Трансплантации гематопоэтических стволовых клеток (HSC) известная стратегия для воздействия или лечения ряда врожденных и благоприобретенных заболеваний. Однако, трансплантации аллогенных HSC ограничены из-за отсутствия подходящих доноров и значительного риска заболеваемости и смертности, возникаемой условно-патогенной инфекцией, неспособностью приживления и graft-versus-host disease (GVHD). В последние годы аутологическая HSC-нацеленная генотерапия возникла как альтернатива трансплантациям аллогенных HSC при первичном иммунодефиците, гемоглобинопатиях, нарушениях хранения и метаболизма, врожденной цитопении и дефиците стволовых клеток.^1-8 При HSC генотерапии аутологичный костный мозг или мобилизированные клетки периферической крови собираются, очищаются, чтобы получить фракцию CD34+ эти клетки затем трансдуцируются ретровирусными векторами с интересующим кодирующим терапевтическим геном . Модифицированные клетки затем вводят обратно пациенту с соотв. поддерживающей химиотерапией.⁹ Трансплантированные HSCs способны продуцировать откорректированные клетки крови многих клонов в течение всей жизни пациента, тем самым создается одноразовое лечение. При использовании аутологичных клеток, генотерапия преодолевает потребность в гистосовместимых донорах, риске GVHD и необходимости долговременной иммуносупрессии.

Первое успешное испытание генотерапии было осуществлено в 2000 а отношении лечения X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID).⁶ Впечатляющие результаты, полученные в этих ранних испытаниях могут быть приписаны молодому возрасте пациентов и селективным преимуществам модифицированных по гену клеток у больных СПИДом (immunocompromised) пациентов, достигших фенотипической коррекции даже при низких уровнях трансдукции. Напротив, генотерапия для др. нарушений д. преодолеть дополнительные барьеры, такие как необходимость в высоком уровне получения генов и приживления модифицированных по гену клеток и присутствие компетентной иммунной системы. В то время как использование аутологичных клеток при генотерапии избегает тяжелых иммунных осложнений, связанных с аллогенными HSC, трансгеном кодируемые белки могут быть распознаны как чужеродные иммунной системой пациента, приводя в принципе к элиминации трансдуцированных клеток. В самом деле, иммунные ответы на трансгенные белки и происходящие из векторов элементы были описаны во многих поликлинических и клинических условиях.10-14

Для получения клеточного иммунитета к генетически модифицированным HSCs, пептидам, полученным из внутриклеточных трансгенных элементов, которые преобразованы и представлены с помощью major histocompatibility complex (MHC) class I молекул T клеткам, т.е. необходима генерация Т клеточных иммунных реакций на клетки, экспрессирующие трансген. Кроме того, трансгенные белки могут быть преобразованы с помощью антиген-презентирующих клеток и представлены с помощью MHC class II, приводя к активации B-клетками обеспечиваемых гуморальных реакций с помощью продукции специфичных для трансгена антител. Когда происходит иммунологическое отторжение трансдуцированных клеток, экспрессирующих внутриклеточный GFP, то наблюдаются как GFP-специфическая cytotoxic T lymphocyte (CTL) реакция, таки и продукция антител при генотерапии rhesus модели.^15-8 Как клеточные, так и гуморальные иммунные реакции, ассоциированные с нацеленной на HSC генотерапией; однако, тип сила иммунных реакций может зависеть от многих факторов, таких как локализация и иммуногенность трансгеннных продуктов, а также тканевая специфичность и уровни экспрессии трансгена.

Специфическая толерантность к аллотрансплантатам или ксенотрансплантатам у реципиентов может быть индуцирована вследствие трансплантации аллогенных или генетически модифицированных HSCs.^19-24 Возникновение молекулярного химеризма у реципиентов приводит к возникновению толерантности в результате или центрального или периферического механизма.¹⁹ Однако, сообщения об иммунных реакциях на генетически модифицированные HSCs показывают, что иммуносупрессия может быть необходима чтобы осуществить приживление HSCs прежде чем наступит долговременная толерантность к трансгену. Высокая доза тотального облечения (TBI), которая является как миелосупрессивной, так и иммуносупрессивной, как было установлено, вызывает стабильное приживление ген-модифицированных HSCs (Figure 1A).^25-27 При использовании busulfan кондиционирования, которое прежде всего является миелосупрессивным, степень различий между не модифицированными и модифицированными клетками, по-видимому, диктует многообещающую трансген-специфическую иммуносупрессию.¹⁷ Т .о., только лишь busulfan кондиционирование делает возможным приживление HSCs, экспрессирующих минимально иммуногенные белки, но это не обязательно предупреждает иммунные реакции на ксенотрансплантаты или прирожденно отсутствующие белки. В этих ситуациях дополнительная иммуносупрессия может быть необходима.¹⁷

Figure 1. Concept of Immunoresponse to Gene-Modified HSCs (A) Intensities of myelosuppression and immunosuppression among conditioning regimens. (B) Immunoresponses between patient cells and gene-modified cells in HSC-targeted gene therapy compared to those between recipient and donor cells in allogeneic HSC transplantation. (C) Overall summary of donor lymphocyte injection (DLI) and HSC transplantation (SCT) with either immunologic or non-immunologic gene transduction following conditioning

Итак, пре-клинические и клинические данные показывают, что myeloablative тотальное облучение тела делает возможным эффективное приживление и толерантность к ген-модифицированным HSCs. Напротив, myeloablative химиотерапия с использованием busulfan или сходных агентов достаточна лишь для индукции толерантности к ген-модифицрованным HSCs, не продуцирующих или продуцирующих не иммуногенные белки. Если клетки модифицированы, чтобы продуцровать белок, который является xenogenic или прирожденно отсутствует у пациента, то может быть необходима дополнительная иммуносупрессия, чтобы предупредить иммунологическую реакцию на трансдуцированные клетки. Новые техники редактирования генов и in vivo генотерапии должны предоставить дополнительные иммунные проблемы, сравнимые с таковыми при ex vivo методами генотерапии.

нацеленная на HSC генотерапия была использована для лечения β-thalassemia, серповидно-клеточной болезни (SCD), X-SCID, дефицита adenosine deaminase (ADA), синдрома Wiskott-Aldrich (WAS), X-linked chronic granulomatous disease (X-CGD), MPS I, leukocyte adhesion deficiencies I and II (LAD1/2), cerebral adrenoleukodystrophy (ALD), cystinosis, Fabry's disease, and Fanconi anemia.^1,30,59,60 Успех был достигнут во многих из этих испытаний, в зависимости от обстоятельств улучшения сохранялись годами в зависимости от выбора HSC и условий трансдукцииt,61 ветора доставки гена,45 и протоколов кондицонирования.³⁶ Первые клинические испытания с использованием γ-ретровирусов для переноса генов, но как оказалось эти векторы несут риск инсерционного мутагенеза из-за предпочтительности инсерций вблизи промоторных регионов, экоторые могут активироваться с помощью вирусных энхансеров.^62,63 Самоинактиврующиеся (SIN) лентивирусные векторы, происходящие из HIV-1 сегодня используются почти исключительно в современных клинических испытаниях, благодаря своей пониженной генотоксичности и способности трансдуцировать неделящиеся клетки.⁶⁴ Кроме того, большинство клинических испытаний использует myeloablative химиотерапию, чтобы подготовить пациентов перед трансплантацией. Заметным исключением из обоих этих трендов являются испытания иммунодефицитов, в которых эффективность и безопасность улучшены с помощью γ-ретровирусных векторов и nonmyeloablative режима кондиционирования.^{3,4,65, 66, 67}

В то время как иммунологическое отторжение трансгенов происходит и др. подходах к генотерапии, т.е. этот феномен наблюдается не только при HSC-нацеленной клинической генотерапии. Такое иммунологическое отторжение трансдуцированных HSCs описано и в преклинических исследованиях, но клиническая генотерапия не может отражать различия во врожденной иммуногенности трансгенов и режимах кондиционирования.17 Большинство преклинических исследований генотерапии использует GFP для измерения маркированных генов, из-за его повышенной легкости и аккуратности интерпретации по сравнению с кодируемыми векторами генами лекарственной резистентности или базирующимися на PCR методами. Однако, GFP , как известно, является высоко иммунногенным у мышей, собак и у не человеко-образных приматов.^14,16,55,68 Поэтому многие из этих экспериментов базируются на облучении высокими дозами TBI, чтобы вызывать иммуносупрессию, а также миелосупрессию, несмотря на отсутствие подобного подхода при генотерапии у людей. В клинических условиях трансген обычно является человеческим геном скорее, чем чужеродным геном, таким как GFP. Недавнее исследование на макаках резус показало, что myeloablative busulfan оказывается достаточным для долго-временного приживления человеческих γ-globin-экспрессирующих лентивирусами трандуцированных CD34+ клеток, но не GFP-экспрессирующих клеток.¹⁷ Сходством в испытаниях генотерапии для SCD и β-thalassemia, является то, что отторжение терапевтического βT87Q-глобина не наблюдается, скорее всего, из-за того, что он отличается от интктного β-globin только по одной аминокислоте.^7,8

В отношении потребности иммуносупрессии, важно различать между нарушениями, при которых изменены белки, такими как SCD, и нарушениями, при которых белок врожденно отсутствует, а также многими метаболическими нарушениями. При недавних клинических испытаниях генотерапии при ALD, нарушении лизосомного хранения, вызываемого мутациями в гене ABCD1, myeloablative busulfan кондиционирование и иммуносупрессия с помощью предварительной трансплантации сделали успешным приживление CD34+ клеток, трансдуцированных с помощью ABCD1 cDNA-содержащего лентивирусного вектора.⁶⁹ Однако, в сходном испытании для нарушения лизосомного хранения, метахроматической лейкодистрофии, пациенты были подготовлены (conditioned) с использованием только myeloablative busulfan. Все пациенты обнаруживали продукцию восстановленного arylsulfatase A (ARSA) после трансплантации и даже без дополнительной иммуносупрессии при тестировании оказались негативными по ARSA и HIV-1 p24-специфическим антителам.60 Однако, испытание для X-CGD было усовершенствовано добавлением sirolimus к режиму myeloablative busulfan после того как у одного пациента наблюдалась быстрая потеря трансдуцированных клеток после трансплантации. Исследователи не обнаружили прямых доказательств иммунной реакции в отношении трансгена gp91phox у этого пациента, хотя пациент впоследствии прошел трансплантацию по протоколу усовершенствования и обнаруживал высокие уровни маркированных клеток.70

Перенос генов с использованием ретровирусных векторов эффективен и успешно используется в клинике.^2,7,71-74 Несмотря на это вирусные векторы интегрируются в непредсказуемом положении генома, это может приводить к инсерционному мутагенезу и менять паттерн экспрессии трансгена.⁷⁵ Напротив технологии редактирования генов позволяют осуществить модификации в определенном месте, потенциально снижая риск мутагенеза и позволяя поддерживать паттерны эндогенной экспрессии гена. Редактирование гена сопровождается использованием запрограммированных эндонуклеаз, включая zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) и the CRISPR/Cas9 систему. Эти инструменты работают, вызывая сайт-специфические разрезы ДНК, активируя тем самым репарацию двойных разрывов ДНК посредством или non-homologous end joining (NHEJ) или homology-directed repair (HDR) пути. Использование нуклеаз сильно повышает величину HDR в присутствии донорской ДНК, делая возможной коррекцию мутаций, вызывающих болезнь.^76-9

Аутологичные CD34+ HSCs , генетически модифицированы ex vivo перед трансплантацией. Следовательно, режимы кондиционирования и иммуносупрессии, разработанные для генотерапии, должны теоретически позволять приживление отредактированных по гену CD34+ клеток. Подобно вирусами трансдуцированным CD34+ клеткам, отредактированные по гену CD34+ клетки д. быть толерантными к последующему myeloablative busulfan кондиционированию; однако, будучи отредактированными CD34+ клетки продуцируют нео-антиген, поэтому может быть необходима дополнительная иммуносупрессия, чтобы предупредить отторжение отредактированных клеток. Помимо природы генетических манипуляций, существует потенциальная иммуногенность самих инструментов редактирования генов. Нуклеазы, включая ZFNs, TALENs и Cas9 являются чужеродными белками и поэтому могут стимулировать иммунные реакции. Поскольку CD34+ клетки являются единственными временно подвергающиеся действию этих белков в стратегиях ex vivo редактирования генов, то, скорее всего, остается достаточное количество белка, чтобы стимулировать иммунные реакции in vivo. При генотерапии при ex vivo лентивирусной трансдукции, вирусные белки, такие как капсиды, integrase, reverse transcriptase и протеазы также временно воздействуют на CD34+ клетки и иммунологические реакции на эти белки не возникают при использовании myeloablative кондиционирования. Т.о., дополнительная иммунносупрессия может быть необходима для предупреждения иммунных реакций на нуклеазы, экспозируемые ex vivo при редактировании генов HSCs.

Поскольку инструменты генного редактирования вряд ли стимулируют иммунные реакции, когда осуществляются ex vivo модификации генов, они, скорее всего, делают это, когда используюдтся для прямого редактирования клеток in vivo, как это наблюдается во время in vivo нацеленной на печень генотерапии дефицита белка.⁸⁰ В настоящее время модификации генов в HSCs используют вирусные векторы или инструменты редактирования генов, которые одобрены для клиники для ex vivo переноса генов. Однако,in vivo генетические модификации HSCs активно исследуются.⁸¹ При редактировании генов с помощью CRISPR/Cas9 системы ген Cas9 обычно доставляется с помощью вирусного вектора, это, по-видимому, приводит к постоянной экспрессии нуклеазы у иммуносовместимых хозяев. Действительно ли экспрессируемый внутриклеточно Cas9 будет стимулировать иммунные реакции, ранее не было известно, но предсуществующая анти-Cas9 иммунность недавно была обнаружена в выборках крови здоровых людей.⁸² Прямое лизирование Cas9-экспрессирующих клеток не было выявлено в этом исследовании, но присутствие антител и клеточного иммунитета к Cas9 подразумевает, что модифицированные клетки, экспрессирующие эти белки, должны разрушаться.^82,83 Более того, преодоление пред-существующего иммунитета более затруднительно, чем его предотвращение у нативных индивидов. Распознавание с помощью Cas9-специфических антител, также как и CTLs может в принципе снизить эффективность проникновения и приживления отредактированных по гену HSCs. Эксперименты на иммунокомпетентных крупных модельных животных необходимы, чтобы оценить эти проблемы далее, но любая из них не отличается фундаментально от уже известных в области генотерапии. Следовательно, сходные стратегии для устранения их, скорее всего, разработаны, такие как отладка кондиционирования и иммуносупрессирующих режимов или маршрутов доставки.

Immunological responses to foreign transgenes are well documented in preclinical and clinical gene therapy studies. At present, immunological rejection of genetically modified HSCs has not been conclusively reported in human patients, although there is evidence from large animals and suggestions in at least one clinical trial that this could occur in some settings. The infrequency with which this phenomenon is observed in HSC-targeted gene therapy can be explained by a number of factors, perhaps most importantly the ability of transduced HSCs to confer transgene-specific tolerance to successfully transplanted recipients. While the risk of rejection on the basis of transgene immunity appears to be lower in ex vivo HSC gene therapy than in other forms of gene therapy, the immunogenicity of the transgene in its disease-specific context must be carefully considered when designing conditioning and immunosuppressive regimens for clinical trials. Recent preclinical developments in HSC-targeted gene therapy, such as gene editing and in vivo gene therapy, are likely to pose additional immunological concerns than the ones directly assessed in the studies reviewed herein. Going forward, clinically predictive nonhuman primate experiments will continue to be critical for studying the potential immunogenicity of modified HSCs. The field of gene therapy has successfully overcome many barriers to clinical application, with patients beginning to see therapeutic benefits in recent years. There is every reason to believe that the potential immunogenicity of genetically modified HSCs can be countered with similar ingenuity.