Посещений:
УБИКВИТИНИРОВАНИЕ



в норме и при патологии

Ubiquitylation at the crossroads of development and disease
• Michael Rape
Nature Reviews Molecular Cell Biology volume19, pages59–70 (2018)

  • Ubiquitylation is a post-translational modification that enables mechanistically diverse, quantitative and reversible regulation. Through controlling the stability, interactions or activity of important cellular regulators, ubiquitylation is essential for metazoan development.
  • Aberrant ubiquitylation, most frequently caused by mutation or aberrant expression of genes that encode E3 ubiquitin ligases or deubiquitinases, results in a wide range of developmental diseases, cancer or neurodegeneration.
  • Ubiquitin-dependent protein degradation coordinates proliferation of stem cell populations with the initiation of differentiation and cell fate specification.
  • Ubiquitylation of histone proteins, transcription regulators or ribosome biogenesis factors controls gene expression and mRNA translation programmes that are essential for differentiation.
  • Ubiquitin-dependent regulation of membrane proteins is crucial for cellular communication and cell migration during development.
  • Small molecules that target developmental ubiquitylation enzymes have emerged as a new approach to treating diseases, including cancer.


    		•
    Клети нашей нервной системы существенно варьируют в форме и функции. Их размеры находятся в пределах от малого диаметра глиальных клеток до нейронов с аксонами метром в длину, разные типы клеток используются для преобразования несметного числа получаемых головным мозгом импульсов в каждый момент времени. Сходное разнообразие в морфологии и функции обнаруживаются по всему телу от малых подвижных клеток крови до крупных многоядерных мышечных трубок. Соотв., развивающийся эмбрион нуждается в гарантии, что эти более 200 разных типов клеток будут сформированы в должное время в должном месте и сто они аккуратно будут взаимодействовать, чтобы построить органы, иннервировать ткани или доставлять кислород по всему телу.
    Серии событий дифференцировки, поддерживающие развитие многоклеточных организмов нуждаются в ткане-специфической экспрессии генов, синтезе и деградации белков - программа, которая тщательно контролируется сигнальными сетями, использующими главным образом молекулы WNT, Notch, Hedgehog (Hh), семейства ростовых факторов и трансформирующих рост факторов-β. Благодаря различиям в силе этих онтогенетических сигналов или взаимодействию между путями могут предопределяться разные клеточные судьбы, при этом количественная регуляция передачи сигналов является обязательным условием успешной дифференцировки. Среди множества действующих контролирующих связей (circuits) модификации белков с помощью ubiquitin оказались важными игроками в предопределении судеб и функции клеток, а аномалии убиквитинирования (ubiquitylation) часто приводят к врожденным дефектам, детским болезням и раку.
    Путем формирования конъюгатов разных топологий, убиквитинирование может влиять на стабильность, взаимодействия, локализацию или активность тысяч белков, предоставляя тем самым специфические сигналы, которые широко используются у клеточном контроле1.

    The ubiquitylation machinery


    В основе пути убиквитинирования лежит очень консервативный и важный белок убиквитин (ubiquitin). Многоклеточные организмы продуцируют ubiquitin или как слитый с рибосомальными белками (кодируемыми UBA52 и RPS27A) или как polyubiquitin кассеты (кодируемые UBB и UBC)2, из которых deubiquitinases (DUBs) выщепляют мономерные модификаторы (Fig. 1a). Хотя слияния с рибосомами поддерживают продукцию ubiquitin в клетках, не подверженных стрессам, транскрипция генов UBB и UBC быстро увеличивает уровни в затруднительных условиях, таких как тепловой шок3,4. Это позволяет быстро увеличивать доступность ubiquitin, необходимого для развития, т.к. делеция UBB или UBC локусов мешает нейральной или гапатоцитарной дифференцировке и вызывает начинающуюся у взрослых нейродегенерацию5-8. Кроме того, эмбрионы нуждаются в гарантии, что продукция ubiquitin будет осуществляться без ошибок: на молекулярном уровне неправильное считывание гена UBB во время транскрипции дает в результате сдвига рамки считывания мутантный UBB+1 белок, в котором большая часть С-терминального Gly замещается на добавочную последовательность в 20 аминокислот9. UBB+1 не может конъюгировать с субстратами и вместо этого подавляет обеспечиваемую протеосомами деградацию10. Мыши, экспрессирующие UBB+1, обнаруживают дефицит памяти11, а повышение уровни этого варианта убиквитина во время старения может вносить вклад в патологию нейродегенеративных болезней12.

    Figure 1: The ubiquitylation machinery.

    a | Ubiquitin is produced either as a fusion to ribosomal proteins (encoded by the genes RPS27 and UBA52) or as polyubiquitin cassettes (encoded by the genes UBB and UBC). From these fusions, deubiquitinases (DUBs) produce the monomeric modifier, which is then conjugated to substrate proteins. b | Ubiquitin conjugates can differ in structure and function. Monoubiquitylation often alters protein interactions. c | The enzymatic cascade of ubiquitin transfer. E1 enzymes use ATP to generate a high-energy thioester between ubiquitin and an active site Cys in the enzyme. Charged E1 enzymes transfer ubiquitin to one of ?40 E2 ubiquitin-conjugating enzymes, which then cooperate with ?600 E3 ubiquitin ligases to produce a ubiquitylated substrate. E3 ligases can transfer ubiquitin directly from E2 enzymes (RING (really interesting new gene) E3 ligases) or undergo charging of their reactive Cys from which ubiquitin is transferred to the substrate (HECT (homologous to E6AP carboxyl terminus) and RBR (RING-between-RING) E3 ligases). Approximately 100 human DUBs cleave ubiquitin off its target to terminate this signalling event.

    Как только ubiquitin продуцируется, клетка использует его для сборки множественных конъюгатов, которые отличаются по структуре и функции1 (Fig. 1b). В своей простейшей вариации одиночный ubiquitin переносится на субстрат Lys (моноубиквитинирование), который обычно модулирует события связывания белка мишени. Так, наблюдалось, что во время черепно-лицевого развития моноубиквитинирование может оказывать выраженные эффекты на клеточную судьбу, а неправильная его регуляция приводит к тяжелым болезням13-15. Клеточные энзимы также способны соединять молекулы ubiquitin др. с др., используя amino конец (N-terminal methionine; M1) или один из 7 остатков Lys (K) одного из ubiquitin и C конец др. субъединицы. В зависимости от своей топологии, возникающая в результате полимерная ubiquitin цепь принимает разные конформации и может быть распознана уникальными эффекторными белками. Напр., цепочки, сцепленные посредством K11 или K48, или разветвленные K11/K48 цепочки запускают протеосомную деградацию16-18, тогда как цепочки, сцепленные посредством M1 или посредством K63, управляют сборкой сигнальных комплексов или регулируют сортировку белков во время аутофагии и эндоцитоза19-22. Фосфорилирование, фосфорибозилирование, ацетилирование или glutamine deamidation of ubiquitin могут в дальнейшем тонко контролировать исход передачи сигналов после таких модификаций23-28. В этом случае убиквитинирование составляет систему замысловатых коммуникаций, которая богата сигналами и способна контролировать разные функции, необходимые для развития многоклеточных организмов1.
    Перенос ubiquitin на субстраты инициируется с помощью E1 ubiquitin-активирующих энзимов, которые формируют эфирные тиокислотные (thioester) связи между активным сайтом остатка Cys в E1 и C концом ubiquitin29 (Fig. 1c). Эта реакция нуждается в АТФ, чтобы генерировать высокой энергии ubiquitin-АТФ добавки, которые позволяют ubiquitin переноситься на остаток Cys в E1. В клетках человека основная нагрузка по активации ubiquitin падает на UBA1, который кодируется важным геном, оказывающимся мутантным при X-сцепленной детской спинальной мышечной атрофии30-32. Енр гомолог E1 UBA6, активирует ubiquitin ubiquitin-подобный модификатор FAT10 (Refs 33-35). Делеция UBA6 приводит к эмбриональной гибели34, тогда как вызванная условиями потеря в нейронах уменьшает количество дендритных шипов (spines) и приводит к изменениям поведения36. Вследствие его активации с помощью E1, ubiquitin переносится на остаток Cys в одном из ~40 E2 ubiquitin-conjugating энзимов37 (Fig. 1c). Некоторые E2 энзимы являются объектами регулируемой транскрипции или деградации и их аномальные уровни ассоциированы с нарушениями клеточных делений, дефектами развития и раком37.
    Финальная стадия каскада переноса ubiquitin катализируется с помощью E3 лигаз, которые привлекают избирательные мишени и тем самым предопределяют специфичность субстрата для этой модификации (Fig. 1c). Биоинформационный анализ предсказывает, что геном человека кодирует ~600 E3 лигаз, для большинства из них остаются неизвестными ни субстрат, ни функция. Мишеням для передачи сигналов E3 лигаз противостоят ~100 DUBs, которые отщепляют ubiquitin от их мишеней38-40. Разные наборы E3 лигаз и DUBs экспрессируются на определенных стадиях во время развития или в специфических тканях и тем самым контролируют процессы, давно известные процессы, которые важны для спецификации клеточных судеб. Соотв. многие энзимы убиквитинирования важны для развития и тканевого гомеостаза у многоклеточных организмов, а их мутации вызывают болезни в диапазоне от врожденных дефектов до нейродегенерации.

    Control of differentiation timing


    Одной из первых и наиболее важных целей у эмбрионов является генерация клеток предшественников, которые обладают программами спецификации формируемых тканей. В то время как эмбриональные стволовые клетки делятся и быстро умножаются, предшественники взрослых тканей поддерживаются в покоящемся состоянии и запускают программу деления только если они необходимы для тканевого роста или регенерации. Напротив, дифференцирующиеся клетки обычно прекращают делиться. Это демонстрирует, что успешное развития и мощный тканевой гомеостаз нуждаются в тонкой координации клеточной пролиферации и дифференцировки, а убиквитинирование помогает достижению этой цели.
    Ключом к этой роли для убиквитинирования является способность E3 лигаз целенаправленно воздействовать на мишени регуляторы клеточных делений и дифференцировки в одно и то же время (Fig. 2). Напр., APC/C (anaphase-promoting complex; известен также как cyclosome), который был открыт благодаря его способности запускать деградацию анафазных ингибиторов и инициировать сегрегацию сестринских хроматид ао время митозов41,42. Эта митотическая функция APC/C зависит от его ко-активатора CDC20, а делеция Cdc20 приводит к аресту развития на стадии двух клеток43. Однако, во время G1 или в дифференцированных клетках APC/C зависит от разных ко-активаторов, CDC20 homologue 1 (CDH1; кодируемый FZR1), для распознавания субстрата44. Скорее, чем понуждение клеток к следующему клеточному циклу, APC/C совместно с CDH1 (APC/CCDH1; комплексы всех E3 лигаз со своими регуляторами будут обозначаться аналогичным образом) предотвращает накопление киназ, которые управляют вступлением в S фазу и тем самым стабилизируют пост-митотическое состояние, которое типично для дифференцированных клеток45. Соотв. гетерозиготные или кондиционные делеции FZR1 ускоряют начало репликации ДНК и нарушают дифференцировку46,47.

    Figure 2: Coordination of cell proliferation and differentiation.

    a | The APC/C (anaphase-promoting complex; also known as the cyclosome) targets both regulators of cell division and regulators of cell differentiation, enabling it to coordinate both processes. The APC/C in complex with its co-activator CDC20 (APC/CCDC20) promotes sister chromatid segregation during mitosis. When paired with CDC20 homologue 1 (CDH1), the APC/C targets cell cycle regulators, such as the cyclin-dependent kinase subunit cyclin A, as well as developmental factors, such as ID2 or SnoN (also known as Ski-like protein, SKIL), which act as transcription regulators. The APC/C can ubiquitylate hundreds of substrates, and only selected examples have been indicated here. b | By targeting and driving the degradation of cell cycle regulators, such as cyclin A, APC/CCDH1 stabilizes the G1 cell cycle stage characteristic of differentiating cells; at the same time, by ubiquitylating inhibitors of differentiation, such as ID2, APC/CCDH1 controls cell fate specification and thus coordinates cell proliferation and differentiation. FMRP, fragile X mental retardation protein 1.

    В дополнение к определению стадии клеточного цикла, благоприятной для дифференцировки, APC/C предопределяет клеточные судьбы (Fig. 2). В частности, его активность оказывается необходимой, т.к. некоторые из его митотических субстратов обладают функциями во время дифференцировки и необходима их деградация для успешной спецификации клеточной судьбы. Это касается NEK2A, киназы, которая играет роль во время сборки митотического веретена48 а также помогает передаче сигналов WNT или становлению планарной клеточной полярности во время развития49,50. Дифференцирующиеся клетки также теряют способность APC/C быстро убиквитинировать многие мишени в одно и то же время, позволяя им элиминировать белки, которые мешают им адаптироваться к определенной судьбе. Среди таких APC/C субстратов присутствуют транскрипционные факторы51-53, белки, которые регулируют трансляцию54, E3 лигазы55, партнеры по связыванию tyrosine kinases56 и мембранные рецепторы57. Убиквитинирование этих разнообразных наборов регуляторов развития позволяет APC/C управлять процессами, такими отличными, как формирование синапсов и пластичность, рост аксонов и формирование клеточного паттерна в коре мозжечка54,56,58-60. Соотв., вмешательство в способность APC/C контролировать дифференцировку, сопровождающее делецию FZR1, не только изменяет профиль клеточного цикла, но и также способствует нейрогенезу47.
    Хотя APC/C является наиболее изученным энзимом убиквитинирования при выборе пролиферации и дифференцировки, др. E3 лигазы, по-видимому, выполняют сходные роли. HUWE1, который является мутантным при синдроме Juberg-Marsidi и Brooks X-сцепленной умственной отсталости61, помогает деградировать транскрипционные факторы achaete-scute complex homologue 1 (ASCL1; известен также как MASH1) и NMYC, чтобы подтолкнуть предшественники к состоянию покоя и защитить популяцию стволовых клеток от истощения62,63. В тоже самое время, HUWE1 регулирует дифференцировку мышечных трубок и развитие мозжечка, контролируя состав и обилие общего транскрипционного фактора TFIID и транскрипционного фактора atonal homologue 1 (Atoh1)64,65. Lh/ примером является Skp1-Cullin 1-F-box комплекс с F-box/WD repeat-containing protein 7 (SCFFBXW7): эта E3 лигаза управляет деградацией ключевого активатора вступления в S фазу, cyclin E66,67, а также элиминирует транскрипционные факторы, которые управляют гематопоэзом, дифференцировкой эндокринных клеток и сердечно-сосудистым развитием68-71. В то время как делеция FBXW7 нарушает развитие сердца и приводит к эмбриональной гибели69, гаплонедостаточность по локусу FBXW7 находится среди наиболее частых альтераций при раке72. Эти находки подчеркивают, что баланс между пролиферацией и дифференцировкой является критической функцией убиквитинирования во время развития.

    Control of cell fate specification


    Как только начинается дифференцировка, клетки начинают продуцировать белки, которые являются целью определенных типов клеток. Напр., в то время панкреатические клетки нуждаются в увеличении количества компонентов секреторных путей, чтобы снабжать организм инсулином, мышечные трубки нуждаются в структурных и моторных белках для передачи сил. Экипировка клеток необходимыми составляющими элементами нуждается в скоординированных усилиях, чтобы регулировать архитектуру хроматина, транскрипцию и трансляцию, и убиквитинирование, ролей, важных для всех этих процессов во время спецификации клеточных судеб.
    Control of chromatin architecture. Пост-трансляционные модификации гистоновых белков контролируют компактную упаковку (compaction) и детерминируют доступность транскрипционных факторов к последовательностям их геномных мишеней. Демонстрация роли убиквитинирования в регуляции структуры хроматина связана с идентификацией субстрата этой модификации в виде гистонового белка73. Ключевым регулятором убиквитинирования гистонов является Polycomb repressive complex 1 (PRC1; Fig. 3a), который содержит RING (really interesting new gene)-доменовые субъединицы RING1A, RING1B и BMI1 в качестве центральных компонентов74-76. PRC1 моноубиквитинирует K119 гистона H2A77, который способствует компакции хроматина и репрессии транскрипции78. Убиквитинированный гистон H2A также помогает рекрутировать и активировать PRC2, содержащий methyltransferase EZH2 и устанавливает ещё одну репрессивную метку, триметилирование гистона H3K27 79,80. Т.о., H2AK119 убиквитинирование может вызывать репрессию транскрипции и DUBs, таких как BAP1, MYSM1 или USP16, которые удаляют эту ubiquitin метку, способствуя тем самым активации гена81-84.

    Figure 3: Ubiquitin-dependent control of gene expression.

    a | Polycomb group 1 complex (PRC1)-dependent monoubiquitylation of histone H2A at K119 (H2AK119ub) recruits PRC2, which contains a histone methyltransferase activity that trimethylates histone H3 at K27 to generate H3K27me3. H2AK119ub and H3K27me3 both repress transcription. Deubiquitylation of H2A, which can be carried out by multiple deubiquitinases (DUBs), accordingly activates transcription. b | The transcription factor ?-catenin is continuously degraded after phosphorylation and Skp1-Cullin 1-F-box-?TrCP (SCF?TrCP)-dependent ubiquitylation, unless WNT signals inhibit the destruction complex kinase. c | Hedgehog (Hh) prevents ubiquitin-dependent and proteasome-dependent processing of GLI transcription factors into a transcription repressor that contains a DNA-binding domain but lacks the activation domain. Phosphorylation by kinases, such as protein kinase A (PKA), is required for GLI recognition by SCF?TrCP.

    Многие промоторы, которые репрессируются с помощью убиквитинирования гистона H2A, также обнаруживают триметилирование молекулы гистона H3 по K4, модификации, ассоциирующей с активацией транскрипции85. Такие кажущиеся парадоксальными бивалентные домены хроматина часто обнаруживаются в генах, которые замалчиваются в стволовых клетках, но быстро активируются во время дифференцировки. В связи с обратимостью гистоновых модификаций priming клеток для спецификации судьбы, эмбриональные стволовые клетки нуждаются в убиквитинировании гистона H2A, чтобы дифференцироваться в эмбриоидные тела85. Более того, инактивация или PRC1 или H2A-управляемых DUBs нарушает дифференцировку гематопоэтических стволовых клеток и развитие разных тканей и органов86-90, и это в конечном итоге приводит к болезням, таким как дефекты развития при синдроме Bainbridge-Ropers, или к раку91,92. , следовательно, обратимое прикрепление ubiquitin к гистонам наделяет организмы способностью контролировать программы экспрессии генов во время развития.
    Важно отметить, убиквитинирование гистонов не ограничивается модификацией H2A с помощью PRC1. Фактически, многие гистоновые белки обладают разными гистоновыми остатками Lys и разные факторы биогенеза гистонов являются мишенями убиквитинирования во время дифференцировки и несколько E3 лигаз вносят вклад в этот процесс. Сложная природа ubiquitin-зависимого контроля хроматина иллюстрируется примером Cullin 4 (CUL4), который соединяется со своим субстратом посредством DDB1- и CUL4-associated factor (DCAF), адапторными белками93-95. Будучи спаренным с DCAF WDTC1, CUL4 убиквитинирует K119 гистона H2A, того же самого остатка, на который нацелен PRC1, чтобы репрессировать транскрипцию во время адипогенеза96. Напротив, CUL4, соединенный с DCAF8 мишенями K79 гистона H3, способствует метилированию H3K9 и замалчиванию генов97. Используя др. DCAFs, CUL4 обеспечивает достаточную поставку гистоновых белков с помощью убиквитинирования гистонового stem-loop-binding protein (SLBP), которые активируют эти факторы для процессинга гистоновых мРНК98, а также с помощью координации передачи управления вновь синтезированным гистонам с шаперонов к нуклеосомам99. Благодаря своему центральному положению в регуляции биогенеза и функции гистонов, инактивация CUL4 влияет на стабильность генома популяций эмбриональных и взрослых стволовых клеток100,101, а мутации в CUL4B локусе вызывают Х-сцепленную умственную отсталость102.
    Control of developmental transcription factor activity. Доступная архитектура хроматина позволяет транскрипционным факторам соединяться со своими мишенями промоторами и инициировать экспрессию генов, которые детерминируют клеточные судьбы и функции. Способность транскрипционных факторов управлять развитием многоклеточных организмов видна на примере myoblast determination protein (MYOD), который индуцирует мышечную судьбу103, или в исследованиях, продемонстрировавших, что коктейль транскрипционных факторов толкает соматические клетки в направлении состояния плюрипотентных стволовых клеток104. Поскольку ubiquitin-зависимая деградация, как было установлено, ограничивается уровнями многих транскрипционных факторов, то убиквитинирование выступает как центральный механизм контроля программ генной экспрессии, обеспечивающих раннее развитие.
    Эти принципы иллюстрируются с помощью β-catenin, транскрипционного фактора, обеспечивающего эффекты WNT белков во время развития костей, тонкого кишечника или кожи105 (Fig. 3b). В отсутствие WNTs, β-catenin изменяется (turned over) вследствие своего фосфорилирования с помощью деструкционного комплекса киназ и последующего убиквитинирования с помощью E3 лигазы SCFβTrCP (Refs 106-108). Напротив, если WNT лиганды распознаются с помощью своих рецепторов в стволовых клетках, то убиквитинирование β-catenin не происходит109, и он накапливается, чтобы соединяться с TCF семейством ко-активаторов, чтобы управлять экспрессией генов плюрипотентности. Стабилизированный β-catenin также устанавливает негативную петлю обратной связи, которая ускоряет деградацию его самого и вышестоящих WNT рецепторов110,111. Следовательно, убиквитинирование удерживает β-catenin от переключения, пока не получит соотв. онтогенетические сигналы и это гарантирует, что клетки вернутся к своему состоянию, как только эти сигналы исчезнут. Мутации в последовательности мотива β-catenin, который распознается с помощью SCFβTrCP, или инактивация деструктивного комплекса киназ могут разобщать программы генной экспрессии в стволовых клетках от передачи сигналов WNT, это нарушает развитие кости и вызывает наследственный рак толстой и прямой кишки105.
    Многоклеточные широко используют ubiquitin-зависимый контроль транскрипции во время развития. Известны немногие дополнительные примеры, p53 убиквитинируется и отправляется на деградацию с помощью E3 лигазы MDM2 (Ref. 112); hypoxia-inducible factor 1α (HIF1α), регулятор ангиогенеза, изменяется с помощью CUL2 и von Hippel-Lindau disease tumour suppressor (CUL2VHL) комплекса113; PAX6, руководящий нейральным развитием, ограничивается с помощью Midline 1 (известен также как MID1)114; runt-related transcription factor 2 (RUNX2), регулятор дифференцировки остеобластов, удерживается неактивным с помощью SMURF1-зависимого убиквитинирования115; а B cell lymphoma 6 (BCL-6), контролирующий развитие B клеток, быстро превращается (turned over) с помощью SCF и F-box only protein 11 (SCFFBXO11) комплекса116. В то время как деградация активаторов транскрипции ограничивает экспрессию генов, ubiquitin-зависимое устранение репрессоров может индуцировать программы транскрипции во время развития117. Т.о., быстрая деградация транскрипционных факторов делает программы генной экспрессии чувствительными к изменениям в клеточном окружении внутри эмбриона, а болезни, возникающие в результате потери этих реакций, подчеркивают важность этого регуляторного мотива: помимо мутаций пути WNT-?β-catenin, нарушения оборота транскрипционных факторов вызывают онтогенетические нарушения Opitz синдрома и CHARGE синдрома118,119, а также рак116,120.
    Однако, приравнивание убиквитинирования транскрипционных факторов к деградации было бы упрощением, как было показано с помощью пути Hh, осуществляющего контроль формирования паттерна нейральных предшественников во время образования нервной системы (Fig. 3c). В отсутствие Hh, E3 лигаза SCFβTrCP убиквитинирует Cubitus interruptus (Ci) мух или у млекопитающих GLI транскрипционные факторы, соотв.121-123. Скорее, чем деградация этих белков, протеосомы преобразуют их в укороченные варианты скорее, чем сохраняют у них способность к связыванию ДНК, и лишают активационных доменов; таким способом ubiquitin-зависимые и протеосомы-зависимые преобразования продуцируют репрессоры транскрипции. Как только Hh соединяется со своим мембранным рецептором, GLI преобразование не происходит и полной длины транскрипционные факторы быстро накапливаются, чтобы управлять экспрессией генов124. Ubiquitin-зависимое преобразование транскрипционного фактора, которое описано от дрожжей до человека125,126, является, следовательно, др. регуляторным способом контроля экспрессии генов во время развития.
    Control of translation. После транскрипции рибосомы транслируют мРНК в белки, которые управляют развитием многоклеточных организмов. Если стволовые клетки обладают низкой скоростью трансляции мРНК, то синтез белков ускоряется во время дифференцировки127,128, а аномальная регуляция этих схем (circuitry) вызывает онтогенетические рибосомопатии129 или рак130,131. Убиквитинирование, как известно, контролирует сборку и активность рибосом во время клеточных делений или стрессов20,132,133, а недавнее исследование показало, что оно также придает новый вид специфичности трансляции мРНК во время развития.
    Способность убиквитинирования контролировать синтез белков была установлена в работе, где исследовали роль CUL3 во время спецификации нервного гребня13,14. Эта E3 лигаза распознает свои мишени посредством ~100 адапторных белков с Broad complex-Tramtrack-Bric-a-brac (BTB) доменами134-136. соединившись с Kelch повтором и BTB domain-containing protein 8 (KBTBD8), CUL3 моноубиквитинирует два фактора биогенеза рибосом, чтобы создать платформу для продукции модифицированных рибосом13. The CUL3KBTBD8-зависимые рибосомы транслируют специфические мРНК , это позволяет эмбриональным стволовым клеткам детерминировать судьбу нервного гребня (Fig. 4a,b). Мутации в ключевом субстрате CUL3KBTBD8, Treacle protein (TCOF1), приводят к синдрому Treacher-Collins, нарушению черепно-лицевого развития, вызываемое нарушениями спецификации краниального нервного гребня137. Напротив, мутации промотора, вносят сайты связывания транскрипционных факторов и возможно усиливают продукцию KBTBD8 приводят к меланоме, раку, происходящему из нервного гребня138. Эмбрионы контролируют поздние стадии черепно-лицевого развития с помощью той же E3 лигазы, CUL3, но с др. адаптором - Kelch-like protein 12 (KLHL12). CUL3KLHL12 повышает способность хондроцитов, происходящих из нервного гребня, секретировать коллаген, основной компонент внеклеточного матрикса, которые создает матрицу (blueprint) для формирования кости и эта активность зависит от кальция14,139(Fig. 4a). Как видно по CUL3KBTBD8, мутации, которые затрагивают пути, стоящие ниже CUL3KLHL12 приводят к черепно-лицевым нарушениям, cranio-lenticulo-sutural дисплазии140. Т.о., эмбрионы могут использовать ту же самую E3 лигазу, но с разными адапторами, чтобы интегрировать множественные ступени, необходимые для формирования сложных органов. В соответствии с этой важной ролью в развитии, E3 лигаза, CUL3 является важной для развития141. Кроме того, мутации CUL3 или изменение экспрессии демонстрируют добавочные строгие связи с аутизмом, шизофренией и гипертензией142-146.

    Figure 4: Ubiquitin-dependent control of mRNA translation and cell signalling.

    a | Ubiquitin-dependent control of neural crest specification. Human embryonic stem cells require the E3 ligase Cullin 3 (CUL3) paired with its adaptor Kelch repeat and BTB domain-containing protein 8 (KBTBD8) (CUL3KBTBD8) to differentiate into neural crest cells (see also part b). Neural crest cells further differentiate into chondrocytes, which use CUL3 in complex with another adaptor, Kelch-like protein 12 (KLHL12) (CUL3KLHL12), to accelerate collagen secretion by modulating the size of coat protein complex II (COPII) vesicles. Collagen functions as a blueprint for the deposition of calcium phosphate crystals during ossification. Calcium signals back to regulate neural crest specification (by activating the transcription factor NFAT, not shown), as well as to turn on the CUL3KLHL12 ubiquitylation machinery. b | Ubiquitin-dependent control of ribosomal mRNA specificity. Monoubiquitylation of Treacle protein (TCOF1) and nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1 (NOLC1) by CUL3KBTBD8allows for the formation of a ribosome biogenesis platform that recruits RNA polymerase I (Pol I), the pseudouridylation machinery, and the small subunit (SSU) processome, a complex that has RNA methylation and protein phosphorylation activities. The resulting ribosomes are probably decorated with post-translational modifications and translate mRNAs that are distinct from those of housekeeping ribosomes; the changes in ribosomal output help generate neural crest cells by allowing synthesis of neural crest proteins. c | Ubiquitin-dependent quality control of protein synthesis. Stalled ribosomes resulting from translation of aberrant mRNAs recruit the E3 ligase listerin, leading to ubiquitylation of the nascent polypeptide chain, subsequent extraction of the polypeptide from the ribosome by the segregase p97 (also known as VCP), and its proteasomal degradation. d | Mindbomb 1 (MIB1)-dependent and Neuralized-dependent ubiquitylation of Notch ligands bound to Notch receptors induces ligand endocytosis in the signal-sending cell, which generates mechanical strain in the receptor that promotes its sequential cleavage by ADAM metalloproteinases and γ-secretase in the signal receiving cell. The resulting Notch intracellular domain (NICD) translocates to the nucleus, where it activates gene expression.

    Убиквитинирование не только контролирует специфичность трансляции мРНК, но и также помогает деградировать синтезируемые полипептиды, которые неспособны к укладке и склонны к агрегации. Это особенно важно во время раннего развития, когда эмбрионы стремятся избегать накопления неправильно функционирующих белков, чтобы гарантировать успешное образование всех тканей; соотв., эмбрионы активируют ubiquitin-зависимую деградацию, чтобы противодействовать продукции несовершенных белков147,148. Напр., аномальная транскрипция может давать мРНК, которые заставляют рибосомы останавливаться149. Чтобы предохранить эти рибосомы от затора в синтезе белка, клетки рекрутируют E3 лигазу listerin и segregase p97 (известена также как VCP) , чтобы убиквитинировать остановившуюся (stuck) синтезируемую цепь и запустить её удаление с помощью протеосом150-153 (Fig. 4c). Путь, в центре которого E3 zinc-finger protein 568 (ZNF568), восстанавливает рибосомы, которые остановились после считывания poly-A хвоста мРНК154,155. Неаккуратная трансляция или условия клеточного стресса также приводят к тому, что белки не достигают своей нативной конформации и и д. быть удалены, чтобы предупредить образование вредных агрегатов156,157. Если эти пути контроля качества не действуют качественно, как это наблюдается после инактивации E3 лигазы listerin или p97 дифференцировка стволовых клеток нарушается и возникают дегенеративные нарушения, такие как frontotemporal деменция или боковой амиотрофический склероз158-160.

    Roles in cellular communication


    Тело животных в конечном итоге образуется за счет взаимодействий примерно 200 типов клеток, возникающих в результате программ спецификации, описанных выше. Во время эмбриогенеза клеточные взаимодействия могут осуществляться между соседними или удаленными клетками: т.к. ближайшее окружение стволовых клеток, т. наз. ниши, инструктируют предшественники подвергаться ли им самообновлению или дифференцировке, аксоны метровой длины соединяют нейроны с телами нейронов периферических тканей. Эти коммуникации могут быть временными, как это наблюдается во время наведения аксонов или долго-живущими как в процессах обучения и памяти. Подобно их роли во внутриклеточных путях, ответственных за становление клеточных судеб, убиквитинирование является важным игроком в контроле клеточных взаимодействий, которые лежат в основе формирования тканей и органов.
    Control of membrane receptor abundance. Чтобы оценить свое пространственное и временное положение во время развития, клетки обращаются к мембранным рецепторам, которые определяют специфические паттерн-формирующие сигналы, такие какие посылает Шпемановский организатор. Ubiquitin-зависимый эндоцитоз контролирует занятость мембраны множеством рецепторов, тем самым предопределяет чувствительность стволовых клеток или их потомков к важным онтогенетическим сигналам. Так, Paneth клетки кишечных крипт секретируют WNT белки, воспринимаемые Frizzled-LRP5/6 рецепторами на мембранах соседних крипт в основании цилиндрических клеток, стволовых клеток этого органа161. Т.о., структуры ниш инструктируют стволовые клетки, чтобы поддерживать их плюрипотентный характер. Две E3 лигазы, ZNRF3 и RNF43, обычно поддерживают уровни рецепторов для WNTс помощью убиквитинирования Frizzled и LRP5/6, запуская тем самым их эндоцитоз и лизосомную деградацию110,111,162. Чтобы поддерживать передачу сигналов WNT, стволовые клетки предупреждают эту негативную регуляцию: они используют R-spondin белки, чтобы секвестрировать ZNRF3 и RNF43 от их субстратов163, и DUB, USP6, xmk.s противостоять убиквитинированию Frizzled164. Генетические исследования и болезни человека подчеркивают важность убиквитинирования для контроля концентрации рецепторов: мутации или поврежденная экспрессия ZNRF3, RNF43, USP6 или R-spondins вызывает увеличение компартментов стволовых клеток, аномальную дифференцировку и туморогенез110,111,164-166.
    Сходная регуляция с помощью пути WNT др. мембранных рецепторов, участвующих в развитии, осуществляется путем удаления с клеточной поверхности ubiquitin-зависимого эндоцитоза. Сюда входят рецепторы для bone morphogenetic proteins, которые управляют развитием костей и интернализуются с помощью SMURF-зависимого убиквитинирования167,168; рецепторы факторов роста, которые удаляются с мембран посредством NEDD4 или CBL-семейства E3 лигаз169-171; или TAM семейство рецепторных тирозин киназ, чья способность контролировать клетки натуральных киллеров регулируется с помощью убиквитинирования с привлечением CBLB172. Итак, аномальная активация чувствительных E3 лигаз приводи к повышению или увеличению продолжительности передачи сигналов с помощью этих рецепторов и к болезни: SMURF E3 лигазы участвуют в аномальном гомеостазе костей, остеоартрите и раке173,174; мутации в NEDD4L, в гене, кодирующем NEDD4, вызывают нарушения нейрального развития в виде periventricular nodular heterotopia175; а мутации в c-CBL приводят к миелоидныи новообразованиям176.
    Activation of membrane receptor signalling. В то время как убиквитинирование может запускать активацию транскрипционных факторов скорее, чем подавлять, ubiquitin-зависимый эндоцитоз обнаруживается как средство, которое способствует скорее, чем затрудняет взаимодействия клеток во время развития. Так, удаление ингибирующего белка с клеточной поверхности делает возможной передачу сигналов. Это наблюдается в случае пути Hh, в котором связывание лиганда Hh с Patched запускает убиквитинирование и эндоцитоз этих рецепторов177. Удаление Patched с мембраны первичной реснички позволяет белку Smoothened проникать в этот компартмент, активировать GLI транскрипционные факторы и контролировать формирование паттерна клеток во время развития нейронов.
    Отличительная роль ubiquitin-обеспечиваемого эндоцитоза наблюдалась на пути передачи сигналов Notch, контролирующем процесс латеральной ингибиции во время сомитогенеза и развития головного мозга178,179 (Fig. 4d). Клетки, имеющие этот регуляторный цикл (circuit), удерживают свои трансмембранные Notch рецепторы180 до тех пор, пока они не обнаружат лиганд для Notch на мембране соседней клетки181. Лигандом активированные Notch рецепторы подвергаются конформационным изменениям, которые приводят к отщеплению рецептора, высвобождению Notch intracellular domain (NICD) и к NICD-зависимой экспрессии чувствительных к Notch генов181. Протеолитическое превращение Notch рецепторов в активатор транскрипции зависит от механических напряжений, по крайней мере, частично осуществляемых с помощью ubiquitin-зависимого эндоцитоза лигандов для Notch в посылающих клетках182,183, реакция, осуществляемая с помощью E3 лигаз Mindbomb 1 (MIB1) и Neuralized184,185. Соотв. делеция MIB1 вызывает эмбриональную гибель, ассоциированную с потерей передачи сигналов Notch186, тогда как его мутации вызывают non-compaction кардиомиопатию левого желудочка187.
    Control of cell migration. В дополнение к этим локальным формам коммуникаций развитие неизбежно влечет за собой миграцию некоторых клеток из ткани их происхождения в эмбриональные территории, где они осуществляют свою специфическую функцию. Напр., клетки нервного гребня возникают на границе между нервной пластинкой и не нейральной эктодермой; после их эпителиально-мезенхимного перехода эти клетки мигрируют в разные места эмбриона, где они дифференцируются в хондроциты, глиальные клетки, меланоциты и др. типы клеток188,189. Миграция клеток нервного гребня нуждается в совместном действии транскрипционных факторов, которые, по крайней мере, у Xenopus laevis, контролируются с помощью ubiquitin-зависимой деградации190.
    Удивительный пример клеточной миграции дают нейроны, которые посылают свои аксоны, чтобы найти свои нейроны мишени в развивающемся головном мозге. Наведение аксонов базируется на восприятии привлекающих или отталкивающих сигналов, процесс, зависящий от локальной ubiquitin-зависимой и proteasome-зависимой деградации ростовых кончиков аксонов191,192. Будучи способными быстро менять композицию своих белков, это, по-видимому, улучшает способность аксонов отвечать на изменения в их окружении. В ростовом конусе убиквитинирование также действует не протеолитически , а путем регуляции динамики ремоделирования актина, это в конечном итоге позволяет аксонам перемещаться в направлении аттрактантов или прочь от отталкивающих сигналов193. У мышей, лишенных соотв. E3 лигазы, TRIM9, нейроны dentate gyrus оказываются расположенными неправильно, приводя к дефициту обучаемости и памяти194. Хотя многие аспекты ubiquitin-зависимого контроля наведения аксонов, такие как природа протеолитических E3 лигаз, неизвестны, этот процесс иллюстрирует, как множественные ubiquitin сигналы совместно управляют разными аспектами клеточных судеб и функций во время развития.

    From disease to E3 ligase function


    Быстро увеличивается коллекция исследований геномных ассоциаций с E3 лигазами, которые важны для развития. В самом деле, первый опухолевый супрессор был идентифицирован на базе мутаций, вызывающих рецидивирующие болезни, в breast cancer type 1 susceptibility protein (BRCA1), в субъединице димерной BRCA1-BRCA1-associated RING domain protein 1 (BARD1) E3 лигазе195. Мутации в BRCA1 обеспечивают высокий риск возникновения рака груди и яичников, это связано с важной ролью BRCA1-BARD1 в гомологичной рекомбинации и в репарации поперечных сшивок ДНК196. Критические субстраты для BRCA1-BARD1 ещё предстоит идентифицировать, чтобы понять, действительно ли убиквитинирование с помощью этой E3 лигазы необходимо для супрессии опухоли 197.
    Подобно туморогенезу секвенирование оказались способным связать с мутациями E3 лигаз возникновением болезней. Напр., аберрантная экспрессия E6AP (кодируемой UBE3A) оказалась причиной двух нарушений развития нейронов: синдрома Angelman и аутизма. Синдром Angelman, характеризующийся микроцефалией, судорогами и чрезвычайно общительным характером, вызывается дефектами метилирования материнского региона хромосомы 15q11.2-q13, который предупреждает продукцию нейронального E6AP198. Напротив, аутизм возникает в результате усиления экспрессии или активности E6AP, в результате амплификации гена UBE3A или потери фосфорилирования, ингибирующего белка, соотв.199. E6AP был идентифицирован как E3 лигаза, которая вместе с papillomavirus E6 белком метит опухолевый супрессор p53 , чтобы направить его на деградацию200. В соответствии с этим наблюдением, E6AP продуцирует K48-сцепленную цепочку ubiquitin201, и тем самым, по-видимому, помогает деградировать важные регуляторы дифференцировки и функции нейронов, такие как activity-regulated cytoskeleton-associated protein (ARC) - регулятор эндоцитоза рецептора glutamate202. Идентификация дальнейших мишеней для E6AP связана с выявлением новых механизмов, управляющих развитием головного мозга, и может привести к новым терапевтическим стратегиям против широко распространенных нарушений, таких как аутизм.
    Т.к. сцепленные с болезнями мутации подчеркивают онтогенетические функции убиквитилирования, то это может позволить использовать малые молекулы в клинике. Яркий пример предоставляет thalidomide, соединение, которое предписывали в 1950s против тошноты беременных во время беременности. Это породило один из наиболее драматических кризис, т.к. многие женщины, принимавшие талидомид рожали детей с тяжелыми осложнениями развития, такими как короткие верхние конечности. Спустя 10 лет, было установлено, что thalidomide соединяется с E3 лигазой, состоящей из CUL4 и её субстратного адаптора203 (Fig. 5a). Напоминающая тератогенные эффекты thalidomide, истощение CUL4cereblon нарушает развитие плавников у рыбок данио. Хотя субстрат кандидат для CUL4cereblon, такой как транскрипционный фактор MEIS2 и glutamine synthetase, были идентифицированы204,205, критические мишени для этой E3 лигазы во время развития конечностей ещё предстоит установить.

    Figure 5: Small-molecule regulation of E3 ligases implicated in developmental processes.

    a | Thalidomide (Th) inhibits an E3 ubiquitin ligase composed of Cullin 4 (CUL4) and the substrate adaptor cereblon (CUL4cereblon). Ubiquitylation by CUL4cereblon controls limb development in metazoans. b | Thalidomide can repurpose the CUL4cereblon to ubiquitylate neo-substrates, such as Ikaros transcription factors, thereby inducing cancer cell death in multiple myeloma and myelodysplastic syndrome.

    Несмотря на свои тератогенные эффекты thalidomide нашел свой путь обратно в клинику как иммуномодуляторное лекарство против множественной миеломы и myelodysplastic синдрома. Когда он используется для лечения этих болезней, то thalidomide и родственные ему соединения пере-профилируют CUL4cereblon, чтобы убиквитинировать 'neo-substrates', т.е. белки, которые не являются естественными мишенями для этого энзима, включая транскрипционные факторы Ikaros и Aiolos (известны также как IKZF1 и IKZF3, соотв.), casein kinase Iα, или фактор translation-termination factor GSPT1 (Refs 206-208) (Fig. 5b). Т.к. эти новые субстраты, как полагают, необходимы для выживания опухолей, то их деградация с помощью CUL4cereblon вызывает гибель опухолевых клеток. Сходный механизм действия обнаружен для sulfonamide indisulam, который осуществляет свои цитотоксические эффекты, направляя белки сплайсесом на деградацию с помощью CUL4DCAF15 (Ref. 209). Расширением этих находок стало слияние thalidomide с др. малыми молекулами, это делает возможным избирательное удаление разнообразных белков, вызывающих болезни с помощью CUL4cereblon-обеспечиваемого убиквитинирования и протеосомной деградации210. Т.о., thalidomide, indisulam и их производные используют убиквитиновую систему, чтобы индуцировать деградацию белков, которые поддерживают определенные болезненные состояния. Даже если не все субстраты CUL4cereblon могут быть известны. Этот пример иллюстрирует, как исследование онтогенетических E3 лигаз может приводить к сюрпризам новых подходов для открытия лекарств.

    Concluding remarks


    Shortly after ubiquitin was discovered, it was recognized to be expressed in every cell, and this ubiquitous expression ultimately gave ubiquitin its name. The widespread occurrence of this modification is rooted in its ability to assemble multiple signals and regulate signal transduction in mechanistically diverse, quantitative and reversible ways. The ubiquitin field has traditionally been dominated by biochemistry and structural biology, and it still is typically studied within cells and not in embryos. Although this approach provides insight into mechanisms of ubiquitin chain assembly and recognition, it does not take into account the contribution of a cell's environment: signals sent by a stem cell niche, cell competition within the limited confines of an organ or gradients in oxygen concentration throughout a tissue are rarely considered when ubiquitin-dependent signalling is investigated. In the age of genome editing, we should be able to merge mechanistic biochemistry with developmental biology to provide conceptually new insights into the roles of ubiquitylation during human development and disease.
    As described throughout this Review, ubiquitin research provides an excellent example of how 'basic science' can improve our understanding of widespread pathologies and enable the development of new treatment modalities. Notably, the disease-relevant findings regarding ubiquitin were often based on work that was not necessarily associated with human development and pathologies. Who would have thought that studying how baker's yeast cells use ubiquitin to regulate the fluidity of their intracellular membranes would reveal the mechanism of an enzyme, VCP, that is now known to be implicated in neurodegenerative diseases and used as a target of chemotherapeutic drugs211? Or was it predictable that genetic dissection of a ubiquitin-dependent pathway that enables plants to establish roots or bloom during spring would serve as blueprint for 'ProTacs', a new class of chemotherapeutic drugs210?
    We are only beginning to understand how ubiquitin governs metazoan development and how its misregulation results in diseases. We are bound to see many more examples of how this modification is implemented in a growing embryo, how it can be hijacked to modulate signalling pathways in the context of diseases and how this can be translated into clinical applications. Especially for paediatric or degenerative diseases, therapeutic options are rare, and research similar to that described in this Review will be crucial to introduce new treatments. Still, despite the many unknowns, one issue has become clear: the multiple ways by which ubiquitylation controls development represent a crucial means for generating the remarkable cellular diversity and organismal complexity depicted in those beautiful drawings by Santiago Ramon y Cajal.