Доминантные мутации избыточной функции отвечают за примерно 36% от всех известных на сегодня генетических болезней, согласно базе данных OMIM. Мы сосредоточились на увеличении повторящихся последовательностей при нейродегенеративных болезнях и аутосомно доминантной мутации V30M/V112I в TTR, гене, экспрессирующемся в печени и вызывающем семейную amyloid polyneuropathy (1). CRISPR и Cas9 технология редактирования гена проложила путь для эффективной персонализованной генотерапии (2-4), но генотерапия доминантных нарушений затруднительна из-за доминантного негативного эффекта аллеля, вызывающего болезнь.

Наиболее многообещающие подходы к генотерапии доминантных нарушений связаны с целенаправленным блокированием или замещением доминантного аллеля, вызывающего болезнь с помощью аллель-специфического нокаута или homology-directed repair (HDR). Ряд успешных примеров инактивации или коррекции доминантной мутации с помощью CRISPR/Cas9 описан для таких патогенных вариантов гена Dynamin 2 (DNM2), который вызывает centronuclear myopathies (CNMs) (5); мутация одиночного нуклеотида (P23H) в rhodopsin (RHO), мутация, вызывающая Retinitis Pigmentosa (RP) (6); мутация одиночного нуклеотида гене кератина 14 (KRT14), приводящая к генерализованному тяжелому epidermolysis bullosa simplex (7); для патогенных вариантов DFNA36, вызывающих доминантную прогрессирующую потерю слуха (8); и Шведская мутация в гене amyloid precursor protein (APP), которая вызывает семейную форму болезни Альцгеймера (AD) (9). Однако, поскольку CRISPR/Cas9 может допускать 1-3 несовпадения между gRNA spacer и сайтом мишенью, а большинство доминантных генетических нарушений вызывается точечными мутациями (10), а подход со spacer-опосредованным аллель-специфическим нокаутом будет, скорее всего, вносить изменения в оставшийся здоровый аллель (11). Чтобы преодолеть это затруднение, некоторые исследования недавно продемонстрировали, что высоко специфическое искоренение доминантной мутации может осуществляться с помощью protospacer adjacent motif (PAM)-опосредованного аллель-специфического CRISPR редактирования гена (12-14). По сравнению с spacer-опосредованным аллель-специфическим нокаутом, PAM-опосредованный подход является более специфичным, поскольку сохранность и присутствие канонической PAM последовательности является критическим для активности редактирования ДНК с помощью CRISPR-Cas9 (15). Однако, для доминантных нарушений, вызываемых увеличением повторов, целенаправленное воздействие на повторяющиеся регионы (напр., экспансия CAG в гене huntingtin, HTT) неосуществимо.

Присутствие PAM-позиционирующего single-nucleotide polymorphisms (SNP), которые приводят к противоположному функционированию PAM (или активный или dead PAM), как было установлено, приводят к чрезвычайно ценному, точному аллель-специфичному редактированию гена (13). Однако, существует одно требование к этому подходу - это идентичность гаплотипа, который представляет болезнь-вызывающую мутацию, и активный PAM аллель. Это даже более затруднительно, если allele-specific PAM (asPAM) аллель расположен на удаленном положении от мутации, вызывающей болезнь. Хотя long-read next-generation sequencing (NGS) методы, представленные, напр., Oxford Nanopore, Bionano Genomics and PacbBio могут быть пригодны для гаплотипирования, этот альтернативный метод, который подъемный по цене и может быть адаптирован любой группой исследователей под свои нужды. Ранее мы наблюдали, что хромосомная ДНК, которая делетируется с помощью пары CRISPRs, может формировать внехромосомную циркулярную ДНК (eccDNA) в клетках (16). в соединении eccDNA, два региона (концы), которые обычно удалены др. от др. теперь оказываются поблизости. Мы поэтому разработали in vivo базирующийся на CRISPR метод (CRISPR-hapC) для haplotype phasing.

Чтобы далее скомбинировать CRISPR-hapC и PAM-опосредованное аллель-специфическое или гаплотип-специфической CRISPR редактирование генов для большого спектра доминантных мутаций, мы сформировали базу данных SNPs для asPAM CRISPR редактирования генов. Эта asPAM CRISPR база данных содержит высокой частоты (частота аллеля более 30%) PAM-презентирующие SNPs, которые дают или активные или dead PAMs для 4-х наиболее широко используемых CRISPR систем. Мы приспособили asPAM CRISPR и CRISPR-hapC системы, чтобы вызывать гаплотип-специфическое редактирование двух генов человека (HTT и TTR) в клетках человека, демонстрируя пригодность системы asPAM-hapC и комплементарных методов для разработки и оптимального выбора высоко специфического и эффективного редактирования доминантных нарушений.

Целенаправленная инактивация и замещение доминантных мутаций, вызывающих болезнь, являются ведущими направлениями в генотерапии доминантных нарушений. Для большинства доминантных болезней, вызываемых увеличением повторов, таких как HTT, сегодня нет лечения. Здесь мы описали подход asPAM CRISPR редактирования генов и продемонстрировали успешное использование системы asPAM CRISPR для индукции гаплотип-специфических делеций при экспансии CAG аллеля гена huntingtin и TTR мутантного аллеля на моделях клеток человека. Для преодоления некоторых технически узких мест в гаплотип-специфическом CRISPR редактиовании генов, мы разработали (i) метод CRISPR-hapC для гаплотипического phasing между мутацией, вызывающей болезнь, и дистальными asPAM SNPs; (ii) была создана asPAM CRISPR база данных, позволяющая осуществлять простую для исполнения селекцию с высокой частотой asPAM SNPs и CRISPR для любого гена; (iii) использован метод, базирующийся на генотипировании eccDNA для оценки результатов CRISPR редактирования генов; (iv) продемонстрировано, что комбинация CRISPR-hapC и asPAM CRISPRs может быть использована для достижения высоко специфического и гаплотип-специфического редактирования генов HTT и TTR в клетках человека.

Одной из важных технологических инноваций в данном исследовании стал удобный, гибкий и допустимый по средствам базирующийся на CRISPR метод (CRISPR-C-hapC) для гаплотипирования. Как было продемонстрировано в нашем исследовании, гаплотипирование двух аллелей может быть осуществлено с помощью CRISPR-hapC по нескольким сотням bp среди 200 Mb. Метод CRISPR-hapC предоставляет ценную альтернативу существующим методам гаплотипирования, таким как long-read nanopore sequencing (41) и single molecule real-time (SMRT) sequencing (42). По сравнению с next-generation sequencing (NGS) одиночных молекул метод CRISPR-hapC обладает низкой производительностью, но может служить как ценный комплементарный подход для целенаправленного гаплотипирования и специфического использования и гаплотип-специфичесого CRISPR редактирования гена, как это было показано в данном исследовании. Адаптация метода CRISPR-hapC научным сообществом сможет в дальнейшем расширить haplotype phasing и базирующиеся на CRISPR подходы.

Следует отметить, что количество копий генов или полиплоидия хромосом д. оказывать эффект на использование и интерпретацию результатов CRISPR-hapC метода. Сегодня CRISPR-hapC метод базируется на присутствии только двух гаплотипов в клетке. В нашем исследовании мы применили CRISPR-hapC метод для картирования гаплотипов из 6 SNPs на хромосоме 1 (diploid) в клетках HEK293 и гена HTT (две копии) в клетках Hela. Для TTR генов, по-видимому, имеется три копии в клетках HepG2#21 (Supplementary Figure S11B). Однако, две копии гена TTR, несут один и тот же гаплотип, и это позволяет использование CRISPR-hapC для TTR asPAM CRISPR редактирования. Др. важное замечание заключается в том, что если возникают обусловленные появлением хромосомных кроссоверов во время мейоза, de novo мутации или динамические мутации увеличенных повторов, такие как при синдроме ломкой Х, то родительский гаплотип, представляющий аллель, вызывающий болезнь и активный PAM аллель, могут быть повреждены. Т.о., гаплотип-специфическое asPAM CRISPR редактирование генов действительно является персонализованным подходом.

Потенциальные эффекты вне мишени, вызываемые CRISPR, стали главной проблемой при переносе этой технологии в клинику, поскольку инактивация генов, супрессирующих опухоли, или активация proto-oncogenes, могут приводить к вредным последствиям (43). Homology-directed repair (HDR) и allele-specific inactivation (ASI) являются двумя основными широко используемыми подходами при CRISPR редактировании доминантных мутаций. Базируясь на эндогенном базирующемся на HR аппарате репарации ДНК, HDR подход может восстанавливать нормальную функцию мутантного гена, но это затруднено относительно низкой эффективностью (~100-раз ниже по сравнению с NHEJ-опосредованным нокаутом гена) (44,45). Созданы многие усовершенствования, такие как добавление NHEJ-репрессора или молекул, усиливающих HDR (46-49), модификации HDR вектора и способа доставки (50-52) и преобразования HDR-proficient Cas9 рекомбинантных белков (53-55). Для доминантных нарушений, коррекция или разрушение мутантного аллеля без изменения остающейся копии дикого типа является важным. Концепция аллель-специфического редактирования была предложена для различения мутантного аллеля и аллеля дикого типа с помощью CRISPR/Cas9 (56,57). Большинство попыток ASI базировалось на позиционировании SNPs на CRISPR gRNA spacer (58). Мы и др. группы показали, что CRISPR/Cas9 может не воспринимать до трех несовпадений в spacer (18,59), тогда как активность CRISPR по редактированию гена очень сильно зависит от присутствия канонического PAM. Как теперь доказано на 21 asPAM CRISPR локусах, asPAM CRISPR может четко различать активный и dead PAMs и что более важно, вызывать разрезы только на активном PAM локусе и вызывать высоко-точные гаплотип-специфические делеции доминантного мутантного аллеля. Подобно др. базирующимся на CRISPR подходам по редактированию генов, только asPAM CRISPRs могут быть использованы для терапевтического воздействия, их специфичность должна быть тщательно исследована с помощью методов детекции эффектов не мишени по всему геному, таких как GUIDE-seq и CIRCLE-seq (28,29).

Мы продемонстрировали на двух моделях болезни, HTT CAG экспансии и TTR exon 2 мутации, при которые очень строгое гаплотип-специфическое редактирование может быть достигнуто с помощью CRISPR-hapC и asPAM CRISPR на модельных клеточных линиях человека. В качестве проверки концепции мы выбрали универсальную gRNA, которая соединяется по соседству с локусом, вызывающим болезнь, чтобы продемонстрировать гаплотип-специфическое редактирование с помощью asPAM CRISPRs. Т.к. универсальная gRNA должна целенаправленно воздействовать на оба аллеля, то улучшенная стратегия, использующая присоединение asPAM CRISPRs , должна ещё сильнее снижать потенциальные эффекты вне мишени. Далее необходима проверка in vivo с доставкой вирусами у животных моделей.

Итак, мы описали новый базирующийся на CRISPR метод (CRISPR-hapC) для гаплотипирования. Базируясь на генерации (with a pair of CRISPRs) внехромосомных циркулярных ДНК в клетках, CRISPR-hapC может картировать гаплотипы среди нескольких сотен оснований более чем 200 Mb. Мы сгенерировали базу данных с высокой частотой asPAM SNP иCRISPR (www.crispratlas.com/knockout) для CRISPR систем (SaCas9, SpCas9, xCas9 и Cas12a). Мы показали, что asPAM CRISPRs могут специфически различать активные и dead PAMs для всех 23 протестированных локусов. Комбинация CRISPR-hapC и asPAM CRISPRs продемонстрировала также способность вызывать очень аккуратные и гаплотип-специфические делеции в HTT CAG расширениях и в мутациях TTR exon 2 в клетках людей.