CRISPR/Cas9 является мощным инструментом для геномного редактирования для модификации генов в клетках животных и растений.^1-4 Вызываемые с помощью Non-homologous end joining (NHEJ) разрывы двойной нити ДНК (DSB) могут приводить к сдвигу рамки считывания, включая внесение инсерций, делеций, траслокаций и др. перестроек ДНК в месте DSB, и вызывать тем самым нокаут гена.^5-7 CRISPR/Cas9 вызывает также достоверное увеличение апоптоза,⁸ возможно благодаря токсичности, вызываемой DSB.^9-11 Более того, Grigoire Cullot с колл. обнаружили неожиданные укорочения хромосом в результате лишь действия Cas9 нуклеазой индуцированных DSB в линиях клеток и первичных клетках с помощью зависимого от p53 механизма.¹² Путем анализа пост-транскрипционных и пост-трансляционных эффектов, вызывающих инсерции или делеции (indels) в ряде редактируемых с помощью CRISPR клеточных линий, Lum, L. с колл. наблюдали изменения в массиве транскриптов и белков, экспрессируемых генами после целенаправленного воздействия на них CRISPR в ~50% изученных клеточных линий.¹³ Недавно, cytosine base editor (CBE) обусловливает прямую конверсию C^oG пары оснований в T^oA пару оснований, предоставил новую технику точного редактирования генов мишеней.14 Более того, CBE может вставлять преждевременный стоп-кодон, чтобы разрушить ген с помощью прецизионной конверсии 4-х кодонов (CAA, CAG, CGA или TGG) в стоп-кодоны, это новый метод нокаута генов без потенциальных побочных эффектов после разрезания двойной нити ДНК.^{8, 15}

Хотя разрушение гена достигается с помощью CBE-опосредованных iSTOP и CRISPR/Cas9обеспечиваемых сдвигов рамки считывания, детальные различия между нокаутом гена в двух системах неясны. Мы отобрали 13 sgRNAs с разными позиционными фонами, чтобы подробно сравнить две системы путем анализа генотипа, экспрессии гена с использованием глубокого секвенирования, qPCR и Western blot. Мы также определяли результаты редактирования, используя две соседние sgRNAs.

И CBE-опосредованный iSTOP и CRISPR/Cas9-опосредованный сдвиг рамки считывания широко используются для разрушения генов.^22-25 Системы редактирования оснований дают точные замены C в T и A в G без DSB, и поэтому они оказывают менее разрушительные эффекты на геном.^{8, 15} Мы сравнили разрушение гена, обусловленные этими двумя стратегиями. Как и ожидалось, BE обеспечиваемая точная замена оснований, дает меньше генотипических отклонений, чем Cas9-обусловленный сдвиг рамки считывания, который редактирует геномы бесконтрольно, включая Cas9-обусловленные 3n indels приводящие к разрушению гена. Следовательно, достоверно меньше генотипов получается в BE3 группах по сравнению с CRISPR/Cas9 группой. Следовательно, легче получать изогенные гомозиготные колонии мутантных клеток с помощью BE обусловленного iSTOP.

Двойные sgRNAs были использованы для получения делеций с помощью Cas9,^{18, 19} , поэтому мы тестировали двойные нокауты с двух соседних генах и установили, что CRISPR/Cas9 с легкостью делетирует крупные фрагменты между двумя sgRNAs. В противоположность BE, индуцирующего только стоп-кодон в сайте мишени, в результате чего возникают точно и безопасно одновременно разрушения двух генов, подтверждая, что BE-опосредованный iSTOP является лучшим выбором для нокаута множественных генов. Kuscu et al показали, что iSTOP стратегия вызывает существенное снижение апоптоза по сравнению с воздействием Cas9 нуклеазы.⁸ Интересно, что мы также установили, что BE обусловленный нокаут оказывает меньшее влияние на относительный уровень экспрессии соседних генов. Это может быть обусловлено разными уровнями изменений при BE- или Cas90-обусловленной стратегии нокаута. BE3 редактирование вызывает изменения генотипа, сходные с полиморфизмом одиночных оснований (SNP), оказывая незначительный эффект на структуру хромосом и соседние гены. CRISPR/Cas9 вызывает значительный мутагенез в мишени, такой как крупные делеции и более сложные геномные перестройки.⁶ Флюктуации в уровнях мРНК соседних генов могут быть одним из её проявлений.

Итак, разработанный недавно зависимый от CRISPR cytosine base editor (CBE), превращающий 4 кодона (CAA, CAG, CGA и TGG) в стоп-кодоны без индукции разрывов двойной нити ДНК (DSB), служит эффективной стратегией разрушения гена помимо неконтролируемого вызываемого CRISPR сдвига рамки считывания.

После отбора некоторых sgRNAs клетки HEK293T трансфицировали CBE/Cas9 плазмидами вместе с sgRNAs. Сравнение разрушений гена с помощью CBE- опосредованного iSTOP с CRISPR/Cas9 обусловленными сдвигами рамки считывания показало, что BE-опосредованное редактирование гена осуществляется более точно, заставляя молчать два соседних гена, тогда как CRISPR/Cas9 может делетировать большой фрагмент между двумя сайтами мишенями. При этом Cas9-вызываемый нокаут гена оказывает больше влияния на соседние гены на уровне мРНК, чем BE редактор.