Система CRISPR/Cas9 привлекает большое внимание как многообещающий подход к целенаправленным генетическим изменениям в клетках эукариот. Это РНК-ведомый редактирующий геном инструмент, представленный нуклеазой, Cas9, и single-guide RNA (sgRNA), которая распознает ДНК мишень и наводит белок Cas9 на локусы мишени, находящиеся по соседству с protospacer adjacent motif и вызывают сайт-специфические двнитчатые разрывы, которые впоследствии репарируются или с помощью nonhomologous end-joining, которое более эффективно, или с помощью более точной homology-directed репарации на присутствующей донорской матрице.^1,2 Хотя это не первая геном редактирующая стратегия, но CRISPR-Cas9 предоставляет более мощный инструмент, легкий в использовании, с сайт-специфической активностью и ограниченными эффектами вне мишени.² Её потенциал использования в медицине вполне достаточный, варьирующий в пределах от разрушения мутантного аллеля при раке³ или репарирования мутантных аллелей, вызывающих моногенные нарушения, такие как мышечная дистрофия⁴ или серповидно-клеточная анемия.⁵ Сегодня пре-клинические исследования клеточной терапии используют CRISPR-Cas9 стратегии геномного редактирования, или посредством ex vivo редактирования клеток, сопровождаемого их трансплантацией пациентам, или редактирования in vivo клеток пациентов; однако, существуют проблемы, связанные с безопасностью и эффективностью. Первоначальные исследования по переносу генов показали строгую иммунную реакцию хозяина, это ограничивало их терапевтическое использование. Редактирование генов подвержено подобным же рискам, связанными с иммунным распознаванием, прежде всего доставляющего вектора, затем компонентов геномного редактирования, Cas9 и sgRNA, и, наконец, экспрессия отредактированного гена. Здесь мы сконцентрируемся на иммунной реакции хозяина на нуклеазу, Cas9.^6,7

2 наиболее широко используемых Cas9 ортолога происходят от Staphylococcus aureus (SaCas9) или Streptococcus pyogenes (SpCas9), оба являются широко распространенными коменсалами у человека, которые могут стать патогенными, напр., вызывать острый фарингит. Приблизительно, 40% популяции у людей колонизировано S. aureus8 и 12% детей до 18 лет обнаруживает бессимптомную колонизацию S. pyogenes.⁹ Безусловно, как гуморальный, антителами обусловленный, так и клеточный, обеспечиваемый T клетками иммунитет действует против S. aureus и S. pyogenes у 80% здоровых индивидов.^10,11 Однако, большинство из этих реакций направлено на секретируемые белки и белки, обнаруживаемые на поверхности мембраны бактерий, которые легко доступны для иммунной системы. Поскольку Cas9 является внутриклеточным белком, а большинство терапевтических вмешательств имеет целью временную экспрессию или доставку рекомбинантной Cas9 прямо в клетки мишени, то можно предположить, что anti-Cas9 антитела будут ничтожно малыми.¹² В противовес этому предположению, Wang et al, в своем важном исследовании наблюдали появление SpCas9 специфических антител на 14 день после аденовирусной доставки Cas9. Их целью было нарушение экспрессии Pten в гепатоцитах, тем самым получали мышиную модель неалкогольного steatohepatitis человека.¹³ Как только происходило успешное редактирование генома, то наблюдались подтипы антител IgG1, IgG2a и IgG2b, указывая на иммунную реакцию хозяина на аденовирусную Cas9. Более того, Chew et al.¹⁴ продемонстрировали, что независимо от способа доставки, экспрессия Cas9 у мышей вызывала иммунный ответ (Fig. 1). Экспрессирующие Cas9 мышцы обнаруживали в результате увеличение CD45+ лейкоцитов, особенно миелоидных клеток (CD11b+Gr1- моноцитов, макрофагов и субнаборов дендритных клеток) и Т клетки (CD3+CD4+ и CD3+CD8+). Интересно, что они идентифицировали 4 T клеточных рецепторных β-цепочных типа клонов, которые были общими у всех подвергшихся действию Cas9 животных, из них один clonotype был общим у всех животных и распознавался как настоящий, реагирующий на Cas9 (Fig. 1, right).

Figure 1. The immune response to Cas9. Injection of CRISPR machinery triggers an innate and adaptive immune response.

Итак, были продемонстрированы прирожденные и приобретенные адаптивные клеточные иммунные реакции на Cas9 у мышиных моделей и присутствие anti-Cas9 антител и Т клеток в плазме у людей. Наличие иммунитета против Cas9 может снижать её эффективность in vivo и ставит важный вопрос о безопасности.