Посещений:
МОЗАИЧНЫЕ ОРГАНЫ



Методы получения мозаиков почек

Generating Genetic Mosaic Mouse Embryos or Organoids for Studies of Kidney Development
• Frank Costantini
Kidney Organogenesis pp 3-21 | Part of the Methods in Molecular Biology book series (MIMB, volume 1926)

Нокаут (KO) некоторых генов, вызываемый во время развития почек, приводит к неспособности развития мочеполовой системы ещё до взрослой стадии, формирования метанефрических почек или ещё раньше. Напр., KO Lhx1 приводит к дефекту развития почечных протоков (ND), так что зачаток мочеточника (UB) имеет редкий шанс сформироваться [1], тогда как KO Ret вызывает раннюю неспособность формирования или ветвления UB [2]. В этих случаях трудно вычленить специфическую роль в развитии почек соотв. генов, исходя из мутантного фенотипа. В некоторых случаях решение может быть получено благодаря использованию conditional knockout (CKO) мышей [3], у которых интересующий ген фланкирован flanked loxP сайтом ("floxed") и делетирован в специфических суб-клонах клеток почек с помощью Cre рекомбиназы, управляемой клон-специфическим геном. В случае Lhx1, напр., делеция CKO аллеля с использованием гена Cre рекомбиназы, экспрессируемой только в клоне клеток нефрона, делает возможным возникновение раннего дефекта развития ND, что не позволяет выявлять др. роли Lhx1 в нефрогенезе [4]. Однако, даже клон-специфические CKO определенных генов обнаруживают серьезные последствия, которые приводят к ранней неспособности органогенеза.
По этим причинам часто информативными оказываются сгенерированные генетические мозаики почек, в которых только небольшая пропорция клеток имеет делетированным интересующий ген; в этом случае также важно, чтобы мутантные клетки были дифференциально мечены, так чтобы их поведение и судьбы можно было бы отслеживать во время органогенеза и отличать от соседних клеток дикого типа (WT) [5]. Здесь будут рассмотрены методы генерации мозаиков, которые применимы к генам с клеточно-автономной функцией, такие как транскрипционные факторы, рецепторы или внутриклеточные сигнальные молекулы, и в меньшей степени к клеточно-неавтономным генам, таким как кодирующие секретируемые белки, поскольку последние могут быть "восстановлены" благодаря секреции белка соседними клетками и могут не проявлять мутантного фенотипа.

2 Chimeric Embryos Generated Using Embryonic Stem Cells


Химерные эмбрионы мышей (происходящие из клеток более чем одного эмбриона с разными генотипами) могут быть получены с помощью нескольких методов. Однако, наиболее применяемым методом является (1) использование происходящих из эмбриональных стволовых клеток (ES), которые гомозиготны по KO интересующего гена и затем (2) микроинъецирование мутантных ES клеток в WT хозяйский бластоцист (л альтернативно, агрегировать ES клетки с хозяйским эмбрионом на ст. морулы) [6] (Fig. 1). ES клетки должны также нести "ген репортер", экспрессирующий флуоресцентный белок, такой как GFP (или др. маркерный блок, такой как beta-galactosidase) в изучаемом типе клеток. Если возможно, то хозяйский эмбрион д. нести отличающийся репортерный белок. Напр., при изучении роли гена Ret в ветвлении UB [7, 8], были созданы ES клетки, гомозиготные по Ret-KO аллелю и также несущие трансген Hoxb7/GFP, который экспрессируется специфически в клонах клеток ND и UB; а хозяйские эмбрионы WT были преобразованы так, чтобы они экспрессировали cyan fluorescent protein (CFP) в тех же самых клеточных клонах (see Note 1 ). Это позволило Ret-мутантным (GFP+) и дикого типа (CFP+) клеткам формировать ND и UB, делая их отличимыми. Было показано, что Ret является важным для перестройки ND клеток, это позволяет суб-набору ND клеток генерировать "кончиковые домены" первичного UB, который возникает из ND [8].



Fig. 1 Generation of chimeric mice with genetically mosaic kidneys, via derivation of mutant ES cells. The mutant ES cells carry a reporter gene (e.g., GFP) and are microinjected into wild-type host blastocysts with a different reporter gene (e.g., CFP). The reporter genes can be uniformly expressed as shown here, or they can be lineage-specific. See text for details



3 Chimeric Renal Organoids Generated by Dissociation and Reaggregation of Fetal Kidneys


Если почки плодов (обычно ст. E11.5-E13.5) диссоциировать на отдельные клетки, а клеткам затем позволить повторно агрегировать и расти в культуре, то они реформируются в почко-подобные органоиды, которые развиваются в разветвленные канальцы зачатка мочеточника (ureteric bud (UB)) и нефроны [12-15]. При смешивании клеток почек от эмбрионов двух разных генотипов с сотв. маркерными генами, чтобы их отличать, могут быть созданы генетически мозаичные почечные органоиды (Fig. 2). Такой подход был использован для изучения эффектов мутаций Spry1 и Fgfr2 на морфогенез ветвления UB [16].

Fig. 2 Generation of chimeric renal organoids by dissociation and reaggregation of fetal kidneys. The diagram illustrates an experiment with kidneys uniformly expressing GFP or CFP, but fluorescent protein genes expressed in specific cell lineages can also be used. If one of the kidneys is homozygous for a mutant gene, this method can be used to study how that gene influences cell fate during renal organoid development



4 Generation of a Knockout Allele with a Built-in Reporter Gene


Легко получать мозаичные почки, используя CKO аллель вместе с tamoxifen-inducible Cre геном, путем добавления низких доз tamoxifen. Однако, в большинстве случаев такие мозаичные органы являются ограниченными экспериментальными условиями, поскольку мутантные клетки не могут быть легко отличены от клеток дикого типа. Одним из решений является разработка специального прибора и получение мышей с CKO аллелем, который несет и встроенный ген репортер (известен также как "conditional reporter"). Напр., Uesaka et al. [18] генерировали CKO аллель Gfra1 (гена, кодирующего ко-рецептор для GDNF, который функционирует вместе с Ret рецепторной тирозин киназой), в котором после Cre-обусловленной рекомбинации, экспрессия Gfra1 теряется и одновременно прежде неактивный ген GFP помещается под контроль промотора Gfra1 promoter (Fig. 3). Т.о., только клетки, имеющие делецию Gfra1 будут экспрессировать GFP. Такие мыши были использованы для изучения важности Gfra1 для ветвления UB во время развития почек [19].

Fig. 3 Generation of a Gfra1 conditional knockout allele with a built-in reporter gene (or "conditional reporter"). Gene targeting in ES cells was used to introduce the following sequences into exon 2 of the Gfra1 gene, following the initiation codon: loxP site (red triangle), Gfr?1 cDNA, polyadenylation site (pA), loxP site, GFP cDNA, and polyadenylation site. In this CKO allele, while the endogenous Gfra1 gene is disrupted, Gfr?1 is still expressed from the cDNA sequence, so the allele is functional, while GFP expression is blocked by the preceding pA site. When Cre catalyzes recombination between the two loxP sites, the Gfr?1 sequence and first pA sequence are deleted, and the GFP gene is now expressed from the Gfra1 promoter. Diagram modified from Uesaka et al. [18] where more details can be found



5 Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)


Mosaic analysis with double markers (MADM) [22] является остроумным методом для генерации в эмбрионах или тканях мышей индивидуальных мутантных клеток, меченных флуоресцентным репортерным геном (e.g., GFP) и одновременно генерировать контрольные, WT сестринские клетки, маркированные др. флуоресцентным репортером (напр., Tomato, красным флуоресцентным белком). Первые MADM мыши были получены с помощью генетически модифицированного локуса Rosa26 на хромосоме 6, и они могли быть использованы для изучения только генов на хромосоме 6 (и дистальнее локуса Rosa26, по отношению к теломере). Для генов на др. хромосомах мыши для соотв. исследования необходимо исследователям сначала идентифицировать ген на этой хромосоме насколько возможно близко к теломере (see Note 7 ), который экспрессируется повсеместно (see Note 8 ) и затем генерировать пару генетически модифицированных MADM линий мышей с целевым аллелем гена на этой хромосоме. Пара линий MADM сегодня доступна (и может быть куплена в Jackson Laboratories) для хромосом 6 [23], 7 [24], 10 [23], 11 [25] и 12 [24].
MADM, разработанное для хромосомы 6, представлены на Fig. 4a. Одна линия мышей , MADM6-GT, несет Rosa26 аллель, кодирующий 5' половину гена GFP и 3' половину гена Tomato, разделенные сайтом loxP. Др. линия, MADM6-TG, несет комплементарный аллель с 5' половиной Tomato и с 3' половиной GFP.Ни один из этих аллелей не кодирует функциональный флуоресцентный белок. Однако, когда две линии скрещиваются др с др., то все клетки, несущие как MADM6-TG, так и MADM6-GT аллели и Cre рекомбиназа экспрессируются на высоком уровне в очень небольшой пропорции клеток, тогда будет возникать межхромосомная рекомбинация между сайтом loxP в MADM6-TG и loxP сайтом в MADM6-GT. Это давать функциональный ген Rosa26-GFP и функциональный ген Rosa26-Tomato в клетке (Fig. 4a). Когда произойдет такая рекомбинация в G2 фазе клеточного цикла, то хромосома, несущая Rosa26-GFP ген будет наследоваться одной из дочерних клеток, а гомологичная хромосома 6, несущея ген Rosa26-Tomato будет наследоваться др. дочерней клеткой; тогда одна дочерняя клетка будет экспрессировать GFP (зеленый), а др. Tomato (красный) цвет. Эти паттерны экспрессии постоянны в потомстве этих двух клеток. Следует подчеркнуть, что такое событие меж-хромосомной рекомбинации очень редкое, так что обычно образуется очень мало клонов red/green рекомбинантных клеток в данной ткани.

Fig. . 4

Mosaic analysis with double markers (MADM), illustrated for the Ret locus on chromosome 6. (a) Diagram of MADM recombination. In the initial (G1-phase) cell, one chromosome 6 homolog carries a Ret-KO allele in cis to MADM-GT, and the other carries a Ret-WT allele in cis to MADM-TG. Neither MADM-GT nor MADM-TG expresses a functional fluorescent protein [22, 23]. Cre-mediated recombination during G1 phase (or during G0, or in post-mitotic cells) generates a Tomato (red fluorescent protein) gene and a GFP gene in the same cell; such cells appear yellow and remain heterozygous for Ret. If Cre-mediated recombination occurs after DNA replication, in G2, the cell will contain a Tomato gene in cis to a Ret-WT allele and a GFP gene in cis to a Ret-KO allele, as well as two non-recombined (and nonfunctional) MADM alleles. At mitosis, the four chromatids can undergo X-segregation (left, yielding a Ret-/-, GFP+ cell and a Ret+/+, Tomato+ cell), or Z-segregation (right, yielding an unlabeled cell and a double-labeled cell, both of which remain Ret+/-). The genotypes and fluorescent protein expression patterns of the initial recombinant cells are retained during subsequent cell divisions. Diagram modified from ref 22, 26. (b) Schematic example of the time-lapse analysis of a Ret-MADM clone in a cultured kidney. The drawing illustrates a branching UB tip surrounded by cap mesenchyme (CM); the UB expresses Hoxb7/CreGFP (light green), which catalyzes MADM recombination in rare cells. The gray cell in (1) is a parental cell in the Ret+/- UB tip, in which Cre-mediated recombination is occurring. After mitosis with X-segregation (2), the Ret-/- daughter cell starts to express GFP (darker green), and the Ret+/+ cell starts to express Tomato (red). These recombinant cells continue to divide during UB branching (3 and 4), with the red Ret+/+ cells tending to remain closer to a tip than the green Ret-/- cells [26]

Чтобы использовать MADM для генерации мозаичных эмбрионов или тканей по KO гену, сначала необходимо позиционировать KO аллель на той же самой хромосоме, что или MADM-GT, или MADM-TG аллель (но не оба). Это обычно осуществляется с помощью мейотической рекомбинации, т.e., необходимо разводить мышей, чтобы получить и идентифицировать событие мейотической рекомбинации между MADM локусом и KO интересующим геном (see Note 7 ). Как только это достигается (и если KO ген находится дистальнее локуса MADMs), то если используется Cre рекомбиназа, то генерируется red/green клеточная пара, зеленые клетку будут гомозиготными по KO, а красные клетки будут гомозиготными по WT аллелю этого гена (это предполагает, что KO ген оказался помещенным на MADM-GT хромосоме; если это происходит на MADM-TG хромосоме, то красные клетки будут гомозиготными мутантными, а зеленые клетки будут гомозиготными по WT).
MADM было использовано для генерации индивидуальных UB клеток, гомозиготных по Ret-KO аллелю на хромосоме 6, а сестринские клетки были гомозиготны по WT Ret аллелю, маркированному с помощью GFP или Tomato (Fig. 4b) [26]. MADM рекомбинация была индуцирована специфически в UB клетках, используя Hoxb7/CreGFP трансген [27]. Анализ развития почек с такими MADM клонами показал, что клетки, лишенные Ret значительно меньше склонны, чем WT сестринские клетки оставаться на кончиках UB во время морфогенеза ветвления [26]. Сходные результаты были получены для гена Etv4 на хромосоме 11 [26], который участвует в пути передачи сигналов Ret [28].

6 Mosaic Mutant Analysis with Spatial and Temporal Control of Recombination (MASTR)


Как отмечалось выше мозаичные почки могут быть сгенерированы при использовании любого CKO аллеля, с помощью индукции CreER-обусловленной рекомбинации только в сбунаборе клеток, но в большинстве случаев рекомбинированные, т.e., мутантные) клетки не могут быть отличены от WT клеток. К сожалению невозможно использовать отдельный Cre-reporter аллель [21, 29], чтобы идентифицировать клетки, которые рекомбинантны по CKO аллелю., поскольку когда CreER индуцируется на низком уровне (чтобы вызывать мозаицизм), то корреляция между рекомбинацией CKO и репортерного аллеля слабая. Lao et al. [30] разработали элегантный метод для решения проблемы, наз. анализ мозаичных мутантов с пространственным и временным контролем рекомбинации (MASTR). MASTR делает возможным использование дополнительной системы сайт-специфической рекомбинации, при котором FLP рекомбиназа катализирует рекомбинацию между двумя "frt" сайтами распознавания [31], подобно Cre-обеспечиваемой рекомбинации между LoxP сайтами.
Как показано на Fig. 5, чтобы осуществить MASTR, разводятся мыши или эмбрионы, чтобы они несли три гена: (1) a tamoxifen-индуцибельный Flp ген (такой как Rosa26FlpoER) [30], (2) аллель Rosa26MASTR [30], и (3) два CKO аллеля (или один CKO и один KO) интересующего гена. Аллель Rosa26MASTR включает промотор Rosa26 и кодирующую последовательность для GFP-Cre слитого белка, предшествующие транскрипционной стоп последовательности, у которой по флангам расположены frt сайты. Инъекция tamoxifen в низкой дозе активирует FlpoER рекомбиназу, это приводит к делеции фланкированной frt стоп- последовательности в случайном субнаборе клеток. Эти клетки затем экспрессируют слитый GFPcre белок, который одновременно метит клетки и катализирует рекомбинацию CKO аллелей. Ключевым отличием между использованием MASTR и использованием гена, кодирующего CreER (индуцируемого низкой дозой tamoxifen), чтобы создать мозаиков, является то, что активность Cre слитого GFPcre белка из MASTR аллеля очень сильная, настолько, что CKO аллель вступает в рекомбинацию практически в каждой клетке, которая экспрессирует GFPcre. Мозаицизм может быть получен при использовании низкой дозы tamoxifen для индукции слабой активности FlpoER .

Fig. 5

Mosaic mutant analysis with spatial and temporal control of recombination (MASTR), illustrated for Fgfr2. (a) Diagram of MASTR. The Rosa26FlpoER allele expresses tamoxifen-inducible FlpoER recombinase. When tamoxifen is injected and binds to FlpoER, FLP activity can induce recombination between frt sites in the Rosa26MASTR allele, deleting the stop sequence and causing GFPcre to be expressed. The strong Cre recombinase activity of GFPcre causes an Fgfr2CKO allele in the same cell to be converted to a KO allele. (b) Use of MASTR to generate Fgfr2KO/KO cells in developing kidneys. Note that only a fraction of cells become GFPcre-positive, and delete Fgfr2CKO allele. The use of Rosa26FlpoER causes recombination in random cells throughout the kidney, which can be detected by staining with anti-GFP. To analyze the effect of Fgfr2 deletion on UB cells, Leclerc and Costantini [16] analyzed confocal optical sections, where recombinant cells in the UB could be distinguished from those in the mesenchyme, by staining the UB with an anti-Calbindin antibody

Leclerc and Costantini [16], используя MASTR для тестирования важности fibroblast growth factor receptor 2 (Fgfr2) для клеток UB, чтобы занимать домен кончиков (tip) во время ветвления UB. Поскольку специфическая для UB линия Flp была недоступна (see Subheading 6.1.2), то был использован повсеместно экспрессирующийся аллель Rosa26FlpoER [30] чтобы делетировать аллель Fgfr2 CKO [27] в редких клетках по ходу развития почек. Расположение экспрессирующих CreGFP рекомбинантных клеток определяли используя конфокальную микроскопию для проверки оптических срезов и подсчета этих клеток в UB кончиках или в стволах. Полученные результаты (вместе с результатами, полученными с помощью метода dissociation/aggregation сгенерированных мозаичны почечных органоидов - see Subheading 2) предоставили доказательства, что потеря Fgfr2 снижает способность клеток UB оставаться в кончиках [16].