Внешние гениталии млекопитающих являются важными органами для эйякуляции, внутреннего оплодотворения. Внешние гениталии начинают свое развитие с придатков, похожих по положению с конечностями.¹ Кроме того, придатки внешних гениталий представляют собой половые диморфные органы.^{2, 3} Генитальный бугорок (GT) является зачатком наружных гениталий и является общей структурой у самцов и самок.^{1, 4} GT дифференцируется в пенис у самцов и клитор у самок.⁵ Процесс его развития подразделяется на две фазы: фаза независимого роста от андрогенов (мужские гормоны и андроген=зависимую фазу дифференцировки. В случае мышей, GT инициирует выпячивание из региона клоаки на день эмбриогенеза (E)10.5 и выглядит оно как почкообразная структура на ст. E11.^5.6 Морфологические различия между самцами и самками не проявляются вплоть до E15.5. Половая дифференцировка GT начинается со ст. E16.5 и зависит от действия андрогенов.

Эпителиально-мезенхимные взаимодействия (EMI) играют важную роль в органогенезе.^7-10 Считается, что сходные механизмы развития законсервированы для развития конечностей и и GT.^{1, 11, 12} Временно формируемые сигнальные эпителии являются существенными для выроста обоих придатков, конечностей и наружных гениталий.^{1, 13} Развитие конечностей позвоночных зависит от становления и поддержания апикального эктодермального гребня (AER), специализированной эктодермальной структуры на дистальном кончике зачатка конечности. Fibroblast growth factor 8 (Fgf8) экспрессируется в AER и является важным для развития конечностей. Инактивация функции Fgf8 в эктодерме ранней конечности вызывает задержку экспрессии Sonic hedgehog (Shh).¹⁴ Более того, некоторые сообщения предоставили доказательства, что FGF8, происходящий из AER важным для индукции и поддержания экспрессии Shh в мезенхиме.¹⁵ Передача сигналов др. фактора, такого как передача сигналов Bone morphogenetic protein (Bmp) также важна для развития конечностей. Предыдущие исследования показали, что BMP4 из мезенхимы и его рецептор BMP receptor type1a (Bmpr1a), в эктодерме обязателен для формирования AER.^{16, 17}

Рост и дифференцировка GT также нуждаются в скоординированной регуляции передачи сигналов ростовых факторов, включая Fgfs, Wnt/β-catenin, Hedgehog, Bmps.^18-23 В случае GT, дистальный эпителий уретры (DUE), расположенный на дистальном кончике GT является преходящей структурой, регулирующей рост GT, и эта структура обнаруживается со ст. E11.5 до E14.0.^{6, 20, 23} Fgf8 экспрессируется в DUE из GT. Хирургическое удаление DUE, маркированного экспрессией Fgf8 приводит к дефектам роста GT, при этом снижается экспрессия мезенхимных генов в окружении DUE.²⁰ Т.о., DUE регулирует рост GT и важен для структуры EMI во время роста GT.²⁰ Shh экспрессируется в клоаке на ст. E10.5 , а в последствие экспрессируется в уретральной пластинке на ст. E11.5.^{6, 19} Shh нокаутные (KO) мыши обнаруживают агенез GT и снижение экспрессии Fgf8, демонстрируя потребность в передаче сигналов Shh для инициации роста GT и формирования DUE.¹⁸ Помимо Fgf8 и Shh, некоторые гены, такие как Wnt5a, p63, Hoxa13 и Hoxd13 были идентифицированы как позитивные регуляторы роста GT.^23-26

Сообщалось, что передача сигналов Bmp выступает в качестве негативного регулятора роста GT.²³ Некоторые Bmp гены экспрессируются в DUE и окружающей его мезенхиме. Передача сигналов Bmp посредством Bmpr1a подавляет рост GT. Принимая во внимание, что передача сигналов Bmp необходима для формирования AER конечностей, передача сигналов Bmp может играть ключевую роль в формировании DUE. Однако, это не исключает возможности действия передачи сигналов Bmp при необходимости в инициации роста GT, включая формирование DUE во время развития GT. Мы установили, что Bmp4 экспрессируется в регионе клоаки на ст. E9.5, перед началом роста GT. Такой паттерн экспрессии подвинул нас исследовать возможность, что Bmp4 играет роль в формировании DUE. В предыдущих сообщениях также было установлено, что Bmp4 является важным фактором роста не только для формирования придаточных органов, но и также др. органов, таких как сердце и внутреннее ухо.^{4, 27-29} Более того, было также установлено, что Bmp4 KO мыши погибают до ст. E9.5.³⁰ Здесь мы установили новую функцию гена Bmp во время развития GT путем анализа Bmp4 conditional мутантных мышей. Bmp4 conditional KO (cKO) мыши, лишенные ранней экспрессии до начала роста GT, обнаруживали дефекты роста GT со снижением экспрессии генов, способствующих росту, таких как Wnt5a, p63 и Hoxd13. Более того, Bmp4 cKO мыши, лишенные экспрессии Fgf8, обнаруживали дефекты формирования DUE. Следовательно, Bmp4 важен для регуляции инициации роста GT.

Передача сигналов разных факторов роста играет критическую роль в органогенезе аппендикулярных выростов, таких как конечности, наружные гениталии.^{1, 39} Сообщалось, что мутантные модели передачи сигналов факторов роста, таких как Hedgehog, Wnt/-βcatenin, Fgfs и Bmps, обнаруживают аномалии развития GT.^{18-20, 23, 35, 40, 41} Нами было предположено, что передача сигналов Bmp негативно регулирует рост GT.²³ У мышей развитие GT инициируется на ст. E10.5 и он появляется в виде почко-подобной структуры примерно на ст. E11.5.^{1, 4, 6} После формирования структуры GT на ст. E12.0, экзогенно-вводимый BMP4 супрессировал экспрессию Fgf8 в DUE, и экспрессию Wnt5a и cyclinD1 в мезенхиме.²³ Более того, Bmpr1a KO мыши (мутантные по type 1a receptor of Bmp4 мыши) обнаруживали гиперплазию GT.²³ Напротив, мутантные по гену Noggin мыши, антагонисту активности BMPs, обнаруживали гипоплазию GT со снижением экспрессии позитивных регуляторов, таких как Fgf8 и Wnt5a.²³ Эти данные подтверждают, что передача сигналов Bmp негативно регулирует рост GT.

Во время инициации роста GT функции Bmp4 не были проанализированы. Здесь было установлено, что Bmp4 экспрессируется в регионе клоаки на ст. E9.5, до начала роста GT. Было подтверждено, что Bmp4 KO погибают до ст. E9.5.³⁰ Более того, эмбрионы, гомозиготные по нулевому аллелю Bmp4 не имеют примордиальных зародышевых клеток. При этом количество сомитов снижено и у таких мутантов присутствуют задние дефекты.^{42, 43} Hoxa3-опосредованная Cre recombinase экспрессируется во все каудальной области.¹⁸ Более того, мы идентифицировали её экспрессию в регионе клоаки, включая эпителий и мезенхиму. Т.о., линия мышей Hoxa3 Cre/+ подходит для генерации Bmp4 cKO мышей. чтобы проанализировать функцию Bmp4 до начала роста GT. Мы наблюдали, что Hoxa3-Cre-mediated Bmp4 cKO приводит к гипоплазии GT на ст. E12.5. Hox гены (Hoxa13 и Hoxd13) экспрессируются в GT мезенхиме и важны для развития аппендикулярных органов, таких как конечности и наружные гениталии.26, 44, 45 Более того, Wnt5a также экспрессируется в GT мезенхиме.²³ Wnt5a также играет критическую роль а развитии вырастающих органов, включая GT.^{21, 23, 46} Hoxa13/Hoxd13 двойные мутантные мыши и Wnt5a мутантные мыши обнаруживают агенез GT и гипопластические конечности.^{21, 23, 26} Bmp4 cKO мыши обнаруживают выраженную редукцию экспрессии Wnt5a и Hoxd13 на ст. E11.5, подтверждая, что Bmp4 позитивно регулирует инициацию роста GT и экспрессию мезенхимных факторов, таких как Wnt5a и Hoxd13.

Временно формируемый сигнальный эпителий, как полагают, регулирует присущий органогенез, такой как зубы, конечности и GT. Эмалевые узелки. напр., временно сформированный эпителий регулирует рост и морфогенез зубных коронок.⁴⁷ AER находится на дистальном кончике зачатка конечности и существенен для проксимо-дистального роста и формирования паттерна конечности.⁴⁸ DUE, расположен на дистальном кончике GT, это временно формируемый эпителий.¹ Показано, что DUE играет существенные роли в контроле экспрессии мезенхимных генов и способствует выросту GT.^{19, 20, 37}

Разные сигнальные гены, такие как Fgfs, Bmps, Wnts и Hedgehog обычно экспрессируются в таких эпителиальных структурах. Считается, что Fgf8 выполняет критические роли в органогенезе структур, таких как конечности и GT.^{1, 27} FGF8 из AER необходим для нормального развития конечностей.¹⁴ Более того, Prx1-Cre-обусловленные mesenchymal Bmp4 cKO мыши обнаруживают дефект формирования AER конечности и лишены экспрессии Fgf8. Это показывает, что Bmp4 необходим для инициации выроста зачатка конечности.¹⁷ Роль передачи сигналов BMP со временем изменяется с момента инициации зачатка конечности и во время формирования AER.⁴⁹ В случае GT, Fgf8 начинает экспрессироваться в DUE на ст. E11.5, а удаление дистальной части GT, включая DUE, супрессирует вырост GT.²⁰ Предполагается, что FGF из DUE также необходим для непрерывного роста GT. Эти результаты подтверждают, что Fgf8 экспрессируется во временно сформированных эпителиальных структурах, таких как AER и DUE. Данное исследование показывает, что гипоплазия GT на ст. E12.5 с редукцией экспрессии Fgf8 и активности ERK у Bmp4 cKO мышей подтверждает, что Bmp4 необходим для формирования DUE.

Транскрипционный фактор p63 относится к членам семейства p53 и необходим для аппендикулярных органов, таких как конечности и наружные гениталии.^{24, 38} Сообщалось, что p63 KO мыши обнаруживают гипоплазию GT с редукцией экспрессии Fgf8 в DUE.^{24, 38} У Xenopus, p63 , который регулируется с помощью передачи сигналов Bmp4, необходим для эпидермального развития.⁵⁰ Данное исследование показало, что происходит снижение экспрессии p63 в эпителии клоаки у Bmp4 cKO мышей. Эти результаты подтверждают, что Bmp4 контролирует образование DUE посредством контроля экспрессии p63 в эпителии клоаки во время инициации выроста GT.

Shh KO мыши обнаруживают агенез GT.^{18, 19} β-catenin , как известно, является ключевой молекулой для инициации выроста GT.^{18, 51} β-catenin может играть роль как нижестоящий ген передачей сигналов Shh во время роста GT.¹⁸ ранее было установлено, что Smad4-опосредованная передача сигналов Bmp необходима для экспрессии Shh во время раннего развития зубов и постнатального развития корней (root).^{52, 53} В данном исследовании мы показали, что экспрессия Shh не затрагивает региона клоаки у Bmp4 cKO мышей. Более того, экспрессия Bmp4 также не затрагивала региона клоаки у Shh KO мышей.¹⁹ Эти результаты подтверждают, что Bmp4 регулирует формирование DUE независимо от передачи сигналов Shh. Это может указывать на предположительно разные взаимоотношения между передачей сигналов Shh и Bmp во время формирования GT. Следовательно, Bmp4 играет критическую роль в формировании временно формируемого сигнального эпителия в придаточных органах, включая конечности и наружные гениталии.

Итак, нами выявлены новые аспекты функционирования Bmp4 во время выроста GT. Мы обнаружили экспрессию Bmp4 уже в регионе клоаки на ст. E9.5, до возникновения выроста GT. Hoxa3 Cre/+; Bmp4 flox/flox мутантные мыши обнаруживают гипоплазию GT с редуцированной экспрессией генов, способствующих возникновению выроста, таких как Wnt5a, Hoxd13 и p63, тогда как экспрессия Shh его не затрагивала. Формирование DUE, отмечаемое экспрессией Fgf8, является важным для контроля экспрессии мезенхимных генов в GT и впоследствии для его роста. Более того, экспрессия Fgf8 оказывалась драматически сниженной у таких мутантных мышей, указывая на дефект формирования DUE. Следовательно, Bmp4 является важным фактором роста для инициации образования выроста GT , независимо от передачи сигналов Shh. Т.о., Bmp4 позитивно регулирует формирование DUE.