C декабря 2019 новый COVID-19 коронавирус, наз. severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2) (Gorbalenya et al., 2020), возник внезапно в Wuhan, Hubei Province, China, и быстро распространился в Китае и по всему миру. 25 марта 2020, 81285 случаев было подтверждено в Китае и 159 было заподозрено тяжелых случаев (CCDC, 2020). Сегодня нет эффективного клинически проверенного лекарства. Поэтому важно найти стратегию предупреждения вирусной инфекции. SARS-CoV-2 принадлежит к той же самой группе тяжелых острых респираторных коронавирусных синдромов (SARS-CoV) и, как было установлено, использует тот же самый рецептор, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) для проникновения в клетки посредством поверхностного spike (S) белка (Zhou, Yang, et al., 2020). ACE2 играет важную роль в регуляции renin-angiotensin system (RAS). Действуя как протеза для расщепления angiotensin II, ACE2 противодействует эффекту angiotensin II и поддерживает кровяное давление, скорость сердцебиений и осмотическое давление (Boehm & Nabel, 2002; Crackower et al., 2002). Несмотря на то, что он не служит в качестве рецептора для др. вирусов, таких как вирус гриппа H5N1, он также защищает мышей против SARS, H5N1 (Zou et al., 2014), H7N9, (Yang et al., 2014) и от аспирации кислот, вызывающих повреждения легких (Imai et al., 2005).

Эпидемиологические исследования установили, что мужчины чуть-чуть более склонны, чем женщины к инфекции, но среди них больше тяжелых и фатальных случаев, а боле старые люди после 60 или с хроническими болезнями, такими как диабет типа II (T2D) и гипертензия (Chen, Zhou, et al., 2020; Guan et al., 2020; Huang et al., 2020; Wang, Hu, et al., 2020) часто приобретают системное воспаление или цитокиновый шторм, ведущие к критическим состояниям COVID-19 (Diao, 2020; Huang et al., 2020; Liu, 2020; Wan, 2020). Напр., при анализе 44672 пациентов с подтвержденным диагнозом в Китае на 11 фев., мужчины составляли 51.4% от общего числа пациентов, но 63.8% среди умерших, а смертность у мужчин и женщин соотв. составляет 2.8% и 1.7% (Team & T. N. C. P. E. R. E., 2020). Пациенты старше 50 лет составляют примерно половину от общего числа подтвержденных случаев, а большинство гибнущих приходится на старых мужчин. World Health Organization сообщила о 414179 лабораторно подтвержденных случаях вне Китая 25 марта 2020, из Европы, Сев. Америки, Зап. Тихоокеанского бассейна и Юго-Восточной Азии и относительно меньше случаев в Африке (WHO, 2020), сходно с распространением предыдущих SARS-CoV (WHO, 2003). Это указывает на то, что существуют различия в иммунитете, экспрессии генов или даже в генетическом фоне, которые влияют на различия в чувствительности и тяжесть SARS-CoV-2 инфекции. Странно, в некоторых случаях, многие жизненно важные ткани, включая и те, которые экспрессируют низкие уровни ACE2, оказываются тяжело поврежденными SARS-CoV-2инфекцией (Chai et al., 2020). Т.к. ACE2 считается рецептором клетки хозяина для SARS-CoV-2, он также играет важную роль в регуляции renin-angiotensin system (RAS), мы исследовали, действительно ли экспрессия ACE2 может вносить вклад в чувствительность и тяжесть болезни. Мы установили с использованием крупных баз GTEx, что ассоциация оказывается противоположной по отношению к тому, что ожидалось исходя только из receptive/inductive роли ACE2, при этом более высокая экспрессия ACE2 у Азиатских женщин и достоверное или недостоверное снижение её при старении во многих тканях, согласуется со строгой экспрессией ACE2, которая как показывает eQTLs сильно превалирует в Восточной Азии. Кроме того, используя доступные базы данных по экспрессии генов, мы установили, что экспрессия ACE2 усиливается эстрогеном и андрогеном, подавляется при диабете T2D и воспалительными цитокинами в разных тканях мышей и людей и обнаруживается достоверная негативная корреляция экспрессии ACE2 с вирусной инфекцией, особенно с генами, способствующими инфекции herpes simplex virus 1 во многих тканях у разных индивидов.

Поскольку SARS и COVID-19 преимущественно причиняют страдания старым мужчинам (Huang et al., 2020; Karlberg, Chong, & Lai, 2004; Team, 2020) и первоначально появились в Восточной Азии, мы исследовали вопрос, действительно ли уровни экспрессии ACE2 отличаются у мужчин и женщин и среди трех основных этнических групп. Если единственной функцией быть вирусным рецептором, то следует ожидать, что старые мужчины д. иметь наивысшие уровни ACE2, но напротив, мы обнаруживаем среди тканей с крупными размерами выборки и высоким уровнем экспрессии ACE2, что Азиатские женщины обладают достоверно более высоким уровнем экспрессии ACE2 в жировой ткани, надпочечниках, сердце и пищеводе, чем у мужчин и по сравнению с др. этническими группами (Figure 1a-d), и умеренно более высокие уровни ACE2 в кровеносных сосудах, мышцах и яичниках (Figure 1e-h) (Methods). Хотя тенденция оказывалась очевидной после множественных тестов коррекции только для жировой ткани, достигая FDR менее 0.1. Во всех этнических группах и у обоих полов экспрессия ACE2 в общем снижается с возрастом достоверно или недостоверно (Figure 1 and Figure S1, Methods). Хотя только выборки белых были достаточно крупными для детекции достоверности, очевидно, что зависимое от возраста снижение более достоверно у мужчин, чем у женщин. Напр., экспрессия ACE2 достоверно снижается с возрастом в толстом кишечнике, крови и надпочечниках, головном мозге, нервах, жировой ткани и слюнных железах у белых мужчин, но только в первых трех тканях у женщин (Figure 1 and Figure S1). Для толстой кишки, нервов, слюнных желез, жировой ткани, крови и головного мозга даже после множественных этапов коррекции , зависимое от возраста снижение у белых мужчин остается достоверным, но достоверным остается снижение у женщин только для толстого кишечника (FDRs in Figure 1 and Figure S1). Эти паттерны противоположны индуктивным эффектам высокого уровня экспрессии ACE2 чувствительности к вирусной инфекции и тяжести.

Экспрессия ACE2 в разных тканях у мужчин, женщин из Азии, Африки и белых с возрастом. Панели a-d и e-h это ткани, для которых у азиатских женщин обнаруживается достоверная или умеренная (маргинально достоверная) более высокая экспрессии, чем у др. групп, соотв. n, количества выборок в каждой группе; k, p и FDR демонстрируют снижение, p значений и множественные коррекции FDR линейной регрессии, соотв. Достоверность p значений и FDR отличий между азиатской и др. этническими группами, показана на верху диаграмм. j, Суммарная статистика ассоциаций с каждой переменной в равнении с контрольными значениями

Статистика показывает, что имеется достоверная ассоциация возраста, пола, этнической принадлежности и body mass index (BMI) с экспрессией ACE2 во многих тканях по сравнению с контрольными остальными 4 переменными (Figure 1i). Ассоциация с возрастом наиболее достоверна, за ней следует пол, затем этническая принадлежность (Asian versus others), а BMI, который негативно ассоциирован с экспрессией ACE2 в гое и желудке (Figure 1i).

ACE2 expression in different tissues in males, females of Asians, Africans, and Caucasians with age. Panels a–d and e–h are tissues where Asian females show significantly and moderately (marginally significant) higher expression than other groups, respectively. n, sample numbers in each group; k, p, and FDR are slope, p value and multiple testing corrected FDR of linear regression, respectively. The significance p values and FDR of the difference between Asians versus other ethnic groups are shown on top of the graphs. j, Summary statistics of association with each variable while controlling for other variables

Ген ACE2 человека в основном представлен двумя изоформами из 18 или 19 экзонов, при этом более длинная изоформа содержит дополнительный экзон на 5' конце. S белок короновируса, как известно, соединяется с ACE2 в регионах, кодируемых экзонами 1, 2 и 8 из большинства изученных 18 изоформ экзонов.

Мы впервые проанализировали модификации хроматина и ChIP-seq профиль связывание транскрипционного фактора (TF), чтобы идентифицировать ключевые регуляторные регионы в ~10 kb точки страта транскрипции (TSS) и +10 kb места окончания транскрипции (TTS) в гене ACE2. Помимо промоторного региона, маркированного H3K4me3и DNAse I hypersensitivity (regulatory region R2), мы также идентифицировали 4 энхансер-подобных элемента, маркированных с помощью H3K4me1, H3K27ac, DNAse I hypersensitivity или TF связывающими кластерами выше TSS (R1), ниже TTS (R5), между экзонами 8 и 9 (R3) (которые являются наиболее сильными и наиболее повсеместными среди разных типов клеток) и между 16 и 17 (R4), соотв. (Figure 2a) (Methods).

Transcription regulation of human ACE2 gene. (a) Cis regulatory elements. eQTL to ACE2 gene expression in the ACE2 TSS-10kb to TTS + 10 kb region are visualized together with chromatin modification ChIP-seq signals, DNAse I sensitivity sites and TF and chromatin state regulators ChIP-seq targets from ENCODE and ESR1, ESR2, and AR motifs identified by the FIMO function from MEME package. (b,c), The effect of estrogen (b) and testosterone (c) on ACE2 expression in mouse thymus and kidney, respectively

Затем мы подсчитали ACE2 eQTLs по данным GTEx для каждой ткани в регионе TSS-10 kb по TTS+10 kb гена ACE2 (Methods). Хотя eQTLs подсчитывали независимо, они сформировали 5 кластеров, удивительно соответствующих 5 регуляторным регионам. В частности, два ранее описанных SNPs (rs2074192 и rs2106809), которые ассоциируют с гипертензией левого желудочка (LVH) (Fan et al., 2019) попадают в R1 промотора и на R4, соотв.

Все наиболее достоверные eQTLs во многих тканях, включая головной мозг, нервы, артерии, яичники, жировую ткань и печень обладали высокой специфичностью (близкой к 100%) частот аллелей в Восточной Азии и все были позитивно скоррелированы с более высокой экспрессией ACE2 (Table 1). Это безусловно согласуется с достоверно более высокой экспрессией ACE2 у женщин из Восточной Азии по сравнению с др. этническими группами независимо от возраста (Figure 1).

Table 1. Top 38 most significant eQTLs in ACE2 TSS?10kb to TTS + 10kb contributing to ACE2 expression

Ранее сообщалось, что эстроген защищает от SARS инфекции у мышей (Channappanavar et al., 2017). Действительно ли экспрессия ACE2 регулируется эстрогеном или андрогеном (тестостероном). Интересно, что среди его регуляторных регионов имеется множество мотивов, связывающих эстрогенные рецепторы, и немного мотивов, связывающих андрогенные рецепторы. В частности, R1 и R4 содержат кластеры мотивов, связывающих множественные ESR, и многие ткане-специфические энхансеры маркируют их по сравнению с более повсеместным R3 (Figure 2a).

Чтобы определить, действительно ли половые гормоны, которые снижаются , могут регулировать экспрессию , мы исследовали базу данных GEO для данных по RNA-seq/microarray после воздействия эстрогене и андрогена. Среди этих данных мы обнаружили, что воздействие эстрогена достоверно увеличивает экспрессию ACE2 со средним значением 1.274 log2 fold в тимусе мышей (GSE2889, p = .005, FDR = 0.028, Figure 2b), тогда как воздействие андрогена (тестостерона) увеличивает экспрессию ACE2 в почках мышей. но со средним значением 0.533 log2 fold (GSE47181, p = .017, FDR = 0.137, Figure 2c). Интересно, что в то время как экспрессия ACE2 была высокой у детей и наивысшей у подростков и снижалась драматически у взрослых мужчин, мужчины трансгендеры, которые подвергались терапии эстрогеном (estradiol) и терапии по подавлению андрогенов (spirolactone) в течение 1 года, обнаруживали достоверно более высокой уровень экспрессии ACE2 и большинство клеток, экспрессирующих ACE2 обнаруживались в клетках Сертоли в яичках (Figure S2). Установлено, что экспрессия ACE2 сходным образом снижается с возрастом параллельно со снижением эстрогена и андрогена (Horstman, Dillon, Urban, & Sheffield?Moore, 2012).

В большинстве тканей человека у разных индивидов, вершиной среди наиболее богатых путей, транскрипционно скоррелированным противоположно с ACE2 инфекций Herpes simplex virus 1 (HSV1), в лёгких, является инфекция human papillomavirus (HPV) (Figure 3a, Figure S3). Гены, связанные с вирусной инфекцией, негативно коррелируют с экспрессией ACE2 в кишечнике, молочных железах и яичниках, включая APOBEC РНК (often viral RNA) редактирующие энзимы, и наиболее выдающимися являются многие транскрипционные факторы ZNF (потрясающе, но все содержат KRAB-ZNF транскрипционно репрессивный KRAB домен), которые часто непосредственно соединяются с эндогенными ретровирусными последовательностями (Table S2). По крайней мере, 3 KARB-ZNFs непосредственно соединяются с ACE2 R3 регионом (Figure S4). Удивительно, эти гены строго и позитивно коррелируют с экспрессией ACE2 в семенниках и поджелудочной железе (Table S2), но не в клетках протоков поджелудочной железы, где, скорее всего, KEGG негативно ассоциирует с экспрессией ACE2, и снова с инфекцией вируса герпеса (Figure S5d-e). Интересно, что в соответствии с анти-гипертензионной функцией ACE2's, метаболизм жирных кислот является основным путем, связанным с экспрессией ACE2 в толстом кишечнике и слюнных железах (Figure S3).

ACE2 expression is negatively with virus infection pathways and downregulation by inflammation cytokines and in T2D. (a) KEGG pathway enrichment of ACE2 correlated and anti-correlated genes in each tissue were determined by GSEA (Methods). (b) Dosage and time-dependent SARS-CoV infection on ACE2 mRNA level. (c-d), Suppression of ACE2 expression by IL-2 and IL-7 treatment in mouse T cells. (e) Reduction of ACE2 expression in T2D human pancreas ductal cells compared to age-matched controls as shown by scRNA-seq data. f, Fraction of ACE2 + cells among ductal cells and the average ACE2 expression per ACE2 + ductal cell in healthy and T2D individuals. ACE2 + cells are defined by normalized expression level > 0.01. k and p, slope and p value of linear regression to age, respectively. The significance p values of the difference between healthy and T2D groups are shown on top of the graphs. (g) ACE2 expression patterns projected on the t-SNE (t-distributed stochastic neighbor embedding) plot from type 2 diabetes and healthy pancreas single-cell RNA-seq data. (h) Schematic illustrations of the negative correlation of high basal ACE2 level with CoVID-19 severity/fatality at the population level (top, solid lines indicate our findings; dotted lines are knowledge derived from literature), and its anti-correlation with virus infection pathway expression levels, upregulation by sex hormones, and suppression by inflammatory cytokine at the molecular level (bottom). (i) A putative model illustrating the potential regulations and functions of the ACE2 gene. *Function of immunosuppressive peptide and their proposed action on macrophage and monocyte are from (Gallaher & Gallaher, 2020; Sarzi-Puttini et al., 2020)

Хотя за счет прямого связывания и потребления ACE2, экспрессия белка ACE2, как полагают, должна снижать инфекцию SARS-CoV (Kuba et al., 2005), это оказывается неожиданным, почему вирусная инфекция, которая не использует ACE2 в качестве рецептора, такая как HSV1, HIV или HPV, обнаруживает какие-либо позитивные или негативные корреляции с экспрессией ACE2. Экспрессия белка ACE2 репрессируется при повреждениях легких, вызываемых вдыханием кислот (Imai et al., 2005), H5N1 (Zou et al., 2014) и H7N9 (Huang et al., 2014), а ACE2 KO нокаутные мыши, как было установлено, оказываются более чувствительны к повреждениям легких, вызываемых вдыханием кислот (Imai et al., 2005), H5N1 (Zou et al., 2014), H7N9 (Yang et al., 2014) и SARS-CoV (Kuba et al., 2005). Мы установли, используя ранее опубликованные microarray базы данных для легких мышей после инфекции SARS-CoV (Gralinski et al., 2018; Totura et al., 2015), ACE2 мРНК временно увеличивается при низком титре SARS-CoV, но репрессируется при более высоких дозах или спустя определенное время после инфекции, спустя 4 дня даже самая низкая тестируемая доза супрессирует экспрессию ACE2 (Figure 3b). Тот факт, что ACE2 серьезно снижается в лёгких инфицированных SARS-CoV мышей согласуется с увеличением уровня AngII, приводя к сосудистой проницаемости и потере сосудистого гомеостаза (Kuba et al., 2005; Liu, 2020).

Т.к. цитокиновый шторм, как известно, подчеркивает тяжесть инфекции (Huang et al., 2020; Wan, 2020), мы были удивлены, когда некоторые из дифференциально экспрессируемых цитокинов у пациентов со средними или тяжелыми симптомами могли супрессировать экспрессию ACE2. Сюда входили достоверно увеличенные IL-2, IL-7, IL-10, G-CSF, IP-10, MCP-1, MIP-1a, и TNF-α у пациентов с тяжелыми проявлениями (Huang et al., 2020). Мы установили, используя публичные данные по экспрессии генов, что IL-7 достоверно снижает экспрессию Ace2 в CD4 T клетках мышей (GSE86542, logFC = ?1.386, p = .038, FDR = 0.282), а IL-2 снижает экспрессию Ace2 в индуцированных Treg клетках у бицистронных Foxp3/EGFP мышей (GSE14415, logFC = 0.962, p = .0003, FDR = 0.023) (Figure 3c and d). Т.к. T2D сильно связан с летальными исходами от COVID-19 (Yang et al., 2020), поэтому мы сравнили экспрессию ACE2 при T2D по сравнению с контролем. human subjects. Интересно, что экспрессия ACE2 достоверно снижена , по крайней мере, в жировой ткани женщин и мускулатуре мужчин, страдающих T2D (Figure S5a and b). Данные по RNA-seq одиночных клеток показали, что ACE2 экспрессируется в клетках протоков поджелудочной железы (Figure 3e-g and Figure S5), тогда как экспрессия ACE2 и фракция клеток ACE2 + во всех клетках протоков достоверно снижена у пациентов T2D (GSE83139, p = .00047 and 0.0032, соотв.). Фракция клеток ACE2 + также слегка уменьшается с возрастом, тогда как средняя экспрессия ACE2 в клетках протоков ACE2 + в основном не меняется с возрастом, но снижается при T2D (p = .00901, Figure 3f).

Наши находки шли вразрез с ожиданиями, исходящими из того, что ACE2 является единственным рецептором для вируса, вместо этого уровень её экспрессии оказался выше у Азиатских женщин и у молодых людей (Figure 1 and Table 1), которые, как известно, менее чувствительны и даже меньше имеют фатальных исходов, тогда как её уровень у мужчин низкий и ещё больше снижается с возрастом и при T2D, оба оказывают наибольшее влияние на плохие исходы (Figures 1 and 3), подтверждая на популяционно уровне негативную корреляцию между экспрессией ACE2 и тяжестью и фатальностью COVID-19.

Всё больше и больше исследований показывают, что COVID-19 является общим заболеванием, а мультиорганные дисфункции являются основой характеристикой для её тяжести и смертности (Chen, Wu, et al., 2020; Ruan, Yang, Wang, Jiang, & Song, 2020; Wang, Du, et al., 2020). Исследования показали, что SARS-CoV-2 атакует многие органы помимо легких, такие как сердечно-сосудистые органы, прямо или косвенно с помощью цитокинового шторма, который является главным фактором, управляющим пациентами в критических состояниях (Inciardi et al., 2020; Moore & June, 2020). Т.о., паттерны, которые мы установили для экспрессии ACE2 во многих органах, не ограничиваются легкими среди разных популяций и при разных условиях, это может объеснить, почему люди определенных популяций более чувствительны к тяжелым фатальным симптомам, чем др. после инфицирования. Более того, поскольку жировая ткань является основным органом генерации воспалительных цитокинов (Tchkonia et al., 2010), тот факт, что мы обнаруживаем наиболее достоверную зависимость от возраста и зависимость от этнической принадлежности различий в экспрессии ACE2 и eQTL в этой ткани подтверждает, что уровень экспрессии ACE2 в этой ткани может быть ассоциирован с цитокиновым штормом, наблюдаемым в тяжелых случаях.

На молекулярном уровне мы установили, что экспрессия генов, противодействующих экспрессии ACE2, в большинстве тканей и клетки, сильно обогащенный путями вирусной инфекции (Figure 3a), в них действие эстрогенов сильно, а андрогенов умеренно увеличивает экспрессию ACE2 в тканях мышей и людей (Figure 2), тогда как сильные, индуцируемые COVID-19, IL-2 и IL-7 репрессируют экспрессию ACE2 в T клетках мышей, а T2D снижает экспрессию ACE2 и количества ACE2 экспрессирующих клеток в тканях человека (Figure 3). После инфицирования SARS-CoV-2, IL-7 и IL-2 инфицированные индивиды обнаруживают достоверное увеличение (Huang et al., 2020; Liu, 2020). Количество CD4+ T клеток и Treg клеток у пациентов в критическом состоянии обнаруживает тенденцию к снижению (Chen, Qi, et al., 2020; Qin et al., 2020; Zhou, Fu, et al., 2020). Мы наблюдали, что уровень ACE2 в CD4 T клетках и в Treg клетках снижается у мышей после воздействия IL-7 и IL-2, соотв., это указывает на то, что цитокиновый шторм от SARS-CoV-2 у пациентов с тяжелыми симптомами может снижать ACE2, что в свою очередь наносит вред CD4+ T и Treg клеткам. В соответствии с этим результаты аутопсии демонстрируют крупно-масштабные и распространенные повреждения органов, таких как селезенка и лимфатические узлы, в которых эти клетки располагаются (Cao, 2020; Shi et al., 2020). Эффекты эстрогена, андрогена и цитокинов опосредуется кластерами эстрогеновых и андрогеновых рецепторов, STAT5, JUN, MYC и др. TFs, связывающимися с регуляторными регионами ACE2, тогда как гипертензионные QTLs и огромное большинство ACE2 eQTLs также картированы там же. Наконец, eQTLs, которые обнаруживают огромные различия в частотах аллелей между этническими группами также обнаруживают тесную до полной пенетрантности в Восточной Азии и также наивысшие позитивные значения eQTLs для экспрессии ACE2 (Table 1). Полученные результаты подтверждают, что , по крайней мере, эстроген может вносить вклад в более высокую экспрессию ACE2 у Азиатских женщин, чем Азиатских мужчин (Figure 3i), поэтому воздействие эстрогена одного или вместе с андрогеном драматически блокирует индукцию экспрессии ACE2 (Figure 2b and Figure S2), а снижение половых гормонов может вносить вклад в снижение экспрессии ACE2 с возрастом (Figure 3i), и эстроген и андроген могут увеличивать экспрессию ACE2, хотя эстроген действует сильнее (Figure 2b).

Мы проанализировали тысячи образцов, но выборки всё ещё недостаточны. Необходимо также отметить, что мы исследовали изменения только на уровне мРНК ACE2, показывает ли её белковый уровень сходные изменения, необходимы дальнейшие исследования и многие изменения ACE2 не происходят в лёгких, ключевой подверженной ткани при COVID-19, фактически легкие не обнаруживают высокой экспрессии ACE2 по сравнению с многими др. тканями. Прямая связь SARS-CoV-2 с белком ACE2, т.к. рецептор вируса может также снижать уровни белка ACE2. Преже чем будет доступна эффективная вакцина от SARS-CoV-2 инфекции, главная цель- понять вариации в тяжести и фатальности инфекции. Низкая активность ACE2 может быть повышена путем погашения его нижестоящих негативно регулируемых мишеней, таких как angiotensin II или его рецепторов, таких как angiotensin II антагонист losartan (Yan et al., 2015). Данное исследование вызывает больше вопросов, чем ответов, однако важно понять, как COVID-19 (и др. вирусы) взаимодействуют с ACE2 связанным воспалением.

Итак, наши данные подтверждают негативную корреляцию между экспрессией ACE2 и смертностью от COVID-19 как на популяционном, так и молекулярном уровне. Эти результаты могут оказаться важными при разработке потенциальных стратегий предупреждения и лечения по связыванию ACE2 с коронавирусами в целом.