Разработка эффективной генотерапии для нейрологических болезней зависит от доступности устройств для переноса генов, способных к широко распространенной эффективной трансдукции клеток ЦНС. Рекомбинантные adeno-associated virus (AAV) векторы становятся платформой выбора для разработки генотерапии для нейродегенеративных болезней, т.к. они трансдуцируют ЦНС с высокой эффективностью и экспрессируют интересующие гены в расширенные периоды времени,^1,2 вообще-то бесконечно. До 2009, AAV перенос генов в ЦНС базировался на внутри-париентальных инъекциях, при этом распределение в основном ограничивалось структурой мишенью, что в определенных случаях было предпочтительно, т.к. не обязательно нейродегенеративная болезнь затрагивала всю ЦНС. Открытие, что AAV9 пересекает гемато-энцефалический барьер (BBB) после системного введения у мышей³, привело к началу новой эры внутрисосудистой генотерапии при болезнях ЦНС. Тем не менее AAV9 векторы, доставляемые системно взрослым животным, обнаруживали существенные ограничения, т.к. наиболее трансдуцируемыми клетками в головной мозг оказались астроциты и эндотелиальные клетки, при этом трансдуцировались лишь немногие нейроны.^4-6 Преобразующие исходы у детей со спинальной мышечной атрофией (SMA), леченных с помощью внутрисосудистых вливаний AAV9 вектора⁷ , скорее всего, были результатом удивительного tropism двигательных нейронов спинного мозга, которые служили первоначальными драйверами фенотипических отклонений при SMA. Напротив, большинство нейрологических болезней также затрагивали популяции нейронов головного мозга и ПНС. Поэтому сохраняется необходимость обнаружения мощных AAV капсид, способных к трансдукции большинства нейронов, астроцитов, олигодендроцитов и микроглии с использованием минимально инвазивных поставляющих подходов.

Разработка AAV капсид с новым тропизмом к ЦНС сопровождалась использованием разных подходов, включая in vivo отбор библиотек, сгенерированных с помощью ДНК перетасовки (shuffling) существующих генов капсид,^8,9 библиотек пептидов, располагающихся на поверхности касид,^10,11 скрининга дополнительных природных вариантов,^6,12 или даже синтеза in silico,¹³, и вплоть до недавнего времени улучшения AAV9 системного переноса генов возрастали.

Отбор in vivo с использованием Cre recombinase-управляемой идентификации AAV капсид, трансдуцирующих клетки мишени в ЦНС привели к выделению AAV-PHP.B¹⁴ и AAV-PHP.eB¹⁵ капсид, которые оказались в 80-300 раз более эффективными, чем AAV9. Однако, в отличие от AAV9, который обладал устойчивыми свойствами среди видов,^4,5,16,17 AAV-PHP.B обнаруживал только приблизительно в 2 раза большую эффективность, чем AAV9 у крыс¹⁸, а также обнаруживал более умеренное улучшение в отобранных популяциях нейронов у мартышек,¹⁹ кошек,²⁰ и овец.²¹ Такие же находки у др. видов подтвердили, что AAV-PHP.B задействует молекулярный механизм, не законсервированный эволюционно, чтобы пересекать BBB у мышей с высокой эффективностью, хотя он и остается неизвестным. Сходным образом, наше знание о том, как AAV9 пересекает BBB остается в основном эмпирическим, при этом механизм его неизвестен. Открытие способа, с помощью которого AAV9, AAV-PHP.B иd AAV-PHP.eB пересекают BBB после системного введения, сможет предоставить необходимую информацию, чтобы разумно преобразовывать новые молекулы с высоким потенциалом и с тканевой и клеточной специфичностью.

В процессе характеристики тропизма of AAV-PHP.B в нашей лаб., мы установили, что его удивительные свойства переноса генов в ЦНС у C57BL/6J мышей не воспроизводились у BALB/cJ мышей, эта находка также недавно подтверждена и др.^22-25 Эта неожиданная находка предоставляет уникальную возможность использовать мощную классическую генетику, чтобы идентифицировать гены, ответственные за дифференциальные свойства у двух инбредных линий мышей и в конце концов пролить свет на молекулярные механизмы некоторых AAV капсид, используемых для пересечения BBB. Мы осуществили анализ всего генома в отношении полиморфизма нуклеотидов в C57BL/6J x BALB/cJ скрещиваниях и возвратных скрещиваниях, а также изучали тропизм к ЦНС AAV-PHP.B у более 10 инбредных линий мышей с секвенированными геномами. Такой комбинированный подход дал несколько генов кандидатов в небольшом регионе хромосомы 15 и представил собой важную ступень в направлении понимания молекулярных механизмов пересечения AAV барьера BBB и трансдукции клеток в ЦНС с высокой эффективностью. i

Итак, мы показали, что AAV-PHP.B оказывается неэффективным при системном введении в отношении переноса генов в ЦНС у инбредных мышей BALB/cJ, BALB/cByJ, A/J, NOD/ShiLtJ, NZO/HILtJ, C3H/HeJ и CBA/J, но он действует чрезвычайно мощно у C57BL/6J, FVB/NJ, DBA/2J, 129S1/SvImJ и AKR/J мышей, а также в аутбредной линии CD-1. Путем картирования локусов количественных признаков мы идентифицировали регион в 6 Mb на хромосоме 15 с logarithm of the odds (LOD) показателем ~20, включая полиморфизм одиночных нуклеотидов в кодирующем регионе 9 разных генов. Сравнение опубликованных геномных последовательностей 16 разных линий мышей, в комбинации с анализом данных RNA-seq эндотелия микрокапилляров головного мозга позволило нам прийти к заключению, что уровень экспрессии Ly6a, скорее всего, является детерминирующим фактором дифференциальной эффективности AAV-PHP.B по трансдукции ЦНС у разных линий мышей.