У амниот (млекопитающих, птиц и рептилий ), нервная трубка состоит из нейроэпителия, который формирется в результатедвух процессов вдоль передне=задней оси (AP) axis. Этими процессами являются прежде всего первичная нейруляция (PN) и воричная нейруляция (SN). PN происхтдит в переднем регионе тела, представляющим будущий головной мозг и спиной мозг в торакальных регионах, где слой эпиттелиальных клеток (нервная пластинка) инвагинирует, чт обы создать трубчатую структуру (Colas и Schoenwolf, 2001; Copp et al., 2003; Saitsu et al., 2004). Напротив, SN-создаваемая нервная трубка располагается сзади в пояснгичной области и нижних конечностей (у цыплят и людей), формируется за счет мезенхимно-эпителиального перехода (MET) предшественников SN, располагающихсяя в хвостовой почке (Hughes и Freeman, 1974; Pasteels, 1937; Schoenwolf, 1979; Holmdahl, 1938). Хвостовая почка является временным образованием, распложенным на заднем конце эмбриона во время элонгации оси и к ней постоянно добавляются клетки, создавая регион нервной трубки, подвергающийся SN (она обзначается как вторичная нервная трубка). Нейроны из вторичной нервной трубки управляют физиологическими функциями тазовых органов, включая толстую кишку, мочевой пузырь, гениталии и двжения хвоста (Copp et al., 2015; Le Douarin и Kalcheim, 1999; Snell, 1995; Stiefel et al., 2007). Кроме того, недостаточность SN выступает дефектов нервной трубки, включая spina bifida, которое является наиболее распространенным врожденным уродством у людей (Copp et al. 2013, 2015; Dady et al., 2014; Detraitet al., 2005; Greenberg et al., 2011; Marks и Khoshnood, 1998). Поэтому важно понять механизмы, c помощью которых контролируется формирование вторичной нервной трубки, происходящей из хвостовой почки.

Хвостовая почка также предоставляет клетки, формирующие параксиальную мезодерму (Cambray и Wilson, 2002; Catala et al., 1995). На сегодня известен регионв очень раннем эпибласте в эмбрионов кур в HH5-7, который даёт как нейральные, так и мезодермальные клетки в задней части удлиняющегося эмбриона (Catala et al., 1996; Selleck и Stern, 1991), существование общих нейро-мезодермальных предшественников (также наз. NMPs; bi-fated) во время элонгации оси. NMPs были также выявлены у мышей, у которых клетки эпибласта в первичной полоске перед ингрессией клеток были прослежены c помощью системы Brachyury (Bra)-Cre/lox system (Garriock et al., 2015). Кроме того, NMPs были описаны в поздней хвостовой почке на ст. HH24 у эмбрионов кур и на ст. E8.5 у мышей (Cambray и Wilson, 2002; Mcgrew et al., 2008; Olivera-Martinez et al., 2012). Вместе с этими основами, NMPs стали рассмтривать как главные игроки, участвующие в элнгации оси во время всех стадий формирования зачатка. Однако, клетки хвостовой почки на промежуточных стадиях, т.е. между ст. HH8 и HH20 у эмбрионов кур проанализированы плохо.

Установлено, что мезодермальные клетки хвостовой почки содержат выбравшие одну судьбу самообновляющиеся клетки, показанные c помощью Cited1 (mesoderm specific)-Cre/lox мышиной генетики (Garriock et al., 2015), и такие мезодермальные стволовые клетки хвостовой почки, были также обнаружены и у эмбрионов кур (Iimura и Pourquie, 2006). Эти находки открывают возможность, что нейральные (SN) uni-fated стволовые клетки существуют также в хвостовой почке, и они д. вносить вклад в элонгацию вторичной нервной трубки. Если эти клетки существуют в хвостовой почке, то как они участвуют в SN во время элонгаци оси? Это было трудно, однако, оказалось возможным отличить SN uni-fated клетки в хвостовой почке от др. мезенхимных клеток, которые дают мезодерму и /или NMPs, поскольку эти клетки морфологически неоличимы др. от др.

Ранее мы описали группу клеток, которые преимущественно участвуют во вторичной нервной трубке у эмбрионов кур. Эти клетки происходят из специфического ромбовидного региона эпибласта, расположенного позади от Гензеновского узелка (HN) на ст. HH8 (Shimokita и Takahashi, 2011) ( Fig. 1A). Эта ромбовидная часть эпибласта, представленная слоем эпителиальных клеток, которые лишены подлежащей базальной мембраны, что позволяет эпителиальным клеткам внедряться благодаря эпителиально-мезенхимному переходу (EMT) способом, сходным с мезодермальной ингрессией из первичной полоски. Т.о., с точки зрения биологи клетк ромбовидная част ь эпибласта могут рассматриваться как "специализированная" часть первичной полоски, которая даёт SN предшественники. У эмбрионов кур ингрессия SN предшественников из эпибласта завершается на ст. HH11.



Fig. 1. Specific labeling of uni-fated SN precursors. (A) Precise fate mapping of the rhomboidal epiblast и anterior end of the primitive streak at HH8 (6ss). 75 different sites, a part of which is shown in the diagram, are PKH-labeled along the AP axis in the rhomboid, и assessed for their descendants at HH14 (23ss). Relative positions of labeled sites in the rhomboid are shown: the anterior и posterior ends adjacent to HN и primitive streak are positioned as 0% и 100%, respectively. Photos show dorsal views of embryos at the time of PKH labeling, и also at HH14 (23ss). Four representative distributions of descendants are shown. (B) Re-visited fate map of the rhomboidal epiblast at HH8 (6ss). (C) In ovo electroporation targeting the rhomboidal epiblast. (D) Even following careful targeting of the preSN region in the rhomboid (total number of embryo is 389), various consequences are observed. (E, F) When only neural cells (SN + PN) are EGFP-labeled at HH14 (23ss), these signals remain confined to the neural tissue at HH17 (30ss). In contrast, some electroporated embryos show EGFP signals in both neural и mesoderm (G), и these embryos are discarded. NT; neural tube, TB; tail bud, HN; Hensen's node, *; mesodermal territory in the tail bud, which is visible in dorsal view at HH14, but located ventrally at HH17.

В данном исследованияи путем дальнейшей очистки карты судеб SN-продуцирующей ромбоидной части эпибласта, мы тщательроисследовали характеристики SN клеток предшественников. Мы продемонстрировали, что SN uni-fated предшественники существуют в хвостовой почке , по крайней мере, вплоть до ст. HH17. Эти SN uni-fated клетки обнаруживают самообновление и состояние нейральной дифференцировки, которая регулируется c помощью дифферениальных уровней экспрессии Sox2: высоким в популяции дифференцированных и низким в самообновляющейся популяции. В противоположность превалировавшему мнению, что Sox2+/Bra+ является маркером для NMPs, SN uni-fated предшественники оказались Sox2+/Bra+. Наконец, мы установили, что некоторые SN предшественники начинают продуцировать как нейральные, так и мезодермальные производные со ст. HH19, демонстрируя, что судьбы клеток аксиалных предшественников более гибки, чем полагали ранее.



Fig. 2. Transplantation with SN uni-fated cells identifies self-renewing cells in the posterior half of the SN territory in the tail bud. (A-D) EGFP+ SN uni-fated cells are dissected from the tail bud of HH17 embryo, и transplanted into a corresponding region of the tail bud of HH14 embryos. (E-H) When the host embryo develops to HH17, similar transplantation is repeated. (I) The EGFP+ SN precursor territory in the tail bud is subdivided into the anterior и posterior halves, и each of them is isotopically transplanted into a host embryo (HH14). (J-L) The anterior SN precursors undergo neural tube differentiation without remaining in the tail bud (bracket). (M-O) The posterior SN precursors not only undergo neural tube differentiation, but also remain as mesenchymal cells in the tail bud (white arrowheads). A white small dot indicates the position of 31st-33rd somite level. White arrow is the boundary between the posterior end of epithelialized neural tube и mesenchymal SN precursors of the tail bud.



Fig. 3. Differentiatl expression levels of the Sox2 protein in the SN precursor territory of the HH14 tail bud. (A, B) In situ hybridization for Sox2 mRNA. Dorsal view (A) и sagittal section (B). (C-E) Immunohistochemistry for the Sox2 и Brachyury (T) proteins along the para-midline in sagittal section. (F, G) Posteriorly decreasing signal of Sox2 is quantitatively shown in the SN precursor territory. (H-N) The Sox2 и Bra positive cells overlap with EGFP-labeled SN uni-fated cells. (N) Single cells at three different positions in NT, anterior и posterior SN uni-fated domains in the tail bud are assessed for EGFP, Sox2, и Bra. Scalebar; 100µ m.



Fig. 4. Experimentally augmented level of Sox2 causes precocious participation of SN precursors in the neural formation. (A) Electroporation with the Sox2 gene into the preSN region at HH8, followed by selecting only embryos with EGFP+ cells in uni-fated SN precursors as shown in Fig. 1B (not shown in this figure). The set of plasmids indicated is for conventional overexpression и not for temporally controlled expression since no Dox is added. (B-D) Sox2-overexpressing cells precociously participate into the neural tube, и do not stay in the tail bud. (E) Dox-induced temporally controlled augmentation of electroporated Sox2 using the Tet-on system. When the embryo reaches HH14, at which gene-electroporated cells emerge as mesenchyme in the forming tail bud, a Dox solution is administered (0 h) (F, K). Note that at 3 h post-Dox in both control и Sox2-overexpressing embryos, three types of cells, green (EGFP), red (mCherry) и yellow (EGFP и mCherry) are readily observed in the tail bud (G, H, L, M) (see text for details). However, at 9 h, Sox2-overexpressing cells (EGFP) are found solely in the formed neural tube, и not in the tail bud (I, J, N-P). (O) Red (mCherry) cells seen in the tail bud are those electroporated only with mCherry и not with Sox2/EGFP. Concentrations of electroporated plasmids: (A) pCAGGS-Tet-Off 1.5 ?g/?l, pBI-EGFP or pBI-Sox2/EGFP 4 ?g/?l; (E) pCAGGS-Tet-On3G 1.5 ?g/?l, pBI-EGFP or pBI-Sox2/EGFP 4 ?g/?l, pCAGGS-mCherry 5 ?g/?l. White arrows are as explained Fig. 2. *; background in the yolk.



Fig. 5. Sox2-deprived SN precursors fail to participate in the secondary neurulation. (A) In ovo electroporation и tet-on induced expression of Sox3HMG-EnR are carried out in a way similar to that shown in Fig. 4E. In addition, Sox2-deprived SN precursors are precisely tracked following isotopic transplantation. (B, I) At the time of transplantation (0 h), no signal (DsRed) for the expression of Sox3HMG-EnR is seen yet. (C, D) By 12 h post Dox, in control embryos, EGFP+ и Dox-dependent DsRed+ (arrowheads) SN precursors are co-located in the secondary neural tube и SN territory in the tail bud. (J, K) In Sox2-deprived embryos, Sox3HMG-EnR/DsRed-expressing SN precursor cells (red; arrowheads), whose number is smaller than that of EGFP+/DsRed? cells, fail to be incorporated into the secondary neural tube formation. (E-H, L-O) Transverse sections also confirm the loss of Sox2-deprived cells in the secondary neural tube и in the posterior region of the SN precursor territory. (P) An already epithelialized neural tube is unaffected by Sox3HMG-EnR electroporation. Scale bar; 50 ?m. Concentrations of electroporated plasmids: pCAGGS-Tet-On3G; 1.5 ?g/?l, pBI-DsRed or pBI-Sox3HMG-EnR/DsRed; 8 ?g/?l, и pCAGGS-EGFP; 2.5 ?g/?l. Whitearrowsareasexplainedin Fig. 2, Fig. 4.



Fig.6. Uni-fated SN precursors change their fate to produce both neural и mesoderm at later stages. A single embryo in which uni-fated SN precursors are EGFP-labeled is tracked until HH19. (A-D) EGFP+ cells are confined to secondary neural tube и SN precursors at HH14 и HH16. (E-G) The EGFP+ cells start to produce mesoderm (arrowheads) in addition to SN cells. (G) Enlarged dorsal view of the tail region of embryos in (F). White arrows are as explained in Fig. 2, Fig. 4, Fig. 5. Asterisk; leaked EGFP in epidermal cells.

4. Discussion

Мы продемонстрировали путем очистки карты судеб ромбовидной области эпибласта на ст. HH8, что во время формирования вторичной нервной трубки у эмбрионов кур, существенная порция мезенхимы хвостовой почки состоит из uni-fated SN предшественников, по крайней мере, вплоть до ст. HH17, которая на более поздних стадиях меняет свою судьбу, чтобы продуцировать как нейралдьные, так и мезодермальные клетки (Fig. 7A). Среди uni-fated SN предшественниковна ст. HH14-17, мы идентифицировали самообновляющиеся и дифференцирующиеся в нейроны трансляционные SN предшественники, которые скоординировано регулируются c помощью экспрессии Sox2 (Fig. 7B).



Fig.7. Summary diagrams of the origin и Sox2-regulation of uni-fated SN precursors during secondary neural tube formation. (A) At HH8, a conspicuous structure of rhomboidal epiblast emerges posteriorly to HN. The anterior 70% of the rhomboid gives rise to SN uni-fated precursors (preSN; blue), whereas the other 30% yields cells including mesoderm (orange и grey). Whereas preSN-derived cells remain uni-fated until HH17, they start to produce both neuro и mesodermal cells at later stages ("bi-fated" as a cell population). This fate conversion can reconcile the uni-fated SN precursors found in the early tail bud (this study) with previously reported bi-fated cells at later stages (Olivera-Martinez et al., 2012; Mcgrew et al., 2008). The maintenance of the uni-fated SN precursors is enabled by self-renewing cells, for which a low level of Sox2 is important, whereas a high level of Sox2 directs neural differentiation. Uni-fated mesodermal precursors are previously reported (Garriock et al., 2015; Iimura и Pourquie, 2006). In much earlier embryos (HH3-7), NMPs have been reported to reside around HN (Selleck и Stern, 1991), but how these NMPs derive the distinct zones in the HH8 rhomboidal epiblast is unknown. (B) Spatial regulation of uni-fated SN precursors in the early tail bud at HH14. SN- (anterior) и mesoderm- (posterior) uni-fated precursors are spatially segregated. The SN precursor territory (light blue) is further divided into two subpopulations: self-renewing with a low level of Sox2 (posterior) и neural-specified transitional cells with a high level of Sox2 (anterior).

4.1. Self-renewing и neural-differentiating SN precursors are regulated by differential levels of Sox2

Uni-fated SN предшественники сегрегирующие пространственно от uni-fated мезодермы хвостовой почки, далее подразделяются на две субпопуляции: самообновляющуюся и из клеток, дифференцирующихся с нейроны, расположенных позади и впереди, соотв. (Fig. 7B). Потенциал самообновления задних клеток был установлен благодаря серии трансплантаций происходящих из preSN EGFP+ клеток в эквивалентное место хвостовой почки эмбриона хозяина (Fig. 2). Эти клетки вносят вклад в SN, не участвуя в формировании мезодермы. Эта стргая оценка позволила впервые идентифиировать популяцию SN стволовых клеток в хвостовой почке, которая отличается от NMPs, если и есть вообще. Действительно ли одиночные SN стволовые клетки генерируют как самообновляющиеся, так и дифференцирующиеся клетки, требует дальнейшего анализа.

Две субпопуляции SN предшественников экспрессируют разные уровни Sox2. Мы продемонстрировали, что высокий уровень Sox2 управляет нейральной дифференцировкой, тогда как низкий уровень Sox2 важен для выживания и поддержания самообновляющихся SN предшественников (Fig. 7). Sox2 участвует в нескольких PN-происходящих событиях ; в нормальном развитии нейронов, плюрипотентности стволовых клеток и выживании нейральных предшественников (Feng et al., 2013; Hagey и Muhr, 2014; Hutton и Pevny, 2011; Kondoh и Lovell-Badge, 2016). В частности, нзкий уровень Sox2 важен для пролиферации нейральных стволовых клеток головного мозга у взрослых (Hagey и Muhr, 2014).

Всё же до сих пор не установлено, как разные уровни экспрессии Sox2 устанавливаются на территории SN предшественников. Известно, что ромбовидный эпибласт у HH8 эмбрионов, включающий область preSN, лишен Sox2, хотя по соседству с ним нейральные пластинка и эпибласт (воспринимающие PN судьбу) экспрессируют на высоком уровне этот ген и также, что инактивация этого Sox2 нуждается в BMP4, т.к. воздействие Noggin вызывает усиление активности Sox2 в этой области (Takemoto et al., 2006). Вполне возможно, что экспрессия Sox2 в хвостовой почке также регулируется c помощью экспрессии BMPs в хвостовой почке и окружающе её ткани (Takemoto et al., 2006).

Самообновление uni-fated SN предшественников может отражать самообновление uni-fated мезодермальных клеток в ранней хвостовой почке (Garriock et al., 2015; Iimura и Pourquie, 2006), которая д. быть расположена в заднем регионе хвостовой почки на ст. HH14 (Fig. 1). Таким образом, как мезодермальные, так и выбравшие SN судьбу самообновляющиеся клетки, по-видимому, находятся по соседству др. с др. в хвостовой почке, получая одни и те же направленные кзади сигналы, такие как Fgfs и Wnts, для сохранения стволовости. В самом деле,мы наблюдали, что каноническая передача сигналов Wnt активируется, на чтоуказывает ядерная локализация β -catenin в сомообновляющейся популяции, ноне в дифференцирующихся клетках на территории хвостовой почки (Supplementary Fig. 6). Это согласуется с предыдущим сообщением, что Wnt/β -catenin поддерживают недифференцированные клетки во время элонгации оси (Garriock et al., 2015).

4.2. Uni-fated SN precursors change their fate to produce both neural и mesodermal cells during the late axial elongation

Мы неожиданно установили, что uni-fated SN предшественники в конечном итоге меняют свою судьбу, давая как SN, так и мезодерму. Эти находки примеряют uni-fated SN предшественники в ранней хвостовой почке до ст. HH17 (данное исследованияе) с ранее описанными bi-fated клетками на ст. поздней хвостовой почки после ст. HH17 (Olivera-Martinez et al., 2012; Mcgrew et al., 2008). Что же запускает подобные изменнеия в предопределении судеб, пока неизвестно. Однако, принимая во внимание, что такое изменение судеб происходит приблизительно на ст. HH17, стадии, когда конфигурация роста хвоста решительно изменяется, возможно, что эта конфигурация изменения позволяет факторам, индуцирующим мезодерму усиливать активность Wnt в SN предшественниках, в которых β-catenin уже активирован и перешел в ядро (Supplementary Fig. 6). Известно, что канонический путь Wnt, помимо его роли в поддержании недифференцированного состояния, склоняет клетки становиться мезодермой (Martin и Kimelman, 2012; Henrique et al., 2015; Garriock et al., 2015; Gouti et al. 2014, 2017; Row et al., 2016; Koch et al., 2017).

4.3. Sox2+/Bra+ is not a general marker for NMPs

Мы продемонстрировали, что большинство uni-fated SN предшественников в ранней хвостовой почке экспрессируют Sox2+/Bra+ (Fig. 3), и это противоречит превалирующей модели, что Sox2+/Bra+ являются маркерами NMPs. Безусловно, некоторые недавние исследования описывают, что Sox2+/Bra+ обнаруживаются также в не-NMPs (Koch et al., 2017; Wymeersch et al., 2016; Gouti et al., 2017). Т.о., Sox2+/Bra+ может быть использован на маркер для NMPs в некоторых онтогенетических контекстах (напр., на специфических ст., у разных видов и т.д.), но не во всех контекстах. Мы не исключаем возможность, что Sox2+/Bra+ клетки могут обладать высоким потенциалом к легкому изменению своей судьбы после воздействия внешними сигналами и это теперьтщателььно исследуется. В данном исследовании мы используем термин NMPs как общие нейро-мезодермальные предшественники и прародители в контексте клеточных судеб, а не потенциала дифференцировки, который необходим, напр., при перемещении клеток в новые условия.

4.4. Diversity in axial elongation

Недавно описана серия анализов прямого мечения и трансплантацийs у ранних эмбрионов мыши, у которых NMP-продуцирующие первичную полоску ограничены лимитированной частью позади соседней к узелку (Wymeersch et al., 2016; Cambray и Wilson, 2002, 2007). Эта специфическая часть первичной полоски, в отличие от эмбрионов кур, сохраняется вплоть до поздних стадий во время развития, которая постоянно поддерживает ингрессию NMPs, делая возможным длительное формирование хвоста. Напротив, у эмбрионов кур, регрессия первичной полоски и заканчивается ингрессия происходящих из нее клеток, самое раннее на ст. HH14 (за исключением окружения клоаки). После этого хвостовая почка может служить в качестве большого резервуара клеток для удлинения оси, при этом самообновляющиеся клетки д. играть критическую роль.

Кроме того, современные исследованияя выявили др. выдающееся отличие между мышами и курами: у эмбрионов кур, SN предшественники остаются remain uni-fated в течение продолжительного периода времени по сравнению с мышами. Эта популяция у кур uni-fated SN предшественников происходит из preSN, видимого exp и ed ромбовидного эпибласта на ст. HH8 (Fig. 1), который не обнаруживается у мышей. Однако, недавно было предположено, что передняя часть NMP-продуцируюдщей первичной полоски склонна давать больше нервных клеток, чем мезодермальных клеток (Wymeersch et al., 2016). Т.о., возможно, что preSN-подобная часть эпибласта существует также у мышей, хотя в течение очень небольшого времени и пространства по сравнению с эмбрионами кур. Интересно, что элонгация оси у эмбрионов людей, по-видимому, очень сходна скорее с эмбрионами кур, чем мышей (O'rahilly и Muller, 1989; Dady et al., 2014; Saitsu et al., 2004). Ожидается, что SN самообновляющиеся клетки, идентифицированные в этом исследовании , будут служить в качестве нового источника для терапевтических вмешательств в нейральные болезни, включая spina bifida, вызываемые неспособстью формирования вторичной нервной трубки.