Посещений:
тРНК



Структура и функции

The emerging complexity of the tRNA world: mammalian tRNAs beyond protein synthesis
• Paul Schimmel
Nature Reviews Molecular Cell Biology volume19, pages45–58 (2018)

  • There is an incalculable number of potential molecular tRNA species, represented by their post-transcriptionally modified forms, by the presence of isoacceptors and isodecoders as well as by the generation of tRNA fragments and the formation of complexes between tRNAs and various proteins.
  • These molecular species are active, both within and outside of translation, as regulators of cellular homeostasis.
  • Modifications of bases are prominent in regulating translation for adaptation to the local environment.
  • Fragmentation repurposes tRNAs to functions outside of translation, including regulation of gene expression and epigenetics.
  • These repurposed functions of tRNAs and their fragments may have arisen early, during the development of the genetic code.
  • The complexity of the tRNA world is so vast that the analysis of how all these functions and molecular species act together will require tools analogous to those used in designing artificial intelligence systems.



    • Рисунки к статье

    Путем декодирования генетического кода посредством реакций аминоацилирования с помощью aminoacyl tRNA synthetases (aaRSs), tRNAs стали центром исследований. aaRSs участвуют в декодировании последовательности поступающей мРНК путем осуществления аминоацилирования tRNA, при этом каждая аминокислота соединяется с соотв. tRNA с помощью зависимой от АТФ реакции. После этого аминоацилированная tRNA залавливается с помощью фактора элонгации трансляции и доставляется на рибосому для синтеза белка. После исчерпывающего анализа, включая множество структурных исследований tRNA и её комплексов, наше понимание биологии tRNA, по-видимому, завершилось.
    Стало сюрпризом, когда новые исследования показали участие tRNAs в др. процессах, а именно, в адаптивном синтезе белка и, более драматически, действовали как не-кодирующие РНК, участвующие во многих регуляторных сетях. Сильным импульстом для этих открытий стали успехи по крупно-масштабному секвенированию РНК с помощью методов (особенно использующих секвенирование РНК (RNA-Seq)) и более сложных компьютерных программ, которые позволили проанализировать миллионы считываемых последовательностей1-3. В то же самое время успехи протеомики позволили считывание белков, это коррелировало с RNA-Seq. Выявлена непредвиденная сложность структуры и функции tRNAs. Существуют несколько доступных обзоров по селективным аспектам биологии tRNA2,4-9.

    Unique structure of tRNAs


    Существует 76 нуклеотидов в канонических и широко распространенных молекулах tRNA10. tRNA складывается в хорошо законсервированную для всех трех царств жизни структуру. Она характеризуется вторичной структурой, сходной с листьями клевера, состоящей от 76 до 93 нуклеотидов, которая завершается CCA тринуклеотидом на 3'-конце, при этом место аминоацилирования находится на 2'- или 3'-OH терминальном аденозине. Четыре плеча листка клевера обозначаются как акцепторный ствол, dihydrouridine (D) stem-loop, anticodon stem-loop and TΨC stem-loop, where Ψ представляет pseudouridine (Fig. 1a, left). После укладки tRNA в её третичную, L-образную структуру, TΨC ствол складывается в акцепторный ствол, чтобы создать миниспираль acceptor-TΨC в 12 пн. Антикодоновые ствол-петля укладываются в D- ствол, чтобы создать в 9-10 пн типа гантели ствол из anticodon-D-loop (Fig. 1a, right).

    Figure 1: The overall structure of tRNAs and the various isoacceptors and isodecoders.

    a,b | Cytoplasmic (part a) and mitochondrial (part b) tRNAs. Colours are used to delineate the relationship of the two major domains of the L-shaped structure (part a, middle, and part b, right) to the sequence elements (shown as filled circles) in the cloverleaf diagram (part a, left) and (part b, left). The dashed lines (middle panel of part a and right panel of part b) indicate places where, starting from the 5'-end, one nucleotide joins to the next in the 2D projection of the 3D structure. A ribbon diagram of the 3D structure of a full tRNA is shown in the right panel of part a. c | The delineation of various isoacceptors and isodecoders for alanine-specific tRNA (tRNAAla). There are 39 distinct human tRNAs for Ala split into three families of isoacceptors with multiple isodecoders in each family. All tRNAAla molecules harbour a guanine at position 3 and a uracil at position 70, which form a bond (G3:U70, yellow bar) that marks them for aminoacylation with alanine. The different colourings of the isodecoders simply illustrate that the same anticodon triplet is associated with different tRNA bodies.

    Два домена соединяются под прямым углом с помощью не-канонического спаривания законсервированных нуклеотидов между TΨC и D-петлями; эти нуклеотиды являются критическими для формирования замысловатой сети из третичных взаимодействий, стабилизирующих финальную L-образную третичную структуру (Fig. 1a, middle). Любой дополнительный нуклеотид помимо 76 обычно приводит к изменению петли, которая начинает выдаваться из задней части L и тем самым избегаются внутренние стерические конфликты. Поразительно, антикодоновый триплет (распознающий кодон матричной мРНК) выделяется в отдельный домен от сайта прикрепления аминокислоты. Эти два локуса наиболее удалены др. от др. в 3D структуре - 76 A (Fig. 1a, right).
    Помимо цитоплазматических tRNA, клетки животных содержат уникальный пул митохондриальных tRNAs. Митохондриальные tRNAs у высших эукариот (metazoans) короче, чем их цитозольные аналоги, при этом митохондриальные tRNAs человека имеют пределы от 59 до 75 нуклеотидов (Fig. 1b). Эти tRNAs имеют меньших размеров регионы ствола и петель и могут даже быть лишены целых доменов. Это отличие указывает на то, что tRNAs обладают очень значительной способностью менять свою форму и что неполные tRNAs и их фрагменты могут выполнять важные клеточные функции (см. ниже). Помимо отклонений в своей структуре, митохондриальные tRNAs богаты также аденином и урацилом, что делает их менее стабильными. Многие болезни человека ассоциируют с мутациями митохондриальных tRNA, которые, как полагают, приводят к изменениям оснований крупных частей, которые и усиливают их ломкость11-13. Мы сосредоточимся на цитоплазматических tRNAs.

    Sources of tRNA complexity


    tRNAs намного многочисленнее РНК. Хотя количество генов для tRNA варьирует от индивида к индивиду по неизвестным причинам14, в chtloytv существует около 500 tRNA генов и tRNA ген-подобных последовательностей, кодируемых геномом человека15,16. Приблизительно половина из них оценивается как экспрессирующиеся гены. Около 300 разных цитоплазматических tRNA молекулярных последовательностей кодируется геномом и ещё 22 кодируются митохондриальной ДНК и они составляют пул митохондриальных tRNA. Имеется, по крайней мере, один тип tRNA для каждой из 20 аминокислот. Как только аминокислота стабильно закрепляется, её положение на растущей полипептидной цепи предопределяется взаимодействиями кодон-антикодон на мРНК. Из-за вырожденности кода существует более одного кодона для большинства аминокислот. Это ведет к возникновению tRNA isoacceptors - tRNA молекул с отличающимися последовательностями, включая последовательность антикодона, но несущих одну и ту же аминокислоту. Т.о., сложность мира tRNA начинается с присутствия множества tRNA-кодирующих генов и вырожденности кода. Это усложняется рядом модификаций оснований в tRNAs, существованием огромного количества взаимодействующих с tRNA партнеров, включая aaRSs, и фрагментациями tRNA.
    Many isoacceptors and isodecoders. У высших эукариот помимо изо-акцепторов (isoacceptors), существуют также изо-декодеры (isodecoders) - tRNAs с одним и тем же антикодоном, но с разными телами. Характерным примером разнообразия цитоплазматических Ala-специфических tRNAs человека, является tRNAAla, представленная на Fig. 1c. Как следствие возможности шаткого спаривания между кодоном и антикодоном (т.е. кодон-антикодон распознавание связано с менее безопасным соединением двух оснований в третьей позиции кодона и первой позиции антикодона, таком как G:U (wobble) против A:U (канонического, Watson-Crick спаривания)), в принципе только две tRNAAlas необходимы для считывания четырех GCX кодонов для Ala (где X означает любое основание), используя антикодоны UGC или GGC (т.к. U или G в первой позиции антикодона могут использовать шаткое (wobble) взаимодействие, чтобы считать третье основание всех 4-х кодонов для аланина). Однако, геном кодирует 46 генов с 39 отличающимися последовательностями tRNAAlas (все 39 имеют G3-U70 пару оснований в акцепторном стволе; эта пара оснований, а не антикодон, маркирует их в отношении зарядки с помощью аланиновой tRNA синтетазы (AlaRS)17. Интересно, что некоторые из этих изо-акцепторов являются также изо-декодерами (Fig. 1c). Принимая во внимание все цитоплазматические tRNAs, приблизительно 270 изо-декодеров ассоциируют с приблизительно 50 изо-акцепторами15,18,19.
    tRNA modifications add vast complexity. Из более 90 описанныъх структур модифицированных нуклеозидов у человека20,21, большинство модификаций РНК было описано для tRNAs. Некоторые модификации широко распространены в большинстве, если не всех tRNAs, такие как dihydrouridine (в D-петле) или pseudouridine (в TΨC петле), но др. ограничены специфическими tRNA или группой из tRNAs. Эти модификации включают метилирование рибозы в позиции 2'-OH, а также метилирование оснований и более сложные изменения, такие как isopentenyl adenosine (где isopentyl группа соединена с адениновым кольцом) (Fig. 2a). В среднем tRNA человека содержат 11-13 модификаций22, но не имет места принцип 'всё или ничего', т.е. они могут варьировать. При анализе некоторых специфических модификаций оснований tRNA в HEK293T клетках человека, уровни модификаций варьируют между 10% и более 80% для специфических оснований, в зависимости от типа модификаций и их расположения23. Модифицированное в противовес не модифицированному состоянию могут иметь разные эффекты на активности, ассоциированные с определенными tRNA. Эти модификации могут регулировать трансляцию, а также активности помимо трансляции.

    Figure 2: The build-up of complexity in the tRNA world. a | Examples of a few common base modifications (green boxes) found in tRNAs. b | Thirteen post-transcriptional sites of base modification in tRNAs that associate with human diseases (green spheres). As the modification at a given site is often partial on a population level, a large statistical distribution of all possible microspecies can be built up based on many different possible combinations of partly modified tRNA species. c | Starting from a single tRNA and progressing to all combinations of the different possible mixtures of tRNA species, an immense complexity of the tRNA world arises, with numbers of possibilities beyond realization in any single cell or organism. tRNAAla, alanine-specific tRNA; PTM, post-transcriptional modification.

    Т.о., в tRNA, любой определенный сайт м. находиться в диапазоне от не модифицированного до почти полностью модифицированного состояния (Fig. 2b). Поскольку модификация является бинарным событием, то потенциально может существовать огромная популяция microspecies. Принимая во внимание только 13 сайтов, где отсутствие модификаций оказалось связанным в болезнями24,25, количество микро-типов (microspecies) для каждой tRNA может быть подсчитано как 213 = 8,192 (Fig. 2b). Модификации т.о., ещё больше усложняют ситуацию помимо изо-акцепторов и изо-декодеров. Принимая во внимание, что производится почти 60 миллионов молекул tRNA на клетку млекопитающих26, то это д. быть огромный набор микро-типов, увеличенных внутри общей популяции многократно. Однако, огромный набор микро-типов, происходящих от одиночной специфичной для аминокислоты tRNA повторяется для каждой из tRNA, так что слой за слоем надстраивается одна и та же сложность.
    Учитывая все возможные комбинации статистических распределений модифицированных типов среди всех tRNAs, результаты приводят к неисчислимому количеству гипотетических возможностей, которые не могут быть выполнены в одиночной клетке или даже во всем организме (Fig. 2c). Напр., если имеются 213 микро-типов модифицированных форм одиночной tRNA, тогда число комбинаций модифицированных форм для всех tRNAs будет 213 х 213 х 213..., которые легко превзойдут 10100.
    tRNA-interacting proteins add further functional complexity. Давно исследуемой канонической ролью tRNAs является обычный синтез белка, когда они впервые взаимодействуют с соотв. aaRSs , которые соединяют каждую tRNA с её соотв. аминокислотой27,28. Синтетазы являются довольно многочисленными белками в клетках млекопитающих и любой момент времени большинство tRNAs окажется связанным или с tRNA синтетазой или в комплексах инициации трансляции и с факторами элонгации и рибосомами (Fig. 3a). Кроме того, транс-действующие редактирующие факторы у людей, такие как AlaXp29 или ProXp-Ala30, могут формировать комплексы с неправильно загруженной tRNAs, чтобы давать избыток исправлений ошибок в случаях, когда исправление ошибок с помощью синтетазы неполное.



    Figure 3: Complexes of tRNAs with binding partners. a | Complexes of tRNAs with components of the translation apparatus. b | Depiction of the major domains of tRNA synthetases and how a large array of human tRNA synthetase splice variants carves out individual domains that can associate with the outside corner (left) or anticodon (right) of the tRNA structure. Grey indicates the conserved core catalytic and editing domains of tRNA synthetases that are responsible for accurate aminoacylation. tRNA synthetases devoid of part or all of this region are called catalytic nulls and have diverse biological functions (see text). Additional non-catalytic appended domains in humans are shown in yellow. c | Fragmentation of tRNA unmasks sequence elements that are normally covered in the folded structure, providing sites for binding regulatory proteins. Cleavage can occur proximal to the anticodon, generating 5? and 3? translation interfering tRNAs (tiRNAs) or can take place at other positions, generating different, usually shorter species of fragmented tRNAs (tfRNAs). AlaRS, alanine tRNA synthetase; ArgRS, arginine tRNA synthetase; AsnRS, asparagine tRNA synthetase; AspRS, aspartate tRNA synthetase; HisRS, histidine tRNA synthetase; LysRS, lysine tRNA synthetase; SerRS, serine tRNA synthetase; ValRS, valine tRNA synthetase.

    Человеческие aaRSs существенно увеличивают сложность в мире tRNA, особенно из-за их участия на путях независимой от рибосом трансляции per se, такими как ядерная регуляция транскрипции, внеклеточными рецепторами обеспечиваемая передача сигналов, передача сигналов mTOR и рекрутирование партнеров по связыванию для внутриклеточной регуляции доступности мРНК31-37. В соответствии со многими из этих функций имеется большое количество сплайс-вариантов aaRSs человека, которые обладают широким диапазоном новых биологических активностей38. Многие являются каталитически фиктивными (nulls), т.е. вариантами, в которых часть или целиком отсутствуют активные сайты. Однако, многие сохраняют домены, которые взаимодействуют с tRNA (Fig. 3b). Некоторые являются антикодон-связывающими доменами39,40. Др. являются pan-specific tRNA-связывающими доменами, которые закрепляются на наружном углу колена L-образной структуры, используя скорее структурные, чем сиквенс-специфические взаимодействия и, по-видимому, действуют как tRNA шапероны, чтобы стабилизировать L-образную укладку (они были описаны как функциональные гомологи Trbp111, белка с шаперон-подобной ативностью, который первоначально был обнаружен у Aquifex aeolicus)41-43. Соединение tRNAs с такими aaRS сплайс-вариантами, как и с др. партнерами по связыванию (напр., компонентами ретровирусных капсид (see below)), ещё сильнее расширяет возможное разнообразие tRNAs.
    Fragmentation expands the population of tRNA microspecies. Существование естественных фрагментов tRNA открывает новую дверь в мир tRNA. Первоначально не подозревалось участие angiogenin в биологии tRNA, эта нуклеаза была известна свой ангиогенной активностью44-46. Однако, в конце концов было установлено, что (также как и др. нуклеазы) играют роль в биологии tRNA (see Supplementary information S1 (box)).
    Нуклеолитическое расщепление tRNA в антикодоне генерирует 5' и 3' половины, которые рассматриваются как translation interfering tRNAs (tiRNAs). Эта роль была описана для этих фрагментов в ранних исследованиях, когда наблюдалось, что 5' половинки ингибируют трансляцию в контексте стрессовой реакции и были связаны с образованием стрессовых гранул. Др. фрагменты, известные как фрагментированные tRNAs (tfRNAs) возникают в результате различных расщеплений и могут быть меньше, чем tiRNAs (Fig. 3c). Эти фрагменты обладают тем же самым большим статистическим распределением модификаций, что и молекулы полной длины, это усиливает сложность фрагментов tRNA2. Более того, по крайней мере, в одном исследовании сообщалось, что angiogenin-расщепленные tRNA 3' половинки сохраняют aminoacyl часть прикрепленной аминокислоты, это может рассматриваться как еще один тип модификации47. Наконец, специфические фрагменты являются мишенями для связывания регуляторных факторов, возможно части аппарата трансляции (Fig. 3c, and see below). Т.о., tRNA фрагментация - путем генерации широкого круга разнообразия микро-типов tRNA - умножает сложность мира tRNA.
    Impact of tRNA sequence variability. Очевидной причиной существования tRNA изо-акцепторов является приспособляемость к вырожденности генетического кода. Помимо приведения в действие изо-акцепторов и изо-декодеров, изменчивость между генами в использовании кодонов, открывает путь к модуляции относительной эффективности трансляции среди различных мРНК48. Хотя это разумное объяснение всё ещё исследуется и вызывает определенные споры49, недавняя работа ясно показала обеспечиваемую трансляцией роль изо-акцепторов и изо-декодеров в модуляции различных клеточных функций.

    Isoacceptor-dependent tumour metastasis


    Два изо-акцептора - tRNAGlu/UUC и tRNAArg/CCG - активируются в опухоли молочных желез сочетанно с возникновением метастазов50. Как следствие транскрипты, обладающие комплементарными кодонами, борются более эффективно за tRNAs для трансляции рибосомами и тем самым сдвигают протеом с более сбалансированного гомеостатического состояния в направлении экспрессии генов для белков, которые способствуют метастатическому пути (Fig. 4a). Помимо более эффективной трансляции путем усиления оккупации этими мРНК рибосом, повышается стабильность мРНК, способствующих опухолям (т.е. эффективность трансляции связана с распадом мРНК51,52). В дальнейшей работе установлена связь между tRNAGlu/UUC и метастазированием за счет активации RNA exosome компонента EXOSC2 и guanine nucleotide exchange factor GRIPAP1. Т.о., тщательное исследование роли двух tRNAs привело к неожиданному открытию двух факторов, ранее не сцепленных с метастатическим путем. Это показывает, что активация специфических tRNAs может изменять физиологию и поведение клеток и подчеркивает, что метаболизм клетки в целом и фенотип могут быть сбалансированы в зависимой от изо-акцептора точке выгрузки (tipping point).



    Figure 4: Examples of the many regulatory roles of tRNAs.

    a | Upregulation of specific isoacceptors enhances the metastatic potential of tumour cells. In metastasizing breast cancer cells, two tRNAs are specifically upregulated: tRNAGlu/UUC and tRNAArg/CCG. Many genes involved in metastasis are enriched in codons recognized by these tRNAs, and as a consequence, their translation is promoted. In the mRNA sequence, 'R' indicates adenine or guanine. b | A tRNAArg/UCU isodecoder expressed specifically in the central nervous system (CNS) regulates neuronal homeostasis. In the absence of tRNAArg/UCU, ribosomes will stall at AGA codons. This stalling can be rescued by GTP-binding protein 2 (GTPBP2), a factor that rescues translational pauses. In the absence of both tRNAArg/UCU and GTPBP2, severe ribosome stalling occurs, which leads to the activation of integrated stress response driven by activating transcription factor 4 (ATF4). This leads to neuronal cell death and neurodegeneration. c | Homeostatic balancing of translation through the A58 methylation-demethylation cycle. Methylation of tRNAs (green hexagon) at position A58 (within the T?C stem-loop) promotes translation. Demethylation by nucleic acid dioxygenase ALKBH1 (ALKBH1) leads to a decrease in translation levels. d | The role of the cmo5U modification in translation efficiency and survival of Mycobacterium bovis cells. 5-oxyacetyl uracil (cmo5U) modification of tRNAThr/UGU enhances wobble base pairing between G and U in the codon-anticodon pair, leading to efficient recognition of ACG codons. cmo5U modification is increased in the condition of hypoxia (which is present in granulomas formed in response to the pathogen) owing to increased expression of CmoB. At the same time, in early hypoxia, the levels of tRNAThr/GGU and tRNAThr/CGU are reduced. Consequently, translation of mRNAs harbouring ACG codons is promoted, whereas the expression of mRNAs with ACC and ACU codons is dampened. Importantly, mRNAs related to pathogen persistence (which form the bacterial Dos regulon) are enriched in ACG codons over ACC codons. This strongly promotes their expression and bacterial survival.

    A specific isodecoder regulates neuronal homeostasis. В контекста биологии нейронов специфический изо-декодер - одна из пяти AGA-считывающих tRNAArg/UCU молекул (четыре остальные члена этого семейства tRNAArg/UCU изо-декодеров экспрессируются повсеместно) - как было установлено, интимно ассоциирует с поддержанием клеточного гомеостаза и предупреждением клеточной гибели. Этот изо-декодер стал первым примером ткане-специфической (ЦНС) экспрессии определенного типа tRNA у позвоночных53. Это было установлено у мутантных мышей, которые были дефектны по этому специфическому изо-декодеру и параллельно обладали мутацией в GTP-binding protein 2 (GTPBP2), в белке, который запускал вновь остановившиеся рибосомы. У этих мышей обнаружены дефекты трансляции и существенная остановка рибосом на AGA кодонах и это было сильно скоррелировано с обширной нейродегенерацией, которая могла быть устранена с помощью экспрессии нейрон-специфичного tRNAArg/UCU изо-декодера (Fig. 4b). Последующие работы показали, что в инициальной временно реакции по предупреждению нейродегенерации, остановка tRNAArg/UCU сначала сопровождалась активацией управляемой с помощью activating transcription factor 4 (ATF4) интегрированной стрессовой реакцией; активность ATF4 способствовала фосфорилированию субъединицы 1 eukaryotic translation initiation factor 2 (eIF2α) с помощью GCN2 киназы54. Это снова иллюстрирует, как клеточный гомеостаз балансируется в tipping point, который очень чувствителен к уровням специфических типов tRNA.

    Regulatory role of base modifications


    Генетика человека предоставляет прямой путь обнаружения биологической роли модификаций оснований tRNA. Более десятка болезней человека сцеплены с мутациями, затрагивающими энзимы модификации tRNA, указывая на важную роль модификаций оснований в биологии tRNA8,24,25,55 (see also Supplementary information S2 (box)).
    Homeostatic balancing of tRNA function by methylation. Энзимы, которые катализируют реакции модификаций, обладают потенциалом быть сбалансированными с помощью дубликатов, которые катализируют устранение модификации ying-yang способом. Недавно исследовали такую ying-yang балансировку метилирования tRNA56. Nucleic acid dioxygenase ALKBH1 (ALKBH1) стирает (с помощью non-haem iron-dependent оксидативного расщепления) N1-methyl модификацию аденина в позиции 58 (A58) во многих tRNAs (Fig. 2a). Пока, ALKBH1 является единственным 'стирателем' метилирования tRNA, который тщательно охарактеризован. A58 расположен в TΨC-петле на наружном углу L-образной третичной структуры tRNA (Fig. 4c). Как и ожидалось, избыточная экспрессия ALKBH1 приводит к снижению уровня метилирования A58, тогда как истощение ALKBH1 увеличивает его. Очевидно, однако, что в популяции tRNAs, эта модификация всегда частична- т.е., полностью модифицированное или не модифицированное состояния не достижимы. Т.о., частично модифицированные типы могут быть прирожденными гомеостатическими механизмами в клетках и могут генерировать огромную популяцию микро-типов.
    ALKBH1, как было установлено, является репрессоров трансляции (Fig. 4c). Репрессия происходит на уровне инициации трансляции и отдельно на уровне элонгации. Эти эффекты имеют физиологические последствия; напр., устранение глюкозы вызывает усиление экспрессии ALKBH1, это приводит к глобальному снижению инициации трансляции. Т.о., модификация цикла метилирования- деметилирования на A58 чувствительна и физиологически связана с ying-yang регуляторным узлом трансляции в структуре tRNA и действует посредством механизмов, отличающихся от модификаций, которые затрагивают tRNA-обеспечиваемое декодирование кодона в мРНК на рибосоме для синтеза белка.
    Base modifications enable translation to adapt to change. Модификации, возникающие в петле антикодона, как известно, влияют на считывание кодона57,58. Однако, способ, с помощью которого клеточное окружение влияет на эти модификации в ответ на стрессы или др. факторы, неизвестен5. Технические успехи, позволяющие анализировать модификации оснований при сборке tRNAs и способность точно определять их постоянные изменения, как модификации оснований tRNA описаны и изучены59-61 и проливают новый свет на роль этих модификаций и их регуляцию.
    Недавний пример изучения популяции модифицированных нуклеотидов в tRNAs у Mycobacterium bovis - внутриклеточного патогена, который приспосабливает свою трансляцию к внутриклеточным стрессам62. M. bovis обнаруживает одно и то же фенотипическое проявление, что и туберкулезные грануломы у человека, в которых воспалительные клетки и сопровождающее гипоксическое состояние предназначены убивать патоген63,64. Но несмотря на эффект гипоксии, M. bovis, подобно M. tuberculosis, персистируют в не-репликативном состоянии и могут быть возвращены у жизни. Глапвным регулятором гомеостаза микобактерий является DosR, киназой активируемый транскрипционный фактор, контролирующий экспрессию 48-gene Dos regulon62,65-67. Гены в этом regulon обогащены специфическими кодонами, считывание которых чувствительно к модификациям, таким как 5-oxyacetyl uracil (cmo5U) (Fig. 2a). В условиях гипоксии происходят изменения в модификациях оснований бактериальных tRNAs - при этом cmo5U увеличивается до 350% - и предсказуемо персистенция бактерий и их реанимирование62. Важно, что ACG считывается с помощью G:U wobble-считывания tRNAThr/UGU, это зависит от cmo5U модификации, и т.о. распознавание ACG с помощью этой tRNA д. способствовать увеличению cmo5U. Кроме того, установлено, что во время ранней гипоксии количества двух др. tRNAThr изо-акцепторов - tRNAThr/CGU и tRNAThr/GGU - снижается по мере снижения трансляции белков с генов, обогащенных для этих соотв. кодонов изо-акцепторов, включая 'оптимальный' ACC кодон (Fig. 4d). Эти эффекты коррелируют с высокой склонностью к ACG в противовес ACC кодонам в 48 genes of the Dos regulon, которые способствуют персистенции M. bovis62. Эта работа показывает, как реакция на одиночную модификацию оказывается действенной в осуществлении адаптивной трансляции для выживания клеток.
    Др. форма адаптивной трансляции также была обнаружена при стрессовых сигналах и могла вызывать mis-aminoacylation, так что аминокислота, отличающаяся от соответствующей для этой tRNA, вставлялась в белки (Box 1).

    Box 1: Mischarging tRNAs for adaptive translation

    In most instances, a single gene encodes each cytoplasmic and each mitochondrial aminoacyl tRNA synthetase (aaRS). The aaRSs attach their cognate amino acids in a two-step reaction: amino acid activation with ATP to form an aminoacyl adenylate (AA-AMP) and pyrophosphate (PPi) (1), and subsequent reaction with the 2?- or 3?-OH of the 3?-end of the matching tRNA to form an aminoacyl ester (AA-tRNA), accompanied by the release of AMP and free aaRS (2).

    AA + ATP + aaRS > aaRS (AA-AMP) + PPi (1)
    aaRS(AA-AMP) + tRNA > AA -tRNA + AMP + aaRS (2)
    Typically, accuracy of aminoacylation (consistent attachment of the correct amino acid matched with the anticodon of the tRNA) is critical for cell and organism survival. For example, a small amount of misacylation of Ser onto alanine-specific tRNA (tRNAAla) results in neurodegeneration in mice133. To limit these errors, aaRSs developed editing sites that remove a mischarged amino acid from its tRNA partner.
    However, a degree of physiological amino acid misincorporation is important for cell adaption to stress or other signals. The two main mechanisms responsible for this misincorporation include codon ambiguity (for example, a codon normally assigned to leucine is reassigned to leucine and serine, as described in Candida albicans134) and loss of editing activity of the aaRS (as described in Mycoplasma spp.135). Specific adaptive responses resulting from amino acid misincorporation have been documented in microorganisms136,137,138. In mammalian and other eukaryotic cells, natural mistranslation by methionyl-tRNA synthetase (MetRS) is a response to oxidative stress, resulting in methionine attachment to non-methionine tRNAs to boost methionine incorporation into cellular proteins for temporal protection from stress-induced oxidative damage139-141.
    Another mechanism, the biological relevance of which is under investigation, exploits subtle features of tRNA recognition. Recognition of tRNAAla by alanine tRNA synthetases (AlaRSs) across evolution is critically dependent on the presence of a G3:U70 base pair in the tRNA. However, in mammalian cells, AlaRS can naturally mischarge cysteine-specific tRNA (tRNACys) with alanine. Interestingly, tRNACys has a G4:U69 base pair. While bacterial AlaRS cannot acylate a G4:U69-containing tRNA, the capacity for forming Ala-tRNACys by the human protein is due to a mutual adaptation of AlaRS to the G4:U69 bp of tRNACys. The human enzyme has a key sequence element not found in bacterial AlaRSs, which enables mischarging142.




    Repurposing tRNAs by fragmentation


    Фрагментация tRNAs освобождает их от обычного аминоацилирования и синтеза белка и мобилизует их на выполнение новых функций68. Среди др. эффектов фрагментация приводит к экспозиции сайтов связывания белка, которые были заключены внутри упакованной tRNA, тем самым делая возможными новые взаимодействия.
    Stress-induced capture of YBX1 and translation inhibition by tiRNAs. Как отмечалось ранее, поскольку генерируемые с помощью angiogenin фрагменты tRNA вызывают образование срессовых гранул и подавляют инициацию трансляции, поэтому они были обозначены как tiRNAs. В одном из ранних исследований tiRNAs, продуцируемые angiogenin 5' фрагменты tRNACys и tRNAAla были идентифицированы как фомы, участвующие в этих процессах69. В условиях стрессов (таких как воздействие реактивных видов кислорода или УФЛ), домен холодового шока в Y-box-binding protein 1 (YBX1), соединяется с этими 5'-tiRNACys и tiRNAAla фрагментами посредством oligo-G мотива, который формирует G-quadruplex. Это облегчает сборку ribonucleoprotein (RNP) стрессовых гранул, которые секвестрируют мРНК и смещают и/или блокируют факторы инициации у эукариот eIF4G и eIF4A из комплекса инициации трансляции. В отсутствие этих факторов инициации в комплексе пре-инициации, capped и uncapped мРНК не могут соединяться с аппаратом пре-инициации70,71. Конечным результатом является подавление трансляции, что способствует консервации клетками энергии (Fig. 5a). С момента этого открытия, tRNA фрагменты оказались участниками сигнальных путей, не прямо связанных с синтезом белка (see below).



    Figure 5: tRNA fragments in the regulation of cell biology.

    a | Cellular stress promotes angiogenin-mediated cleavage of tRNAs, which generates translation interfering tRNA (tiRNA) halves. 5'-tiRNAs, in particular fragments of alanine-specific tRNA (tRNAAla) and cysteine-specific tRNA (tRNACys), fold to form G-quadruplexes, which interact with Y-box-binding protein 1 (YBX1). This leads to the formation of ribonucleoprotein-based stress granules, which sequester mRNAs and translation factors, leading to global inhibition of translation and thereby promoting cell energy conservation and cell quiescence in the event of stress. b | In ductal carcinoma, YBX1 binds to transcripts associated with metastatic potential and protects them from degradation. tRNA fragmentation leads to the sequestration of YBX1 as a result of interactions with tRNA fragments. Consequently, pro-metastatic transcripts are degraded. Thus, tRNA fragmentation may have anti-metastatic potential. c | In hormone-sensitive cancers (such as oestrogen receptor (ER)- and androgen receptor (AR)-positive cancers), high levels of aminoacylated 5? tiRNAs are observed (known as sex-hormone-derived tiRNAs or SHOT RNAs). 5?-SHOT RNAs promote cancer cell proliferation through an unknown mechanism. d | The dichotomous role of angiogenin in translation during haematopoiesis. In haematopoietic stem cells (HSCs), angiogenin is targeted to stress granules, where it is involved in the generation of tiRNAs. High levels of tiRNAs block translation, promoting HSC quiescence (see part a). In myeloid progenitors, angiogenin is targeted to the nucleus, where it promotes rRNA biogenesis, thereby favouring proliferation. tRNA fragments may also play a role favouring proliferation. e | In sperm, high levels of tRNA fragments - in particular, a 5'-fragment of tRNAGly/CCC - are observed. These fragments inhibit expression of genes under the control of retrotransposons and have been linked to epigenetic inheritance of metabolic traits by the progeny, which is regulated by paternal diet. As these fragments can harbour a large variety of base modifications, it is possible that their functions are modulated by the environment through these modifications. f | Modification of tRNAs by 5-methylcytosine (green hexagons) in the variable loop, which is instigated by the methyltransferase NSUN2, inhibits angiogenin-mediated tRNA fragmentation. NSUN2 depletion stimulates tRNA fragmentation and tiRNA generation. These tiRNAs inhibit translation and restrict tumorigenesis by inhibiting proliferation and metastatic potential (compare parts a, b and d). Accordingly, in various cancers, NSUN2 is overexpressed. Nevertheless, NSUN2 ablation in the context of cancer will promote the formation and maintenance of tumour-initiating 'stem cells' because some transcripts escape repression.

    Many stresses induce tRNA fragmentation events. Фрагменты многочисленны в сыворотке позвоночных от рыб до человека, при этом некоторые фрагменты tRNA постоянно присутствуют в больших концентрациях, чем др. и законсервированы у позвоночных72. Так, уровни циркулирующих фрагментов tRNA чувствительны к различным состояниям, включая острое воспаление, старение, ограничение калорий, острая почечная болезнь и тканевые повреждения и поэтому может использоваться в качестве не-инвазивного маркера72-74.
    Do tRNA fragments serve defined functions upon exposure to these different stresses? В специфическом примере было показано, что в контексте апоптоза, индуцированного гиперосмотическим стрессом в эмбриональных фибробластах мышей, половинки tRNA отлавливают cytochrome c, который высвобождается митохондриями во время образования apoptosome75. Эти генерируемые с помощью angiogenin фрагменты tRNA непосредственно соединяются с cytochrome c, формируя RNP комплексы и тем самым секвестрируя cytochrome c и предупреждая его функцию в инициации апоптоза. Это ассоциирует с выживанием клеток после гиперосмотического стресса (ранее было показано, что интактные tRNAs также соединяются с cytochrome c и блокируют апоптоз76). Т.о., фрагменты tRNA могут быть нацелены на специфические белковые мишени во время стресса, модулируя клеточные реакции.
    Role of tRNA fragments in tumorigenesis. Продукция фрагментов tRNA, как было установлено, участвует в регуляции туморогенеза. В одном примере описана прямая деструкция про-онкогенных транскриптов, вызываемая фрагментацией tRNA77. Ybx1 является важным геном у мышей78 и помимо его участия в формировании стрессовых гранул, YBX1 соединяется с и стабилизирует многие РНК мишени (тщательный анализ выявил огромный YBX1-зависимый regulon, представленный 4000 РНК, при этом большинство мишеней соединяется своими 3'-нетранслируемыми регионами или экзонами и он перекрывает множество разных клеточных путей, ассоциированных с клеточным циклом, катаболизмом глюкозы и др. путями77). Важно, что YBX1 избыточно экспрессируется во многих раковых опухолях человека79-81, где он стабилизирует транскрипты, способствующие опухолям. YBX1, как было установлено, соединяется с 3'-нетранслируемыми регионами про-онкогенных транскриптов, ассоциированных с клеточными линиями MD Anderson (MDA) metastatic invasive ductal carcinoma и защищает эти транскрипты, управляющие метастазированием. Однако, эта защита исчезает при гипоксии, когда YBX1 залавливается 5' tRNA фрагментами (генерируемыми с помощью неизвестных нуклеаз) и это мешает стабилизации транскрипов, способствующих опухолям77 (Fig. 5b).
    В качестве др. примера, исследование чувствительных к гормонам раковых опухолей подтвердило, что аминоацилирование tRNA является сигналом для их фрагментации с помощью angiogenin в tiRNAs. В этом исследовании активированные aminoacylated tRNA фрагменты специфически коррелировали с развитием опухолей47 (Fig. 5c). Возможно, что высокий уровень аминоацилирования связан с повышенными потребностями в синтезе белка, ассоциированных с характерным быстрым ростом опухолевых клеток. Кроме того, др. исследование эмбриональных фибробластов мышей в условиях стресса обнаруживали положительные корреляции скорости белкового синтеза и вызываемого angiogenin расщепления tRNA82. Как aminoacylated фрагменты tRNA способствуют туморогенезу, неизвестно. В др. исследовании подавление специфических происходящих из tRNA, малых некодирующих РНК (tsRNAs) ассоциировало с хронической лимфоцитарной лейкемией83. Итак, можно заключить, что фрагменты tRNA широко ассоциируют с озлокачествлением гематопоэтических и солидных опухолей и возможно обладают онкогенными или супрессирующими опухоли функциями в зависимости от типа tRNA и опухоли.
    Angiogenin and tRNA fragmentation in the regulation of haematopoiesis. Во время гематопоэза все типы клеток крови продуцируются из первичных гематопоэтических стволовых клеток (HSCs) , которые у взрослых располагаются в костном мозге и лимфатической ткани. Удивительно, секретируемый angiogenin регулирует их развитие, подавляя и отдельно стимулируя синтез белка, в зависимости от типа клеток (т.е., HSCs в противовес миелоидным клеткам предшественникам). В HSCs, angiogenin транслоцируется на стрессовые гранулы, где он участвует в генерации фрагментов tiRNA, которые подавляют синтез белка, чтобы поддерживать состояние клеточного покоя. Однако, в миелоидных предшественниках помимо возможной роли в формировании tiRNAs, angiogenin действует в ядре, способствуя продукции рибосомальной РНК, усиливая тем самым белковый синтез и делая возможной пролиферацию. Т.о., секретируемый angiogenin и фрагменты tRNA генерируют под совместным контролем новый клеточно-неавтономный и дихотомически регулируемый синтез белка, в зависимости от клеточного окружения84 (Fig. 5d).
    tRNA fragmentation regulates epigenetic inheritance. Ранние работы по эпигенетическому наследованию признаков показали. что отцовская родительская диета может влиять на метаболизм потомства и что метаболизмом регулируемые эпигенетические изменения в спермиях влияют на регуляцию метаболизма потомства85,86. Интересно, что растут доказательства, что эпигенетические модификации ДНК сами по себе не могут объяснить вклад самцов в эпигенетическое наследование. Напр., паттерны метилирования ДНК в спермиях не коррелируют с управляемым спермиями, связанным с диетой эпигенетическим наследованием87. К удивлению данные показали. что трансмиссия приобретенного самцового фенотипа может быть воспроизведена с помощью инъекций происходящих из спермиев фрагментов РНК в оплодотворенные ооциты дикого типа88. Эта работа прояснила с помощью прямых функциональных наблюдений, что РНК участвует в эпигенетическом наследовании89. Вместе с последующими находками, что фрагменты tRNA многочисленны в спермиях90, привели к исследованиям, которые подтвердили важность фрагментов tRNA для эпигенетического наследования91,92.
    В одном исследовании наследование метаболического фенотипа, регулируемое диетой самцов, было продемонстрировано с помощью зиготических инъекций происходящих из спермиев малых РНК91. В др. исследовании, как было установлено, популяция малых РНК увеличивалась во время созревания спермиев в эпидидимусе92. Огромное большинство из этих малых РНК происходило из tRNAs, где 5'-фрагмент tRNAGly/CCC был особенно впечатляющим; однако, разумное объяснение этого выдающегося положения специальной tRNA не было получено. В эмбриональных стволовых клетках и мышиных эмбрионах этот фрагмент репрессирует гены, находящиеся под контролем MERVL ретротранспозона, который, как известно, является регулятором раннего, пре-имплантационного развития93 (Fig. 5e). Поскольку примерно половина генома млекопитающих происходит из ретротранспозонов, то мы увидели потенциал широкой связи фрагментов tRNA с ретротранспозонами-кодируемой информацией и связанной с ней активностью. Эта связь может означать, что эпигенетическая роль фрагментов tRNA значительно больше, чем представлялось. Поскольку фрагменты tRNA спермиев обладают различными модификациями РНК, которые чувствительны к изменениям окружения, то фрагментации представляют собой огромный резервуар микро-типов РНК, которые служат в качестве хранилищ отцовской эпигенетической информации91.
    tRNA fragmentation modulated by base modification in stem and tumour cells. Как было показано выше, модификации оснований являются четкими детерминантами биологии, связанной с фрагментами tRNA и по этой причине их выяснение и характеристика очень важны2,7,8. До сих пор большинство исследований модификаций оснований tRNAs оказывались связанными с подавлением расщепления нуклеазами. Один из примеров модификации tRNAs с помощью 5-methylcytosine (m5C) (Fig. 2a). Отсутствие метилирования m5C (в вариабельной петле) - которая исследовалась с помощью methyltransferase кодируемой Nsun2 - снимает блок модификации m5C на расщепление с помощью angiogenin для продукции tiRNAs, которые ингибируют трансляцию8,94-97. Это происходит благодаря тому, что angiogenin соединяется наиболее крепко с субстратами для tRNA, которые лишены специфической модификации m5C94. Сходным образом, methyltransferase Dnmt2 (известна также как tRNA (cytosine(38)-5(5))-methyltransferase), как было установлено, защищает tRNAs от фрагментации95.
    Эта защитная роль метилирования против фрагментации tRNA имеет физиологическое значение. Напр., делеция NSUN2 ассоциирована с микроцефалией и др. аномалиями головного мозга у мышей и людей. Механистически отсутствие NSUN2, как известно, индуцирует зависимые от angiogenin клеточные стрессы и сенсибилизирует клетки к стрессовым стимулам, возникающим в результате гибели клеток нейронов и истощения нейронов94. В др. исследовании делеция Nsun2 задерживала дифференцировку стволовых клеток волосяных фолликулов у мышей98,99. Напротив, NSUN2 активируется в эпителиальных опухолях и экспрессируется в плоскоклеточной карциноме мыши и человека , при этом высокая экспрессия NSUN2 концентрируется в быстро растущих клетках. У мышиных моделей плоскоклеточной карциномы человека трансляция была высокой в дифференцирующихся детерминированных предшественниках и параллельно активация NSUN2 в опухолевых клетках с высокой трансляцией у этих моделей. Устранение Nsun2 у этих опухолевых моделей приводило к низкой скорости трансляции, как и ожидалось, но это было связано с увеличением популяции клеток в недифференцированном опухоль-инициирующем состоянии (Fig. 5f). Устранение возникающих в результате angiogenin фрагментов tiRNA глобально снижало белковый синтез. Однако, клетки, инициирующие опухоль, сохранялись в условиях низкой трансляции из-за эффектов делеции Nsun2 на синтез белка не полностью, указывая тем самым, что некоторые транскрипты избегают репрессии и могут поддерживать сохранение клеток98.
    Мтак, одиночные модификации оснований могут в большинстве своем влиять на angiogenin-управляемую фрагментацию tRNAs и эти эффекты проникают в сложные, очень специфические регуляторные пути, такие как выбор клетками судеб и пролиферация.

    tRNA complexity and evolution


    Эволюционные схемы развития генетического кода принимали во внимание двух-доменовую общую структуру tRNA и отделение (разделение на домены) трех-нуклеотидного кода (антикодона) от места прикрепления аминокислоты (Fig. 1a). Интересно, что присутствие специфических акцепторных стволовых нуклеотидных детерминантов в миниспиральном домене tRNAs необходимо и достаточно для аминоацилирования с помощью, по крайней мере, половины tRNA synthetases17,100-109. Полученные результаты подтвердили идею примордиального кода110-113, предшественника современного генетического кода, который детерминируется с помощью акцепторных стволовых нуклеотидов, проксимальнее 3'-терминального CCA сайта прикрепления аминокислоты в возникающей молекуле tRNA114.
    3'-концы некоторых РНК вирусов - напр., Qβ бактериовируса, brome мозаичного вируса и turnip yellow мозаичного вируса среди прочих - заканчиваются в мини-спиральной- или tRNA-подобной структуре с 3'-CCA тринуклеотидом115. Эта структура является распознаваемым сигналом для инициации репликации. Кроме того, Mauriceville плазмида из Neurospora crassamitochondria реплицируется посредством промежуточного образования РНК, 3'-конец которого напоминает мини-спираль tRNA. Mauriceville это обратная транскриптаза, которая копирует промежуточные образования РНК в ДНК, как полагают, чтобы стать 'переходным геномом', который связывает эволюцию современных ретровирусов с теломеразной обратной транскриптазой (которая использует внутренний РНК праймер, заканчивающийся CCA) и с самыми ранними реплицирующимися РНК геномами116-118. В самом деле, специфические tRNAs, такие как tRNALys и tRNAPro для репликации HIV вируса лейкемии мышей, соотв. упакованы в вирионы и служат в качестве праймеров (для синтеза ДНК) с помощью обратной транскрипции119,120. Связь tRNA с репликацией геномной РНК и с обратной транскрипцией подтверждает интимные взаимоотношения эволюции аминоацилирования и трансляции РНК и синтеза ДНК.
    Половинки молекулы tRNA или сходные фрагменты, д. появляться рано113. Эти фрагменты могут быть оторваны от реплицирующихся РНК геномов в качестве активных биологических агентов, которые затем были использованы для 'сборки' молекул tRNA. Напр., 5'-половинка tRNA может служить в качестве матрицы для создания комплементарной молекулы, которая (с помощью некоторых преобразований вовлекается в diversification и рекомбинацию) может эволюционировать в полную tRNA109,113 (Fig. 6, left). Многие предшественники tRNA эукариот имеют интронные вставки на 3' стороне триплета антикодона, чтобы в большей или меньшей степени расщеплять tRNA на половинки121. Такие инсерции делят tRNA на половины, где большая часть одной половины комплементарна другой.



    Figure 6: Emergence of tRNA structure from its individual domains.

    In one scheme (upper left), a minihelix with primitive ('second genetic code') specificity determinants for aminoacylation (coloured bars) near the 3?-amino acid acceptor site is transcribed into a complementary anti-minihelix. Hybridization of the two complementary hairpin loops (shown as black dashed lines) possibly stabilized by a corner-binding chaperone-like small protein such as Trbp111, creates an L-shaped structure that recombines into a full tRNA. In this scheme, the anticodon is constructed from the nucleotides of the 'second genetic code'. The coloured dotted lines between the minihelix and anti-minihelix show where transesterification reactions join the two structures into the final cloverleaf, with an additional joining at the 3?-side of the anticodon (fused position). The dashed arrow shows where the proto-anticodon is fused into the anti-minihelix. In the 'split tRNA' model (upper right), the two domains of tRNA originate as separate elements (as seen in the genomes of some Archaea) and are fused together (fused position) to create a full tRNA. In both cases, the individual domains could have served as early signalling molecules independent of their later role in the construction of the full tRNA. Accordingly, in reverse of the recombination and fusion events, cleavage at the single-stranded anticodon of the nascent tRNA generates tRNA half-molecules, which as seen in Fig. 5 are important transducers of different signalling pathways.

    Дальнейшие рассуждения об эволюции tRNAs и их сложности, необычном расщеплении tRNA генов у Archaea особенно интересны122. Ген-кодирующие фрагменты tRNA в разных местах хромосомы синтезируются и соединяются вместе в транс-положении с помощью сплайсинга (Fig. 6, right). Такие слитые последовательности tRNA могут быть интегрированы в геном посредством retrotransposition. Этот и др. примеры вызывающе подтверждают происхождение и ранние функции половинок tRNA, которые интимно соединяются в ходе эволюции самих tRNA. В самом деле, современные tRNAs, как полагают, возникают из половинок tRNA, комбинируясь посредством механизма, обеспечиваемого повторяющимися элементами123.
    Имеет ли подобное возникновение tRNA отношение у тому, как фрагменты tRNA спермиев влияют на ранний эмбриогенез путем целенаправленного воздействия повторяющихся мобильных элементов (see above)? Сходным образом, подобные модификации tRNA, возникают в результате селективного давления на наиболее высоко дифференцированные поверхности и карманы и вызывают крупные отличия каталитического потенциала РНК. Эти активности в конечном итоге возникают в результате использования РНК для создания белков124 и используются в сигнальных путях. Наконец, формируются регуляторные пути, которые необходимы для тонкой регулировки, связанной с экспрессией ткане-специфичных изо-акцепторов и изо-декодеров, которые могут управлять экспансией генов tRNA у высших эукариот.

    Concluding remarks


    The entirely unexpected reach of tRNAs into biological processes outside of translation has, if nothing else, brought out many unanswered questions125. For example, what are the mechanisms that give rise to tiRNAs and tfRNAs that can either suppress or promote tumorigenesis? Why should sex hormone-driven cancers be sensing specific charged tRNAs and targeting them for cleavage by angiogenin? Given the close connection of tRNA synthetases and their splice variants with tRNA biology, will these proteins emerge as central players for transactions with tRNA fragments? The significance of the increasing number of tfRNA-associations in the aetiology of diseases ranging from multiple cancers (beyond what is discussed above) to ischaemia is completely open to further analysis126-128. The recent demonstration of the presence of tfRNAs in extracellular vesicles and their potential for inter-cellular trafficking and communication adds another dimension129.
    In general, the purpose of the vast complexity of tRNA species is an outstanding issue. To understand this overwhelming complexity, the analogies and lessons of modern artificial intelligence systems can be instructive. Perhaps the combinatorial complexity of tRNA modifications and fragments originated as a random evolutionary process in which a large ensemble of possible combinations was stochastically built up and not necessarily sampled, but rather became a reservoir of possibilities for neutral drift as well as positive and negative selection to act upon. This could potentially facilitate cell fitness, even without ever attaining a theoretical 'optimum', which is the final goal of gaming in modern artificial intelligence programmes. Current thinking is that the complex biology of the tRNA world originated in a more simple state, with complexity building up through the process of evolution. In this sense, the artificial intelligence game scenarios differ in that they start out with an established initial complexity.
    To build upon the comparison of the evolution of tRNA complexity, let us take a closer look at a situation when an advanced artificial intelligence system competes in the game of Go (a two-player board game, in which the main aim is to 'conquer' a larger territory of the board than the opponent using equivalent pieces, called stones) with human opponents. For this purpose, artificial intelligence systems obtained winning solutions by means of training algorithms that were reiterated millions of times, using databases of moves made in championship games, as well as by having machines play against themselves130,131. By one estimate, there are as many as 10170 possible moves — a number that the most powerful computer cannot begin to sample130. Yet, the artificial intelligence system repeatedly achieved victory against the most advanced human opponents, and the ways in which these victories occurred are not understood.
    As discussed above, the number of microstates of tRNA ensembles greater than 10100 is, in principle, within reach. While no cell can hold all possibilities at one time, its environment may favour certain possibilities under one condition and others under another. In the game of Go, 'winning solutions' can be obtained in many different ways, some of which might not follow strict logic but might rather be tries or guesses, followed by learning from the result — winning or losing — which enhances the ability to win next time. The result is a form of intuition. This may be the rationale for the complexity of the tRNA world: to have sufficient capacity to acquire many not-unique states that, depending on the condition, will modulate various cellular processes and adapt them to the current needs.
    Winning solutions are those that ensure homeostasis. The theme of achieving balance is reproducibly repeated in the literature reporting on the emerging new biology of tRNAs. Even angiogenin is balanced with its natural inhibitor RNH1 (Ref. 132). This balancing facilitates homeostasis, and disease results when the 'tipping point' of homeostasis is reached. In that connection, tRNA-linked diseases inform us about losing solutions by demonstrating that, despite many potential homeostatic states instigated by the 'tRNA code', there are major tRNA-based regulatory nodes that cannot be bypassed. It is these nodes that were uncovered in the work described above. The continuing efforts to investigate the tRNA world will help us learn more about the principles of life and may show how life as we know it could have evolved from the power of complexity.