Посещений:
NOTCH ПУТЬ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛОВ



Роль в норме и при патологии ЦНС

The Notch pathway in CNS homeostasis and neurodegeneration
Diana M. Ho, Spyros Artavanis-Tsakonas,Angeliki Louvi
WIREs Dev/ Biol. 2019 | https://doi.org/10.1002/wdev.358

The pleiotropic Notch signaling pathway affects CNS homeostasis and is implicated in adult neurogenesis, synaptic plasticity, and memory formation. It is also associated with both acute neural injury events such as ischemic stroke (most notably, the hereditary disorder Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy) and progressive neurodegenerative diseases (e.g., Alzheimer's disease, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis). (Figure created with BioRender).
Путь передачи сигналов Notch является одним из горстки фундаментальных механизмов, управляющих развитием метазоа, путем контроля клеточных судеб и соотв. морфогенеза. Сигналы, передаваемые Notch рецепторами, являются центральным элементом пути, влияющим практически на каждую развивающуюся ткань и орган и вызывают чрезвычайно плейотропные исходы, затрагивающие дифференцировку, пролиферацию и апоптические события в ходе развития зависимым от контекста способом (Artavanis-Tsakonas, Rand, & Lake, 1999; Bray, 2016; Hori, Sen, & Artavanis?Tsakonas, 2013; Kopan & Ilagan, 2009). Высокое плейотропное действие пути Notch тем не менее базируется на простой онтогенетической логике: Notch сигналы контролируют клеточные судьбы и клональное расхождение благодаря связи судьбы одной клетки с таковой соседних клеток, посредством взаимодействия поверхностного рецептора Notch, экспрессируемого одной клеткой со связанными с мембранами лигандами, экспрессируемыми на поверхности соседней клетки. Аномальная передача сигналов Notch неизменно приводит к мутантным фенотипам в каждой исследованной клеточной системе и поэтому не удивительно, что Notch ассоциирует с разнообразным спектром болезней человека (e.g., Louvi & Artavanis-Tsakonas, 2012). Итак, передача сигналов Notch почти всегда ассоциирует с судьбами предшественников и стволовых клеток, когда они переходят в более зрелое состояние или когда этому препятствуют.
Анимация основных свойств пути показана на Video S1, Supporting Information. Однако, мы не будем детально обсуждать механизм передачи сигналов Notch, поскольку имеются многочисленные обзоры по этой теме (Artavanis-Tsakonas & Muskavitch, 2010; Bray, 2016; Henrique & Schweisguth, 2019; Kopan & Ilagan, 2009). Мы лишь очень коротко упомянем некоторые элементы пути, важные для нашего обсуждения в современном контексте. В отличие от Drosophila, несущей только один Notch рецептор, млекопитающие имеют 4 Notch паралога (NOTCH1, 2, 3 и 4). Передача сигналов Notch посредством трансактивации с помощью связанных с мембраной лигандов, Serrate (JAGGED1 [JAG1] и 2 [JAG2] у млекопитающих) или Delta (DLL1, 3 и 4 у млекопитающих), экспрессирующихся на соседних клетках. После взаимодействия лиганд-рецептор функционально активный внутриклеточный домен Notch (NICD) высвобождается в результате серии протеолитических расщеплений с существенным участием presenilin комплекса, и в конечном итоге транслоцируется в ядро, где он участвует непосредственно в событиях транскрипции, опосредуемых с помощью основных эффекторов, включая Suppressor of Hairless (RBPJ у млекопитающих) и mastermind (MAML у млекопитающих). Передача сигналов Notch индуцирует активность многих различающихся мишеней (напр., гены в Enhancer of Split и bearded комплексах, Hey, Hes, и т.д..) очень зависимым от контекста способом.
Важно, что глубокий генетический анализ Drosophila выявил экстраординальный комплекс генетической схемы (circuitry), способный модулировать активность передачи сигналов Notch (Guruharsha, Kankel, & Artavanis-Tsakonas, 2012; Ho, Guruharsha, & Artavanis-Tsakonas, 2018; Hurlbut, Kankel, Lake, & Artavanis-Tsakonas, 2007). Существуют буквально сотни генов, которые может модулировать передача сигналов Notch. Такая сложность часто затемняется или даже игнорируется при исследованиях, сконцентрированных на одиночных генетических функциях, особенно в системах, лишенных утонченного генетического анализа модельных организмов, таких как мухи или черви (rev. Ho et al., 2018).
Среди множества органов, чей морфогенез зависит от передачи сигналов Notch, является ЦНС и ПНС. Фактически, участие Notch в нейрогенезе впервые было установлено в 1930s, когда активность Notch была продемонстрирована как жизненно важная для приобретений нейральной судьбы у ранних эмбрионов Drosophila (Poulson, 1940). Передача сигналов Notch рецептора также влияет на выделение нейральных клонов у млекопитающих, от самой ранней сегрегации между нейральными и глиальными клеточными судьбами, до формирования сложных дендритов в незрелых пост-митотических нейронах. Уже давно было установлено, что активность Notch сильно влияет на поведение пост-митотических нейронов; контактами-обеспечиваемая передача сигналов Notch регулирует способность нейронов к вытягиванию и формированию дендритов (Redmond, Oh, Hicks, Weinmaster, & Ghosh, 2000; Sestan, Artavanis-Tsakonas, & Rakic, 1999) (Figure 1).



Figure 1 Notch signaling mediates outgrowth of post-mitotic neurons. (a) Neurite extension in cortical neurons is normally inhibited upon contact with a neighboring neuron. (b) When Notch signaling is inhibited cell-autonomously via overexpression of a negative Notch regulator (e.g., Deltex or Numb?like), contact-mediated inhibition is relieved and neurite extension occurs (adapted from Sestan et al., 1999)

Онтогенетические и патологические последствия передачи сигналов Notch сильно зависят от клеточного контекста и взаимодействий с др. сигнальными путями, активными в клетке. Плейотропная роль Notch в нейральном развитии уже рассматривалась (Louvi & Artavanis-Tsakonas, 2006; Pierfelice, Alberi, & Gaiano, 2011; Zhang, Engler, & Taylor, 2018).

2 NOTCH IN ADULT AND AGING BRAIN


Все 4 паралога Notch рецепторов у млекопитающих, также как и множественные элементы пути (лиганды и мишени) экспрессируются определенными типами клеток специфически в головном мозге как взрослых мышей, так и людей. Экспрессия Notch рецептора выявлена в нейронах (Notch1 и Notch2), астроцитах (Notch1 и Notch2), эндотелиальных клетках (Notch1 и Notch4), сосудистых гладкомышечных клетках и перицитах (Notch3), и нейральных стволовых клетках (Notch1 и Notch2). Компоненты пути Notch, включая NOTCH1 и NOTCH2 рецепторы, также продолжают экспрессироваться в головном мозге стариков, по крайней мере, у мышей, возможно на более низких уровнях (Ables, Breunig, Eisch, & Rakic, 2011; Andreu-Agullo, Morante?Redolat, Delgado, & Farinas, 2009; Basak, Giachino, Fiorini, Macdonald, & Taylor, 2012; Berezovska, Xia, & Hyman, 1998; Breunig, Silbereis, Vaccarino, Sestan, & Rakic, 2007; Engler et al., 2018; Givogri et al., 2006; Irvin, Zurcher, Nguyen, Weinmaster, & Kornblum, 2001; Murphy et al., 2008; Stump et al., 2002; our unpublished findings; human.brain-map.org; www.brainrnaseq.org).

3 NOTCH IN ADULT NEUROGENESIS


В головном мозге взрослых мышей нейрогенез продолжается в двух нейрогенных нишах, субвентрикулярной зоне (SVZ) переднего мозга латеральнее желудочков и в субгранулярной зоне (SGZ) зубчатой извилины (DG) гиппокампа. Большинство нейральных стволовых клеток (NSCs) взрослых находится в покоящемся состоянии; реагируя на широкий круг сигналов (напр., ростовые факторы, морфогены, эпигенетические регуляторы, нейротрансмиттеры и т.д.), и возможно на дополнительные неизвестные стимулы, они могут вступать в клеточный цикл и самообновляться, сохраняя при этом пул стволовых клеток, а также генерируя митотически активные промежуточные предшественники. В SVZ, предшественники дают нейробласты, которые мигрируют в обонятельные луковицы, где они дифференцируются в разного типа промежуточные нейроны, тогда как в SGZ, они в конечном итоге дифференцируются в возбудимые гранулярные нейроны в DG (Gage, 2000; Ihrie & Alvarez-Buylla, 2011).
Передача сигналов Notch выполняет важные роли в поддержании NSC в обеих нейрогенных нишах. В SVZ, EGFR-обеспечиваемая модуляция Notch участвует в регуляции количества и само-обновления NSC (Aguirre, Rubio, & Gallo, 2010). Делеция Rbpj, главного ядерного эффектора передачи сигналов для всех 4-х Notch рецепторов у млекопитающих, вызывает молчание NSCs в отношении вступления в клеточный цикл (Ables et al., 2010; Basak et al., 2012; Imayoshi, Sakamoto, Yamaguchi, Mori, & Kageyama, 2010). Этот эффект может быть фенокопирован с помощью одновременной делеции Notch1 и Notch2, которые соотв. регулируют поддержание и само-обновление активных NSCs (Basak et al., 2012) и молчание NSC (Engler et al., 2018). Безусловно, активация Notch в SVZ снижается с возрастом (Sun et al., 2013), а потеря Notch2, как было установлено, ускоряет истощение NSC, приводя к преждевременному похожему на старость фенотипу (Engler et al., 2018).
Активность Notch, обеспечиваемая с помощью RBPJ, также оказывается ассоциированной с нейрогенезом в гиппокампе взрослых (Ehm et al., 2010), при этом NOTCH1 регулирует не только судьбы NSC, но и также морфологию дендритов новорожденных нейронов (Ables et al., 2010; Breunig et al., 2007). Роль NOTCH2 в SGZ ещё предстоит определить, но недавнее сообщение указывает, что по аналогии с SVZ, он участвует в поддержании покоящегося состояния NSC (Zhang et al., in press). В гиппокампе NSCs, которые зависят от Notch (за счет действительно экспрессии у них Hes5), имеют или радиальную или горизонтальную морфологию, которая соотв. образом коррелирует с их молчащим в противовес митотически активному состоянию (Lugert et al., 2010). Эти зависимые от Notch субпопуляции обнаруживают дифференциальные реакции на физическую активность, которая, как известно, усиливает нейрогенез в DG мышей (van Praag, Kempermann, & Gage, 1999), и на состояния (такие как экспериментальная эпилепсия). Они также дифференциально затрагиваются старением, напр., снижением нейрогенеза у старых мышей коррелирует с потерей митотически активного пула горизонтальных NSC (Lugert et al., 2010).
Итак, эти наблюдения крепко связывают Notch с нейрогенезом у взрослых за счет дифференциального действия паралогов рецепторов Notch. Было бы интересным установить функциональность, действительно ли путём манипуляций с Notch в дремлющих NSCs можно вернуть их к митотически активному состоянию. Понимая важность Notch, недавние исследования установили, что с NOTCH2 связанное семейство генов NOTCH2NL, которое существует только у людей, участвует в специфичном для человека онтогенетическом нейрогенезе в коре головного мозга (Fiddes et al., 2018; Suzuki et al., 2018).

4 NOTCH IN MEMORY FORMATION


Интригующая связь между активностью пути Notch и обработкой памяти была предположена в экспериментах на грызунах и мухах. Анализ поведения у гетерозиготных по Notch1 и Rbpj мышей, а также у Notch антисмысловых трансгенных мышей, которые обладали пониженными уровнями Notch, связывали дисфункцию пути Notch с дефицитом пространственного обучения и памяти (Costa, Honjo, & Silva, 2003; Wang et al., 2004). Мыши, гетерозиготные по Jag1, также обнаруживали избирательные нарушения в формировании пространственной памяти (Sargin et al., 2013). Не удивительно, влияние активности пути Notch на формирование памяти проявлялось как зависимое от времени развития, так и возможно от типа клеток. Conditional инактивация Notch1 в постнатальном гиппокампе приводит к дефициту обучаемости и формированию кратковременной памяти, что сопровождается дефектами морфогенеза дендритов (Alberi et al., 2011); напротив, избыточная экспрессия NOTCH1 способствует ветвлению дендритов (Ding, Gao, Ding, Fan, & Chen, 2016), а целенаправленная делеция Jag1 в нейронах взрослых вызывает потерю пространственной памяти и снижение зависимой от физической деятельности активности Notch (Marathe, Jaquet, Annoni, & Alberi, 2017). IЭто указывает, что conditional инактивация Rbpj в постнатальных возбуждаемых нейронах приводит к дефектам в долговременной потенциации, долговременной депрессии и обучаемости и памяти (Liu, Wang, Worley, Mattson, & Gaiano, 2015). Однако, в ранних исследованиях такие эффекты не были обнаружены (Sato et al., 2012), что, по-видимому, связано с использованием др. CAMKII-Cre линии. Более того, инактивация позитивного Notch регулятора Mindbomb1 в нейронах зрелого переднего мозга приводит к нарушению пространственной и контекстуальной fear памяти (Yoon et al., 2012). Было предположено, что механистически регуляция пластичности гиппокампа с помощью NOTCH1 может обеспечиваться посредством взаимодействия с путем reelin, приводя к активации CREB и транскрипции генов мишеней (Brai et al., 2015). Наконец, временное ослабление передачи сигналов Notch, как было установлено, вызывает в DG консолидацию долговременной памяти у взрослых крыс (Conboy et al., 2007); у мышей, консолидация fear памяти также ассоциирует с активностью, зависимой от временной супрессии передачи сигналов Notch1 в amygdala, обеспечиваемой с помощью miR34a (Dias et al., 2014).
Исследования на Drosophila также подтверждают роль пути Notch в нейральной пластичности, лежащей в основе консолидированой памяти. Потеря функции рецептора Notch приводит к дефициту обонятельной long-term memory (LTM) у взрослых мух (Ge et al., 2004; Matsuno, Horiuchi, Tully, & Saitoe, 2009; Presente, Boyles, Serway, de Belle, & Andres, 2004); однако, усиление активности Notch activity путем экспрессии NICD или не оказывает влияния на формирование LTM, или супрессирует её (Zhang, Yin, & Wesley, 2015). Формирование LTM, по-видимому, обеспечивается с помощью Notch-индуцибельного гипер-фосфорилирования CREB (Zhang, Yin, & Wesley, 2013). У взрослых мух Notch активируется в избранных обонятельных рецепторных нейронах после долговременного воздействия разных обонятельных стимулов зависимым от одоранта способом (Lieber, Kidd, & Struhl, 2011), и это необходимо для морфологической и функциональной пластичности обонятельного кругооборота (circuit) (Kidd & Lieber, 2016). Мы отметили, что участие Notch в преобразовании обонятельных сигналов описано также у мышей: делеция Notch1 в митральных клетках, принципиальных нейронах обонятельных луковиц, которые передают импульсы от обонятельных рецепторных нейронов в обонятельный кортекс, приводит к снижению реакций на обонятельные стимулы (Brai et al., 2014). Недавно активация пути Notch также оказалась участвующей в функции воздаяния должного с участием circuitry mushroom body у взрослых мух (Petruccelli et al., 2018).
Итак, эти наблюдения подтверждают, что активность, вызываемая передачей сигналов Notch, вносит вклад в синаптическую пластичность и соотв. в формирование памяти, у позвоночных подобно у беспозвоночных.

5 NOTCH IN ISCHEMIA AND BRAIN INJURY


Дисфункция пути Notch безусловно связана с ишемическими инсультами благодаря тому факту, что мутации NOTCH3 лежат в основе CADASIL (Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy) (Chabriat, Joutel, Dichgans, Tournier-Lasserve, & Bousser, 2009; Joutel et al., 1996; Karschnia, Nishimura, & Louvi, 2019; Louvi & Artavanis-Tsakonas, 2012). CADASIL является довольно распространенной моногенной (наследственной формой) ишемического инсульта, приводящего к снижению познавательной способности и к деменции. Артериопатия затрагивает в основном малые пенетрирующие церебральные и leptomeningeal артерии и характеризуется утолщением стенки артерий, морфологическими альтерациями и в конечном итоге потерей сосудистых гладкомышечных клеток и перицитов. Проявления деменции и нарушений памяти у пациентов с CADASIL, как полагают, вызываются сосудистой дегенерацией. Общность болезнь-вызывающих мутаций, которые всегда затрагивают цистеиновые остатки во внеклеточном EGF-подобном повторяющемся домене рецептора NOTCH3, является поразительной молекулярной характеристикой болезни. Кластер мутаций в EGF-подобных повторах 2-5, и те что в повторах 1-6 ассоциированы с более тяжелым фенотипом и более низкой жизнеспособностью по непонятной причине (Monet-Lepretre et al., 2009; Rutten et al., 2019). Функциональный анализ двух фенотипически отличных мутаций CADASIL (C455R и R1031C, ассоциированных, соотв., с ранним и поздним началом инсультов) продемонстрировали, что они определяют разные гипоморфные состояния активности NOTCH3 и что патофизиология CADASIL в самом деле ассоциирована, по крайней мере, частично с гипоморфной функцией NOTCH3 в сосудистых гладкомышечных клетках, однако, эти мутации также обнаруживают поведение избыточности функции (Arboleda-Velasquez et al., 2011). У мышей потеря активности NOTCH3, которая преимущественно обнаруживается в сосудистых гладкомышечных клетках, строго связана с чувствительностью к ишемическим инсультам (Arboleda-Velasquez et al., 2008). Помимо участия сосудов, установлено, что в посмертных выборках глубоких частей белого вещества головного мозга пациентов с CADASIL обнаруживается разрушение сетей внутри коры и повреждения астроцитов, возможно в результате клеточной гибели, похожей на аутофагию (Craggs et al., 2014; Hase et al., 2018). Трансгенная экспрессия дикого типа или CADASILсцепленных Notch3 конструкций у мышей приводит к снижению как гомеостатического, так и вызываемого упражнениями нейрогенеза в гиппокампе взрослых (NSC пролиферация и жизнеспособность) (Ehret et al., 2015; Klein et al., 2017), возникает интригующая возможность, что дополнительные клеточные механизмы помимо сосудистых повреждений вносят вклад в дисфункцию гиппокампа и нарушения памяти, наблюдаемые при CADASIL. Преклинические исследования терапевтических подходов ведутся на мышиных моделях. Сюда входят антитела к агонисту NOTCH3, способные активировать связанные с болезнью NOTCH3C455R рецепторы, предупреждая тем самым потерю пристеночных клеток у Notch3 C455R мышей (Machuca-Parra et al., 2017), и базирующиеся на антителах воздействия моноклональных антител, специфически распознающих внеклеточный домен NOTCH3 и, по-видимому, способные улучшать реакции сосудов головного мозга (Ghezali et al., 2018). Конечно, использование в клинике на людях таких терапевтических подходов пока всё ещё не применяется и, скорее всего, этому препятствуют плейотропия Notch, эффективная доставка в головной мозг и потенциальная токсичность.
Помимо прямой генетической причинной связи дисфункции Notch с CADASIL, модуляции пути Notch были исследованы на нескольких примерах экспериментальных инсультов у грызунов. Большинство исследований подтвердило, что активация Notch благотворна в этом контексте, несмотря на то, что Notch является тонко управляемой молекулой с динамикой состояний вкл-выкл., постоянно реагирует на пространственно-временные сигналы, осложняя тем самым интерпретацию подобных исследований (Arumugam et al., 2018). При повторных инсультах усиленная пролиферация нейральных предшественников сопровождается усилением активности Notch и экспрессии генов мишеней (Chen et al., 2008; Kawai, Takagi, Nakahara, & Takeo, 2005; Wang et al., 2009; Wang, Mao, Xie, Greenberg, & Jin, 2009). В соответствии с этим, Notch1 conditional нокаутные мыши, после ишемии, обнаруживают мало пролиферирующих реактивных астроцитов в области инсульта (Shimada, Borders, Aronshtam, & Spees, 2011). Инсульты, как было установлено, повышают продукцию SVZ астроцитов, которые экспрессируют на высоком уровне thrombospondin 4 (THBSP4). Эта реакция нуждается в активации Notch, которая, по-видимому, обеспечивает непосредственное связывание THSPB4 с NOTCH1 рецептором, запуская его эндоцитоз (Benner et al., 2013). По аналогии в SVZ пожилых, ишемией вызываемая клеточная пролиферация, усиливается после активации пути Notch и, наоборот, супрессируется, если передача сигналов Notch1 подавляется (Sun et al., 2013). В соответствии с находками, что временная ischemia/reperfusion приводят к увеличению объёма инсульта у Notch3 нокаутных мышей по сравнению с мышами дикого типа (Arboleda-Velasquez et al., 2008), активация NOTCH1 также ассоциирует с уменьшением объема инсульта и менее тяжелым моторным дефицитом после ишемии (Sun et al., 2013). Временная глобальная ишемия у крыс приводит к острому увеличению Notch1-экспрессирующих клеток и пути активации, тогда как ослабление передачи сигналов Notch во время подострой фазы сопровождается более эффективной дифференцировкой в направлении нейральных клонов (Oya et al., 2009). Активация Notch может также оказывать защитные эффекты во время фаз восстановления и ремоделирования после инсульта, усиливая нейрогенез и улучшая функциональные исходы (Androutsellis-Theotokis et al., 2006; Sun et al., 2013). Длительная активация Notch (высокие уровни NICD), с др. стороны, как было установлено, вызывает повреждающие эффекты и коррелирует с повышением гибели нейронов (Alberi et al., 2010; Baik et al., 2015; Wang et al., 2012), возможно посредством взаимодействия с путем HIF-1a (Cheng et al., 2014). Заслуживает внимания то, что вредные эффекты экспрессии NICD едва ли удивительны, т.к. в большинстве исследованных клеточных систем постоянная активация Notch посредством экспрессии NICD является токсичной. С др. стороны, инактивация Notch, или посредством трансгенной экспрессии антисмыслового Notch1 или воздействуя с помощью gamma-secretase ингибиторов, также, по-видимому, улучшает ближайшие функциональные исходы фокальных ишемических инсультов, вообще-то путем снижения чувствительности нейронов к апоптозу, а также снижения активации микроглии и инфильтрации способствующих воспалению лейкоцитов (Arumugam et al., 2006). Наконец, экспрессия microRNA-137, как было установлено, обеспечивает защиту нейронов посредством подавления пути Notch у моделей с повреждениями, индуцируемыми в результате глобальной ишемии головного мозга (Shi et al., 2017).
Удивительно, инсульты могут вызывать Notch-зависимый нейрогенез вне нейрогенных ниш: в астроцитах полосатого тела, как было установлено, подавляется передача сигналов Notch1 после инсульта и активируется, по-видимому, латентная нейрогенная программа (Magnusson et al., 2014). Более того, эпендимные клетки переднего мозга, которые обычно не вносят вклад в нейрогенез у взрослых и поддерживаются в молчащем состоянии за счет активной передачи сигналов Notch, активируются после экспериментальных инсультов и дают нейробласты и астроциты, реакция, которая подавляется при постоянной активации Notch (Carlen et al., 2009).
Наконец, связь между травмой (иная чем инсульт) и Notch в нервной ткани была заподозрена, благодаря раннему наблюдению, что ортолог Notch у золотых рыбок повторно экспрессируется после повреждений сетчатки (Sullivan, Barthel, Largent, & Raymond, 1997). Эта ассоциация теперь твердо установлена на многих экспериментальных образцах у мышей: ранения коры после ударов и криоповреждения вызывают астроглиогенез в SVZ, сопровождаемый активацией Notch (Givogri et al., 2006; Tatsumi et al., 2010). Вызываемые внутримозговыми кровоизлияниями повреждения также вызывают повешение NOTCH1 и последующее JNK-обусловленное расщепление Caspase 3, приводящее к повреждениям и апоптозу нейронов (Chen et al., 2016). Инициируемые травматическими повреждениями головного мозга вызывают нейрогенез в гиппокампе взрослых, если Hes1, мишень для Notch и негативный регулятор нейрогенез0а у взрослых, активируется (Zhang et al., 2014). Наконец, воздействие гипоксии увеличивает пролиферацию NSC и нейрогенез в гиппокампе зависимым от Notch1 способом (Zhang et al., 2014), а также приводит к активации микроглии, лежащей в основе активации Notch (Yao et al., 2013).
Итак, существует строгая ассоциация активности пути Notch с ишемическими инсультами и др. формами повреждений головного мозга. Однако, при этом существует известное исключение CADASIL, когда определенная причинная связь пока не установлена, т.е. многие из этих исследований обнаруживают корреляции, но отсутствуют четкие функциональные подтверждения.

6 NOTCH IN PROGRESSIVE NEURODEGENERATIVE DISEASES


Принимая во внимание важную роль Notch в формировании памяти, нейрогенезе у взрослых и в гомеостазе ЦНС, не удивительно, что ряд недавних исследований выявил участие этого пути в патобиологии некоторых хронических болезней прогрессирующей нейродегенерации, в частности в болезни Альцгеймера (AD), множественном склерозе (MS), а амиотрофическом боковом склерозе amyotrophic lateral sclerosis (ALS).

6.1 Alzheimer's disease


AD наиболее распространенная причина деменции в популяции взрослых, она затрагивает миллионы людей во всем мире; главными белковыми детерминантами патологии AD являются amyloid beta peptide (Aβ) и Tau, но и многие др. белки и пути, включая Notch, могут также играть роль в модуляции патологии болезни и её прогрессирования (Katsnelson, De Strooper, & Zoghbi, 2016). Боле 20 лет тому назад, было установлено, что иммунореактивность NOTCH1 заметно усилена в нейронах гиппокампа пациентов с AD (Berezovska et al., 1998). Лиганд DLL1, как было установлено, активируется в головном мозге у пациентов при спорадических AD (Fischer et al., 2005). Эти наблюдения позднее были подтверждены в др. исследовании, которое установило, что уровни белка Notch и мРНК HEY1 (мишени для сигналов Notch) повышены в головном мозге пациентов с AD (Leal et al., 2012). Однако, др. всё ещё утверждают обратное: а именно, что поскольку NOTCH1 белок локализуется в амилоидных бляшках и нейрофибриллярных узелках, он подавлен в самих нейронах головного мозга пациентов с AD (Brai, Alina Raio, & Alberi, 2016). Это кажущееся противоречие подчеркивает трудности интерпретации коррелятивных и базирующихся на экспрессии исследований, особенно в отсутствии функционального анализа.
Несколько исследований сообщили, что Notch и amyloid precursor protein (APP), который расщепляется, чтобы сформировать патогенные Aβ40 и Aβ42 пептиды при AD, взаимодействуют физически, как впервые было показано с помощью экспериментов по ко-иммунопреципитации в HEK 293 клетках (Fassa, Mehta, & Efthimiopoulos, 2005). Масс-спектрометрический анализ идентифицировал NOTCH2-APP и NOTCH1-APP комплексы в первичных нейронах с избыточной экспрессией APP; более того, было показано, что это взаимодействие зависит от мотива внутри трансмембранного домена Notch (Chen, Oh, Hinman, & Abraham, 2006; Oh et al., 2005). NOTCH2-APP комплексы можно увидеть на плазматической мембране и в разных внутриклеточных компартментах (Chen et al., 2006), тогда как NICD и APP формируют внутриклеточный комплекс с APP адапторным белком Fe65 (Fischer et al., 2005). Такие физические взаимодействия также могут оказаться существенными, но следует быть осторожными в оценке функциональности белковых взаимодействий, участвующих в избыточной экспрессии.
Основным затруднением при многих функциональных исследованиях является невозможность установить корреляцию между Notch и AD, которая хорошо известна для presenilin, каталитического компонента gamma-secretase комплекса, облегчающего функциональное расщепление как Notch, так и APP (Kimberly et al., 2003). Поэтому обычно используемая стратегия химического подавления Notch с помощью ингибиторов gamma-secretase (GSIs) приводит к спорным результатам, которые невозможно четко приписать или Notch или APP в отдельности. В 2013, фаза III клинического испытания GSI semagacestat была завершена досрочно, поскольку лечение ухудшало когнитивный статус по сравнению с приемом плацебо; указывая, что semagacestat преимущественно ингибирует расщепление Notch в меньшей степени APP, эти данные могут указывать на то, что нарушения передачи сигналов Notch может в самом деле влиять на AD фенотип, но это действительно невозможно в случае самостоятельных эффектов Notch в противовес APP (Doody et al., 2013; Henley, Sundell, Sethuraman, Dowsett, & May, 2014). Ещё более специфично, т. наз. "Notch-sparing" GSIs, такие как avagacestat, могут, по крайней мере, в некоторых контекстах, iподавлять расщепление как Notch, так и APP (Chavez-Gutierrez et al., 2012). Сходным образом, большое количество результатов по мышам и клеткам, нокаутным по presenilin/gamma-secretase, включая и те, несущие семейные мутации AD presenilin, трудно интерпретировать. Действительно ли presenilin-обусловленное расщепление Notch и APP может регулироваться совместно, остается неясным.
Горстка функциональных исследований показала, что пути Notch и APP могут влиять на поведение др. др. Экспрессия NICD, как известно, индуцирует петлю негативной обратной связи, это приводит к подавлению presenilin1 и, соотв., к редукции патогенных Aβ фрагментов в определенных контекстах (Lleo et al., 2003). Избыточная экспрессия или JAG1 или NICD снижает уровни IDE, белка, облегчающего удаление амилоида из головного мозга, как в APP-экспрессирующих клетках нейробластомы, так и у модельных мышей с AD (Leal et al., 2012). Некоторые исследования сообщили, что APP вызывает подавление репортеров Notch и воздействует прямо на мишени, такие как Hes1, в разных типах клеток, включая первичные нейроны, возможно благодаря взаимодействию с Notch регулятором Numb (Berezovska et al., 2001; Roncarati et al., 2002; Tanveer et al., 2012).
Наконец, предполагается связь между endocannabinoid (EC) системой, APP и передачей сигналов Notch в первичных нейронах. EC система является многообещающей терапевтической мишенью для AD, т.к. многие пре-клинические исследования на модельных животных показали, что ECs защищают нейроны и могут устранять различные патологии AD (Basavarajappa, Shivakumar, Joshi, & Subbanna, 2017). В 2012, Tanveer et al. сообщили, что anandamide (AEA), эндогенный cannabinoid, действует посредством type I cannabinoid receptor (CB1), чтобы устранить вызываемое Aβ42 снижение уровней белка и активности NICD. Воздействие AEA снижает также процессинг Aβ40 из APP, предположительно за счет сдвига баланса процессинга с APP к NOTCH (Tanveer et al., 2012). Пока нет др. исследований связи Notch и EC в контексте AD, AEA, как было установлено, передает сигналы посредством CB1, чтобы стимулировать самообновление в SVZ мышей стволовых клеток и клеток предшественников зависимым от Notch способом (Xapelli et al., 2013), и ассоциации между Notch1 и AEA. было также описано у мышей, моделирующих cholangiocarcinoma (Frampton, Coufal, Li, Ramirez, & DeMorrow, 2010).
В контексте AD, большинство исследований, кстати, сфокусировано на взаимодействии между Notch и APP/A β. Хотя в основном данные коррелятивные и/или описательные и поэтому их невозможно интерпретировать функционально, они предоставляют возможность, что передача сигналов Notch является важной для биологии AD. Мы отметили, однако, что взаимоотношения между Notch и др. ассоциированными с AD генами и белками, такими как MAPT (microtubule associated protein tau) и Apolipoprotein E, остаются неизвестными. Принимая во внимание, что Notch ассоциирует с обучаемостью, памятью и пластичностью нейронов, нейрогенезом и жизнеспособностью нейронов, вполне возможно предполагать, что он может также затрагивать эти процессы и при AD. Кстати, однако, нет исследований, подтверждающих, что определенно существует связь между Notch и дефектами памяти при AD, хотя мы отмечали, что недавнее сообщение утверждает, что хроническая экспрессия NICD в гиппокампе трансгенных модельных AD крыс вызывает нарушения в обучении и пространственной памяти; учитывая широко распространенные вредные эффекты постоянной экспрессии NICD, эти данные нельзя рассматривать как убедительные во всех смыслах (Galeano et al., 2018).

6.2 Oligodendrocytes and MS


MS это хроническое аутоиммунное заболевание, характеризующееся воспалением, демиелинизацией и дегенерацией аксонов в ЦНС (Correale, Gaitan, Ysrraelit, & Fiol, 2017; Filippi et al., 2018). Несколько строгих линий доказательств подчеркивают роль Notch в клеточных процессах, критических для MS. Notch сигналы, как известно, регулируют развитие и созревание некоторых типов клеток, связанных с MS повреждениями, включая олигодендроциты (которые отвечают за миелинизацию), микроглию, дендритные клетки и T helper (Th) клетки. Этого типа клетки влияют на два основных процесса, которые вносят вклад в патологию MS - это демиелинизация/axonal demyelination/ремиелинизация аксонов и иммунная и воспалительная реакция (rev. Bassil, Orent, & Elyaman, 2013; Jury?czyk & Selmaj, 2010).
Передача сигналов AG1 посредством NOTCH1, чтобы подавить созревание олигодендроцитов и тем самым контролировать время миелинизации в ходе развития (Wang et al., 1998). Патогенная ст. MS характеризуется деструкцией олигодендроцитов, приводя к демиелинизации и соотв. патогенным эффектам (Stangel & Hartung, 2002). В 2002,было сообщено, что передача сигналов Jag1-Notch1 реактивируется в ответ на TGF- β как в культурах клеток, так и в головном мозге пациентов с MS; Jag1 экспрессируется в астроцитах при хронических повреждениях демиелинизации, тогда как Notch1 и его мишень Hes5 обнаруживаются в клетках предшественниках олигодендроцитов (OPCs), как и при нормальном развитии (John et al., 2002). Это исследование впервые показало, что Notch участвует в MS и было предположено, что блокада передачи сигналов Notch может усиливать ремиелинизацию.
Последующие исследования ингибиторов передачи сигналов Notch на животных, моделирующих MS, подтвердили эту гипотезу. Подавление передачи сигналов Notch с помощью воздействия GSI ослабляет патологию болезни, повышает шансы восстановления и улучшает ремиелинизацию при распространенном экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (EAE), модулирующем воспалительную болезнь демиелинизирования (Jurynczyk, Jurewicz, Bielecki, Raine, & Selmaj, 2005; Jurynczyk, Jurewicz, Bielecki, Raine, & Selmaj, 2008). OPC-специфический нокаут Notch1 приводит к усилению ремиелинизации у lysolecithin (LPC) мышиных моделей фокальной демиелинизации (Zhang et al., 2009). У той же самой модели, очевидно, что происходящий из астроцитов endothelin-1 подавляет ремиелинизацию посредством Jag1/Notch-индуцированной задержки дифференцировки олигодендроцитов; соотв., фармакологическое подавление передачи сигналов эндотелина приводит к снижению передачи сигналов Notch, повышению дифференцировки олигодендроцитов и усилению ремиелинизации (Hammond et al., 2014). Недавно было сообщено, что Notch1 siRNA может улучшать "клинический" исход при лечении cuprizone (CPZ) модели острой демиелинизации, способствуя ремиелинизации, сопровождаемой повышением олигодендроцитами экспрессии маркера (Fan et al., 2018). Действительно ли роль Notch в ремиелинизации представляет собой возможную терапевтическую мишень MS, пока неясно из-за отсутствия клинических данных на людях. Однако, имеются исследования в целом четко указывающие, что модуляция передачи сигналов Notch оказывает выраженные эффекты на бол5езни демиелинизации.
Параллельно с эффектами на олигодендроциты, Notch может также модулировать иммунный/воспалительный процесс, которые являются критическими для клиники MS. Клетки, ответственные за аутоиммунные атаки на олигодендроциты при MS, вызывают хроническое воспаление (Bassil et al., 2013; Filippi et al., 2018). Роль Notch в развитии и дифференцировке T клеток хорошо изучена: известно, что передача сигналов Delta-Notch способствует выбору судьбы про-воспалительных Th1 и Th17 клеток, тогда как JAG1- индуцированная активация Notch способствует прежде всего анти-воспалительной судьбе Th2 (reviewed in Amsen, Helbig, & Backer, 2015; Bassil et al., 2013).
Многочисленные исследования на животных моделях MS подкрепляют мнение, что Notch воспроизводит эту онтогенетическую роль во время течения болезни и показывает, что подавление Notch может быть благоприятным, даже если лежащие в основе механизмы далеко неясны. Некоторые исследования установили, что GSI воздействие приводит к снижению IFN-gamma и IL-17, цитокинов, продуцируемых соотв. Th1 и Th17 клетками, вместе с коренным улучшением клинических проявлений (Jurynczyk, Jurewicz, Raine, & Selmaj, 2008; Keerthivasan et al., 2011; Minter et al., 2005). Специфическая для миелоида делеция Notch1, также приводит к сходным результатам (Fernandez et al., 2017). В случае экспрессии в T клетках, dominant-negative mastermind (DNMAML), ингибитор передачи сигналов Notch, существенно предупреждает EAE у более 90% инфицированных мышей по сравнению с 5% в контроле (Sandy et al., 2013). В противовес исследованиям GSI, однако, ни специфический для Т клеток DNMAML, ни Rbpj;Notch1 или Notch1;Notch2 conditional нокаут у мышей не демонстрирует изменения в IFN-gamma и IL-17. Вместо этого, дефицитные по передаче сигналов Notch T клетки, по-видимому, предупреждают накопление в ЦНС. Авт. подтверждают, что это расхождение может быть обусловлено различиями между системной в противовес T-клеточной специфической регуляции (Sandy et al., 2013). Др. возможность заключается в том, что GSIs может вызывать Notch-независимые эффекты путем подавления др. gamma-secretase субстратов.
Блокирование антител, специфичных к NOTCH3, как было установлено, снижают количества Th1 и Th17 (Jurynczyk, Jurewicz, Raine, & Selmaj, 2008). Кроме того, anti-DLL1 антитела ослабляют симптомы EAE и снижают активность Th1 в ЦНС, тогда как anti-JAG1 ухудшают симптомы и снижают активность Th2; напротив, экспрессия рекомбинантных слитых белков DLL1 и JAG1 выявляют противоположный эффект (Elyaman et al., 2007). Это зеркальное отражение онтогенетических ролей Dll1 и Jag1, соотв., при созревании Т клеток (Amsen et al., 2015). Анти-DLL4 блокирующие антитела при индуцированном Theiller's вирусом энцефаломиелита у мышей демиелинизирующей болезни (TMEV-IDD) моделируют возникающее коренное улучшение клинических симптомов и ослабляют реакцию Th1 и Th17 (Takeichi et al., 2010). Однако, у EAE модели то же самое воздействие ослабляет болезненные симптомы и способствуют Th2- и регуляторным T-клетками (Treg)-обеспечиваемыми противо-воспалительными реакциями, без повреждения количеств Th1 или Th17(Bassil et al., 2011; Reynolds, Lukacs, Long, & Karpus, 2011).
Доказательства, полученные на пре-клинических моделях, что передача сигналов Notch играет важную роль в регуляции физиологических процессов, лежащих в основе MS неоспоримы. Более того, крупномасштабный скрининг по неравновесному сцеплению у 13896 инивидов выявил JAG1 чувствительного гена для MS в Европе (Games Collaborative Group et al., 2006), а анализ сети T-клеточной активации сети у людей также показывает, что JAG1 является потенциальной терапевтической мишенью (Palacios et al., 2007).
Механизмы, лежащие в основе специфических эффектов подавления или активации Notch на прогресс миелинизации и модуляции биологии Т клеток, двух критических элементов при MS, всё ещё неясны. Точно также не имеет силы предположение, что разные пути подавления передачи сигналов Notch (напр., воздействие GSI, эктопическая экспрессия доминантно негативной формы компонентов пути Notch, генетическая инактивация или технологии siRNA) все они являются идентичными и даже сравнимыми. В частности, различия между разными Delta/Jagged лигандами, ткже как и 4 Notch рецепторами, скорее всего, имеют важные значения, т.к. касаются специфических типов клеток, в которых они экспрессируются. Наконец, экстраполяции с модельных животных на болезни человека не всегда надежны, особенно в отношении воспалительных процессов. Следовательно, если путь Notch рассматривать в качестве терапевтической мишени при MS, то д. быть осуществлена очень тщательная механистическая оценка как на преклинических моделях, так и на пациентах.

6.3 Amyotrophic lateral sclerosis


ALS, известен как Lou Gehrig's болезнь, является разрушительным и почти без вариантов летальным нейродегенеративным нарушением, затрагивающим двигательные нейроны в головном мозге и спинном мозге, приводящем к прогрессирующей мышечной слабости и атрофии (Hardiman et al., 2017). Эффективное лечение ALS не существует, т.о., генные активности, способные модулировать связанные с ALS фенотипы в модельных системах, представляют терапевтическую перспективу и интерес. Три гена четко ассоциированы с семейным ALS - Tar DNA-binding protein 43 (TARDBP aka TDP-43), Superoxide Dismutase 1 (SOD1) и Chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72) - оказываются связанными с передачей сигналов Notch signaling.
Zhan et al. показали, что множественные члены enhancer of split и bearded комплексов, а также Hey, являющиеся мишенями передачи сигналов Notch, строго активируются у Drosophila в ответ на избыточнyю экспрессию трансгенного человеческого РНК-связывающего белка TDP-43, который формирует цитозольные агрегаты в огромном большинстве пациентов с ALS. Более того, TDP-43, как было установлено, связывается очень эффективно с in vitro транскрибируемой мРНК Hey, это согласуется с гипотезой, что Hey может быть непосредственной мишенью для TDP-43. Наконец, нокдаун передачи сигналов Notch увеличивает продолжительность сильно укороченного периода жизни у мух, экспрессирующих TDP-43 аод контролем драйвера двигательных нейронов, подтверждая мнение, что передача сигналов Notch повышает индуцируемую с помощью TDP-43 нейротоксичность, хотя механизм этого полностью неизвестен (Zhan, Hanson, Kim, Tare, & Tibbetts, 2013). Сходным образом, в кортикальных нейронах человека анализ RIP-seq идентифицировал членов пути Notch NOTCH1, NUMBL, PSEN1, DLL1 и DLL3 в качестве потенциальных РНК мишеней для TDP-43 (Sephton et al., 2011).
Notch1, Jag1, Hey1, Hes1 и Maml1 РНК и белки были найдены активными у SOD1 G93A ALS модельных мышей; lithium и valproic acid (VPA), лекарства, используемые для лечения биполярных расстройств и обладающие нейрозащитными свойствами in vivo и in vitro , понижали эту активность как у мышиных моделей, так и пациентов (Wang et al., 2015). Более того, блокирование передачи сигналов Notch с помощью GSI или Notch1 siRNA в SOD1 G93A клетках, приводило к активации Bcl-2, также к подавлению Bax и cytochrome C, в соответствии с редукцией способствующей апоптозу передачи сигналов (Wang et al., 2015). Уровни белка NICD снижаются в двигательных нейронах и повышаются в астроглие у SOD1 G93A мышей после начала проявления симптомов ALS (Ma, Drannik, Jiang, Peterson, & Turnbull, 2017). Экспрессия всех 4-х паралогов Notch, также как Jag1 и нижестоящих эффекторов Rbpjk, Maml1, Hes7 и Hey2, повышется в спинном мозге SOD1 G93A мышей; активация NOTCH1, NOTCH2, JAG1, MAML2, HES1 и HEY2 также обнаруживается в спинном мозге пациентов со спорадическим ALS. Астроциты, по-видимому, воспринимают активные Notch сигналы, о чем можно судить по специфическому для астроцитов повышению NICD, тогда как JAG1 обнаруживаются как в астроцитах, так и нейронах; интересно, что специфичная для астроцитов делеция Jag1 у SOD1 G93A мышей приводит к неожиданной активации передачи сигналов Notch и к усилению прогрессирования болезни, подтверждая, что присутствие Jag1 в астроцитах может быть ингибирующим (Nonneman et al., 2018).
Наконец, заслуживает внимания то, что описана ассоциация между Notch и белками с аномальными дипептиднымы повторами, вызываемыми экспансией ассоциированных с ALS C9ORF72 повторов. Белок с дипептидными повторами (GR)80, состоит из 80 копий ассоциированных с болезнью GR пептидов, вызывающи х токсичность в большинстве тканей Drosophila, фенотип, который может подавалять избыточную экспрессию Notch. Экспрессия (GR)80 также, по-видимому, подавляет передачу сигналов Notch у Drosophila и людей, индуцируя плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) (Yang et al., 2015).

7 NOTCH, NEURODEGENERATION, AND THERAPEUTICS


Строгая ассоциация пути Notch с прогрессированием стволовых клеток и клеток предшественников вместе с очень широкой плейотропией делает передачу сигналов Notch критической для развития патогенеза нервной системы. Вовлечение Notch в детерминацию судьбы ранних нейральных клонов хорошо известно и не удивительно, что исследования всё больше выявляют важные ассоциации с болезнями. Помимо AD, ALS и MS, некоторые др. хронические нейродегенеративные болезни обнаруживают интригующие связи с Notch, хотя подкрепляющие данные скудны, а лежащие в основе механизмы неясны. Сюда входит ассоциация Notch1 с прионовой болезнью у мышей (Ishikura et al., 2005; Spilman et al., 2008), HES4 с болезнью Гентингтона (Bai et al., 2015) и RBPJ/Su(H) со спиноцеребральной атаксией 17 (Ren et al., 2011).
Лекарства или биологические препараты, которые системно супрессируют или усиливают путь Notch целиком являются тупыми инструментами, которые вряд ли являются подходящей терапией, как в случае провала GSI клинического испытания при AD. Не только в целом это неразумно для глобального блокирования важного для развития и гомеостаза сигнального пути, GSIs предупреждают расщепление множественных субстратов помимо Notch, вызывая потенциально вредные неспецифические эффекты. Значительно более приемлемый подход - это целенаправленное воздействие факторов, взаимодействующих с или модулирующих стержень пути Notch в специфическом контексте болезни, подход, который нуждается в идентификации таких факторов посредством комбинации генетического скрининга, компьютерного анализа сетей и детального механистического исследования.
Онтогенетические исходы супрессии или активации передачи сигналов Notch в клетках, которые имеют отношение к нейродегенерации, зависят сильно от клеточного контекста и поэтому невозможно предсказать исход a priori. Напр., известно из многих исследований онкогенеза, что Notch может вести себя или как онкоген или как опухолевый супрессор в зависимости от контекста. Т.о., несомненно заслуживают внимание путь Notch и его модуляторы в качестве возможной терапевтической мишени, сложность и плейотропность пути заслуживают крайней осторожности и тщательной проверки последствий модуляций передачи сигналов в специфическом клеточном и болезненном контексте.