауто- и аллоиммунитетом. Воздействие на крупные популяции пациентов могла бы оказаться более благоприятным при наличии надежных и стандартизованных источников островков человека для трансплантаций, в идеале без необходимости иммуносупрессии. Напротив, терапевтические вмешательства, которые стимулируют эндогенную регенерацию островков, могли бы быть использованы. Сегодня предпринимаются усилия оценить стратегии продукции новыз островков in vitro или стимуляции регенерации островков in vivo (Fig. 3).

Fig. 3: Therapeutic strategies for regeneration and repair of the endocrine pancreas.

At present, the most advanced technology for making functional human insulin-secreting cells, and the only one to enter clinical trials, is derivation from human pluripotent stem cells. Other strategies include stimulating proliferation of residual ?-cells in vivo, reprogramming of non-?-cells to ?-like cells in vivo or in vitro, harvesting islets from genetically engineered pigs, and possibly growing entire human pancreata in animals followed by removal of human islets for transplantation.

Декады онтогенетических исследований на лягушках, рыбах и мышах картировали ключевые ступени и критические сигнальные события, приводящие к формированию из оплодотворенного яйца зрелых островков в раннем детстве^63-65. Это глубокое понимание развития поджелудочной железы позволило регенеративной медицине в 1989, когда эмбриональные стволовые клетки человека (hES cells) были успешно культивированы и открыта дверь для разработки методов управления панкреатическими пузырьками из клеток hES⁶⁶. Этот успех был продолжен в 2006 важным открытием, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS cells) могут быть полученны из соматических клеток, таких ка фибробласты кожи, открыв путь для генерации клеток, специфичных для пациентов⁶⁷.

В первом главном исследовании получения панкреатических эндокринных клеток из hES клеток разработан поэтапный протокол с использованием комбинаций сигнальных молекул, чтобы заставить hES клетки дифференцироваться путем последовательных 4-х стадий (дефинитивная энтодерма, панкреатический эпителий, эндокринные предшественники и β-подобные клетки)^68,69. Первые дифференцировки стволовых клеток человека в островковые клетки продуцировали популяцию клеток со смешанной экспрессией гормонов, но не зрелые или настоящие β-клетки⁶⁸. Эти исследования вместе с многочисленными клеточными и генетическими исследованиями панкреатического развития на животных моделях, создали протокол для in vitro дифференцировки, пригодный для плюрипотентных стволовых клеток.

Недавно усилия были направлены на продукцию эндокринных островков, которые могли бы реагировать на глюкозу. Предложены более сложные протоколы дифференцировки с дополнительными ступенями оптимизации коктейля из индуцирующих факторов и химических веществ и использованы методы трехмерного культивирования, дающие кластеры клеток с удивительным морфологическим и функциональным сходством с панкреатическими островками^70,71. Трансплантации этих in vitro произошедших кластеров клеток привел in vivo и мощному устранению экспериментального диабета у модельных мышей^70,71.

В дополнение к эндокринным островка получены панкреатические клетки предшественники, некоторые из которых обнаруживают способность продуцировать зрелые гормон-продуцирующие клетки, кандидаты для клеточной терапии⁶⁹. Преклинические исследования показали, что если из hES клеток происходящие PDX1+ предшественники трансплантировать мышам, то некоторые из этих клеток обнаруживают рост и дифференцировку in vivo в функциональные β-клетки, способные устранять диабет^69,72.Эти успехи привели к фазе I и II клинических испытаний панкреатических предшественников. Наиболее полно дифференцированные функциональные кластеры островков человека готовятся к испытаниям в ближайшее время. Оба подхода, происходящие in vitro кластеры островков, содержащие как β-клетки, так и др. типы островковых клеток (α-клетки и δ-клетки), который, как известно, тонко контролируют функцию β-клеток. Присутствуют и дополнительные типы клеток, имеющиеся в нативных островках, включая сосудистые клетки и похожие на фибробласты клетки, а включение этих дополнительных клеток в кластеры для трансплантации может предоставлять определенные преимущества.

Несмотря на заметные успехи в продукции панкреатических эндокринных клеток из hES клеток, остаются важные проблемы. Сюда входят необходимость уточнения протоколов дифференцировки для продукции крупных количеств, элиминация нежелательных клеток из финального продукта и, конечно, создание защиты от иммунного отторжения. Алло- и аутоиммунное отторжение может быть в принципе устранено физической защитой в небольших устройствах: напр., энкапсуляция в alginate или более надежный биоматериал. Напротив вполне возможно снизить иммунную атаку с помощью генетических модификаций трансплантируемых клеток и/или манипуляций с иммунной системой реципиента.

Специфичные для пациента клеточные продукты могут быть получены из iPS клеток, которые д. быть лишены иммунной реакции и быть иммунологически совместимыми с пациентом, от которого получены iPS клетки. Это, конечно, в первую очередь важно для замещения β-клеток у пациентов с T2D, т.к. пациенты с T1D страдают от аутоиммунитета. Производство специфичных для пациента продуктов тоже имеет свои собственные проблемы, поскольку необходима оптимизация условий дифференцировки для каждой партии iPS клеток, это увеличивает цену и усложняет процесс.

Стимуляция пролиферации β-клеток является простым и интуитивным решением для восполнения массы β-клеток. В самом деле, большие количества ростовых факторов и митогенных агентов, как известно, способствуют пролиферации β-клеток у животных моделей. Сюда входят белок, родственный паратироидному гормону, глюкагон-подобный пептид, инсулин-подобные ростовые факторы, gastrin, эпидермальные ростовые факторы, происходящий из тромбоцитов фактор роста, adenosine kinase ингибиторы и др. ^16,-18,73-75. Однако, эти агенты в общем неспособны существенно повышать пролиферацию β-клеток человека. Существенная пролиферация β-клеток человека происходит естественным образом только в раннем детстве (в основном первый год жизни)^76-79. Итак, β-клетки человека устойчивы к пролиферативным стимулам.

Существуют структурные и молекулярные различия между островками мышей и человека. Напр., β-клетки концентрируются в середине островков мыши, но случайно распределены в островках человека. β-клетки человека также экспрессируют некоторые факторы, такие как MAFB, которые отсутствуют в мышиных β-клетках⁸⁰, и используется GLUT1 скорее, чем GLUT2 в качестве основного транспортера глюкозы^81,82. Кроме того, хотя β-клетки грызунов способны к значительной пролиферации и росту во время беременности, ожирения и состояния резистентности к инсулину, такая пролиферация ограничивается в большинстве у взрослых людей. Неспособность β-клеток взрослого человека пролиферировать является загадкой, поскольку они обладают необходимыми молекулярными элементами, которые контролируют повторное вступление в клеточный (включая циклины, cyclin-dependent kinases (CDKs), E2F факторы и др. ). Прямые манипуляции с этой молекулярной машинерией могут заставить β-клетки человека пролиферировать; генетические мутации в генах клеточного цикла могут также давать редкие панкреатические эндокринные гиперплазии, такие как insulinoma у людей^83,84,85. Несмотря на это многие факторы клеточного цикла, по-видимому, секвестрированы в цитоплазме зрелых β-клеток^86,87. Неясно, почему это происходит или при каких обстоятельствах факторы клеточного цикла могут быть индуцированы к переходу в ядро. Значительные молекулярные и эпигенетические изменения происходят когда β-клетки созревают и с возрастом, при этом хорошо известно, что потеря EZH2 и BMI1, увеличивает ингибиторы клеточного цикла, такие как P16INK4a и p18INK4c, и эпигенетические изменения^15,88,89. Некоторые из этих изменений, по-видимому, улучшают функцию β-клеток ⁹⁰, но они могут широко супрессировать способность β-клеток отвечать на пролиферативные стимулы. Существуют доказательства, что инсулин и глюкоза, повышенные при ожирении или резистентности к инсулину, могут непосредственно стимулировать пролиферацию β-клеток^91-93. Но остается неясным, действительно ли они являются ключевыми сигналами, управляющими гиперплазией островков.

Чрезвычайно важным преимуществом является высокопроизводительный скрининг, идентифицировавший ингибитор двойной специфичности tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A (DYRK1A) в каестве реагента. который может сильно стимулировать пролиферацию в культивируемых β-клетках человека in vitro и трансплантируемые β-клетки человека in vivo . Это предоставляет первую конкретную молекулярную мишень лоя манипуляции с пролиферацией β-клеток человека^94-96. Кроме того, идентифицированы и др. пути, связанные с пролиферацией β-клеток человека, такие как calcineurin и SerpinB1^97,98. Чтобы продвинуть эти реагенты в клинику, необходим контроль специфичности типа клеток, целенаправленное воздействие на островки и гарантия, что реагенты, которые сталкиваются с законсервированным аппаратом клеточного цикла, не создавали проблем в виде возникновени опухолей.

Наблюдались редкие события изменения клеточных онтогенетических судеб⁹⁹. Напр,, в случае регенерации хрусталика у тритонов, где удаление хрусталика приводило пролиферации пигментных эпителиальных клеток, окрузающих хрусталик, и к регенерации нового хрусталика¹⁰⁰. Молекулярные исследования главных регуляторов клеточных клонов, таких как MYOD подтвердили мнение, что мощные генетические факторы могут диктовать выбор клеточных судеб¹⁰¹. А перенос ядра соматической клетки продемонстрировал потенциал почти каждого ядра быть репрограммированным в др. клеточное состояние¹⁰². Соотве. возник огромный инерес к использованию основных регуляторов развития β-клеток для того, чтобы превращать не-β-клетки в β-клетки, продуцирующие инсулин. В ранних примерах установлена индукция экспрессии инсулина культивируемыми клетками печени мыши¹⁰³. Др. исследования подтвердили, что экспрессия инсулина может быть индуцирована в не-β-клетках, но эти клетки не приобретали морфологических, молекулярных и функциональных свойств панкреатических β-клеток и не репрограммирорвались в β-подобные клетки^104-108.

Стратегия комбинаторного скрининга показала, что комбинация трех онтогенетических регуляторов β-клеток, NGN3, PDX1 и MAFA (обозначенных как NPM факторы), может эффективно превращать панкреатические ацинарные клетки в β-подобные клетки после помещения их в поджелудочную железу взрослых мышей, используя аденовирусный вектор¹⁰⁹. Индуцированные β-подобные клетки приобретали долговременную стабильность и способность устранять диабет¹¹⁰. Дальнейший скрининг идентифицировал желудочно-кишечные эпителиальные клетки в качестве др. типа клеток, которые могут быть превращены в β-подобные клетки¹¹¹. Клетки из антральной части желудка, по-видимому, особенно чувствительны е подобной конверсии¹¹². В отдельном исследовании кондиционная делеция FOXO1 из NGN3+ эндокринных предшественников тонкого кишечника также приводила к формированию инсулин-продуцирующих клеток в кишечнике¹¹³. Такие исследования показали, что эпителиальные клетки ЖКТ являются потенциальным источником клеток, экспрессирующих функциональный инсулин путем репрограммирования. Др. примеры репрограммирования мышиных клеток включают цитокинами обусловленную конверсию ацинарных клеток в инсулин-экспрессирующие клетки, превращение клеток протоков в инсулин-продуцирующие клетки путем делеции FBW7 и превращение гепатоцитов в инсулин-продуцирующие клетки с помощью TGIF2^114-116.

Чрезвычайная потеря β-клеток может запускать спонтанное превращение панкреатических δ- и α-клеток в β-клетки^32,33. Хотя молекулярные механизмы этих превращений остаются неизвестными, генетическая делеция ARX, регулятора развития α-клеток или усиление экспрессии PAX4, регулятора развития β-клеток, может превращать α-клетки в β-клетки у мышей^117,118. Уникальная популяция инсулин-продуцирующих клеток на периферии островков, как полагают, является переходной при переходе от α-rltnjr t β-клеткам¹¹⁹. Дальнейшие исследования выявили передачу сигналов γ-aminobutyric acid (GABA) в качестве потенциального посредника в событиях репрограммирования. Ждолговременное воздействие GABA на мышей приводило к впечатляющему увеличению массы β-клеток⁴².

Несмотря на демонстрацию, подтверждающую репрограммирование β-клеток у модельных животных, попытки репрограммировать клетки человека оказались менее успешными. Некоторые исследования подтвердили, что α-клетки человека в островках могут быть репрограммированы в β-клетки^42,120. Изменения в соотношении α-клеток и β-клеток и возникновение положительных как по глюкагону, так и инсулину клеток указывает на некоторую степень конверсии; однако, в отсутствие отслеживания клонов, прямые доказательства всё ещё отсутствуют. Др. типы клеток, такие как панкреатические ацинарные клетки, клетки протоков клетки желчного пузыря и клетки кишечника также были использованы для генерации инсулин-продуцирующих клеток, но эти клетки не давали долговременные стабильные трансплантаты, указывая тем самым на неполноту изменения клеточной сульбы или на нестабильность эпигенетического состояния^121-124. С этой точки зрения основным препятствием в переносе подхода по репрограммированию в клинику является разработка реальных методов эффективной продукции β-подобных клеток человека, которые могли бы развиваться в стабильные и функциональные трансплантаты. Помимо подхода репрограммирования in vitro репрограммирование in vivo у пациентов для целенаправленное внесения панкреатических α-клеток, ацинарных клеток или эпителиальных клеток ЖКТ также может быть осуществимо. Проблемой является оптимизация in vivo протоколов репрограммирования для терапевтического использования у человека.

Проведено несколько исследовательских клинических ксенотрансплантаций с островками свиней^125-127. Однако, серьезные иммунные отторжения ксенографов иммунной системой человека и присутствие большого количества свиных ретровирусов, которые могут передаваться др. виду, вызывают серьезные затруднения. Недавние успехи в генетическом инженеринге привели к пересмотру возможности использования органов, выращенных у свиней. Используя технологию CRISPR-Cas9 пул из 62 известных ретровирусов свиней был делетирован из клеток кожи свиньи^128,129, которые в принципе теперь могут использоваться для получения свиных iPS клеток и затем генетически 'очищенные' свиные островку могут использоваться в качестве доноров. В будущем клиническое использование островков свиней будет зависеть от успешности технологии энкапсуляции (encapsulation), чтобы защищать клетки от иммунных реакций отторжения.

Успехи в технологии стволовых клеток и идентификации главных регуляторов формирования органов поощрили усилия по использованию животных моделей для выращивания органов человека^130-132. Напр., генетическая делеция PDX1 у крыс приводит к специфической потере всей поджелудочной железы из-за неспособности создавать эмбриональную поджелудочную железу. Инъекции эмбриональных стволовых клеток мыши в бластоцисты Pdx1-/- крыс давали химерных мышь-крыса животных, у которые все органы состояли из смеси мышиных и крысиных клеток за исключением поджелудочной железы, котороая происходила из клеток мышей. Т.о., поджелудочная железа мыши росла в теле крысы. Мышиные островки от этих крыс могут быть собраны и трансплантированы диабетическим мышам для лечения у них диабета¹³². Этот эксперимент по проверке концепции между двумя разными удаленными видами грызунов посеяли надежду, что в будущем можно будет выращивать органы человека у животных. Предварительные исследования подтвердили, что стандартные hES не могут вносить существенный вклад в химеры животных¹³³. Можно предвидеть разработку новых методов по снижению несовместимости между видами и подходы по минимизации или устранению неразборчивого вклада клеток человека в химерных животных.

Панкреатические β-клетки становятся нефункциональными при разных стессовых состояниях, таких как продолжительная гипергликемия и гиперлипидемия (T2D), воспаление поджелудочной железы из-за хронического панкреатита или рака поджелудочной железы (type 3c diabetes), или воспаления, вызванной аутоиммунной реакцией (T1D). Тяжелые страдания могут приводить к дегрануляции β-клеток и подавлению генов β-клеток. Недавние исследования подтвердили, что потеря свойств β-клеток может представлять собой дедифференцировку, характеризующуюся активацией генов, которые обычно экспрессируются в предшественниках эмбриональных островков (такие как Neurog3)¹³⁴. Неясно, действительно ли дедифференцировка является обычной характеристикой дисфункциональных β-клеток и действительно ли процесс дедифференцировки, если он происходит и у людей, может быть обращен. Известно, что нефункциональные β-клетки могут восстанавливаться у пациентов с T2D при соотв. ведении, определенное диете, упражнениях или интенсивной инсулиновой терапии. Если фармакологические средства могут быть найдены для 'redifferentiate' дифференцированых β-клеток, то это предоставит новый терапевтический подход для диабета и может рассматриваться как определенная форма регенеративной терапии без использования создания новых клеток per se¹³⁵. Такая терапия может оказаться наиболее подходящей для T2D, но может быть использована и для ранних стадий Т1D.

Разработка клеточных продуктов для лечения T1D сталкивается с уникальной проблемой аутоиммунитета^59,136. Чтобы защитить новые β-клетки необходимо использовать иммунодепрессанты, стандартное лечение для пациентов с T1D, которые получают островки от трупов. Однако, многие из этих лекарств, как известно, токсичны для β-клеток, помимо снижения иммунной способности пациента. Альтернативный способ защиты трансплантированных β-клеток - это энкапсуляция с помощью искусственных материалов. Энкапсуляция физически отделяет β-клетки от иммунных клеток, но она отделяет также β-клетки от кровеносных сосудов, нарушая тем самым кинетику доставки глюкозы, кислорода и питательных веществ и и тем самым снижая жизнеспособность и функцию энкапсулированных клеток. Новые материалы для энкапсуляции разрабатываются^137-140. Альтернативный способ защиты β-клеток у пациентов с T1D является модуляция иммунной системы. Разные режимы иммунотерапии ослабляют и даже полностью устраняют аутоиммунные атаки у non-obese diabetic (NOD) модельных мышей^141-143. К сожалению, при клинических испытаниях эти агенты не демонстрируют существенных преимуществ у пациентов.

Современная клеточная терапия T1D требует использования устройств для энкапсуляции или иммуносупрессирующих агентов с их недостатками и рисками. Было бы идеальным найти способы продукции островков, которые естественным образом противостоят аутоиммунитету. Важный намек получен в исследованиях пациентов с давним T1D (such as the Joslin Medalist study), которые сделали неожиданную находку, что значительное количество таких пациентов обнаруживают заметную продукцию инсулина с сохранением чувствительности к глюкозе, указывая, что некоторые β-клетки могут ускользать от действия аутоиммунитета и продолжают функционировать^144,145. Др. возможность заключается в том, что новые β-клетки могут постоянно продуцироваться у некоторых пациентов. Аутоиммунная атака внутри самой поджелудочной железы также не униформна. Скорее некоторые островки или даже целые доли поджелудочной железы избегают иммунной деструкции, поскольку окружены дольками, истощенными по β=клеткам⁶⁰. Эти данные указывают на то, что β-клетки человека могут быть гетерогенными и что субпопуляция β-клеток может противостоять аутоиммуннным атакам. Эти клинические наблюдения согласуются с накоплением доказательств, что мышиные и человеческие β-клетки в нормальных островках гетерогенны по своим молекулярным сигнатурам или потенциалу пролиферации^146-148. Субнабор β-клеток, как полагают, служит в качестве 'hubs' для инициации пульсирующего высвобождения инсулина¹⁴⁹. Пока неясно, действительно ли β-клетки, обнаруживаемые у пациентов с T1D создаются заново в ответ на аутоиммунитет или они по некоторым причинам резистентны к иммунной элиминации. Концентрация исследований на этих β-клетках в выборках у людей и более глубокое понимание гетерогенности β-клеток человека может в конечном счете привести к молекулярным мишеням, которые позволяют продуцировать функциональные инсулин-секретирующие клетки, резистентные к аутоиммунитету. β-клетки, происходящие из репрограммированных α-клеток, как было установлено, резистентны к аутоиммунитету в исследованиях на мышах, это составляет др. потенциальный путь для изучения и возможно продукции резистентных к аутоиммунитету β-клеток1²⁰.