Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) человека широко используются для изучения болезней человека, включая наследственные нарушения, благодаря своей способности сохранять нормальный диплоидный кариотип а ходе серии пассажей и дифференцироваться во многие производные типы клеток. В целом, генетическое модулирование состоит из модификации сайта мишени или путем делеции, инсерции или замещения специфической последовательности ДНК¹. Прецизонное редактирование генов имеет целью вызывать модификации в геноме, чтобы корректировать или менять патогенные варианты с разрешением в один нуклеотид². Система CRISPR-Cas9 является наиболее используемым инструментом для целенаправленной генерации разрывов двойной нити ДНК (DSBs) в геноме^3,4, которые впоследствии устраняются с помощью путей репарации эндогенной клеточной ДНК. Преимущественно, non-homologous end joining (NHEJ) приводит к инсерциям и делециям (indel), тогда как microhomology-mediated end joining (MMEJ) вызывает предсказуемые делеции⁵. NHEJ и MMEJ обозначаются коллективно как mutagenic end joining (MutEJ) , поскольку в обоих случаях результаты репарации приводят к потере или добавлению последовательности ДНК. Чтобы генерировать изменения в один нуклеотид, используется путь homology-directed repair (HDR) в комбинации с искусственной репарационной матрицей, такой как донорская плазмида или single-stranded donor oligonucleotide (ssODN)^6-9. Препятствием является отсутствие прямого отбора¹⁰ и превалирование MutEJ исходов при прецизионной репарации^11,12. Редакторы оснований, комбинирующие deaminases с Cas9 nickase , представляют собой стратегию для генерации замен одиночных нуклеотидов с минимальным MutEJ, но она ограничена редактированием фиксированных участков в 5-bp и высоким риском редактирования соседних участков, а также ограничением пределов и размера возможных нуклеотидных замен¹³ и риском активности deaminase вне мишени¹⁴. Т.о., HDR редактирование с искусственной ssODN матрицей нуждается в дальнейшей оптимизации.

Низкое соотношение HDR/MutEJ^15-17 поощряет попытки улучшить прецизионное редактирование путем влияние на репарацию ДНК. Подходы по увеличению доли HDR включаю модулирование компонентов репарации ДНК с помощью целенаправленного подавления NHEJ18-21, эктопической экспрессии факторов HDR^22-24 или прямого слияния белков, способствующих HDR, с Cas9^25-27, и конъюгации ssODN репарационных матриц с Cas9^28,29. Индукция холодового шока с помощью умеренного уменьшения инкубационной температуры культивирования, как было установлено, увеличивает период полу-жизни белков и эффективность целенаправленного воздействия zinc finger nucleases (ZFN) и transcription activator-like effector (TALE)-nuclease chimeras (TALENs) в клетках K562 и HeLa^30,31 , а недавно увеличение частоты HDR с использованием Cas9 в iPS клетках^32,33, хотя механизмы действия в iPS клетках остаются неизвестными.

Выбор пути репарация ДНК тесно связан с клеточным циклом, чтобы гарантировать целостность генома во время митозов, и синхронизация клеточных циклов оказалась связанной с увеличением доли HDR в различных линиях клеток^34-36. HDR ограничена S и G2 фазой, одновременно с доступностью гомологической последовательности, используемой в качестве репарационной матрицы во время genomic insult^37,38. С др. стороны, NHEJ активно в ходе всего клеточного цикла³⁹. Не получено четких доказательств синергетических эффектов на эффективность редактирования генов^35,40,41.

В данном исследовании мы обнаружили синергию между репарацией DSB ДНК и клеточным циклом в пользу генерации ssODN-опосредованных изменений одиночных нуклеотидов. Создание метода флуоресцентной репарации DSB ДНК базируется на конверсии GFP в BFP⁴² в клетках iPS, мы отслеживали соединения и культуральные условия, чтобы оценить их эффекты на исходы репарации ДНК на уровне одиночных клеток с помощью анализа fluorescence-activated cell sorting (FACS) . Доля HDR и соотношение HDR/MutEJ улучшались, когда выбирался путь модуляции репарации ДНК с помощью одиночного или двойного ингибирования и доля HDR ещё больше увеличивалась с помощью модуляции хода клеточного цикла путем холодового шока или фармакологического подавления. Однако, высокая частота HDR редактирования преимущественно приводила к генерации гомозиготных мутантов в биаллельной репортерной системе. Чтобы генерировать гетерозиготных мутантов в данных условиях, мы использовали стратегию применения смеси ssODN репарационной матрицы, чтобы защитить один аллель с молчащей мутацией. Затем мы использовали синергистическое редактирование генов на эндогенном аутосомном локусе и усиливали тем самым в несколько раз точную генерацию гетерозиготных и гомозиготных мутаций по сравнению с базовыми уровнями HDR. Эти результаты показали, что контроль за ходом клеточного цикла и репарация ДНК синергистически улучшают ssODN-опосредованное редактирование гена, как это продемонстрировано генерацией различных изогенных моделей генетической болезни.

Fig. 6: Synergistic gene editing at endogenous loci.

В данном исследовании мы попытались сдвинуть результаты репарации ДНК в направлении HDR во время ssODN-опосредованного редактирования генов в iPS клетках человека, используя вмешательства в химические и клеточно-культуральные условия (Fig. 7). Холодовой шок, как было установлено, оказывает различные влияния на клеточные функции при низкой (4-16°C), умеренной (16-25°C) почти оптимальной (25-35°C) гипотермии, которые замедляли метаболизм, активацию апоптических путей, изменения в экспрессии генов и вызывали арест клеточного цикла^44,57. Очень мягкий холодовой шок в 32°C характеризовался пиком уровней cold-inducible RNA-binding protein (CIRP) и RNA-binding motif protein 3 (RBM3), которые выполняют важные функции в защите клеток от разных эндогенных и внешнесредовых стрессов^58-60. В контексте редактирования генов холодовой шок, как было установлено, повышает эффективность HDR^32,33, с помощью пока неизвестного механизма. Здесь мы показали, что холодовой шок замедляет ход клеточного цикла, вызывает накопление клеток в фазе G2/M и снижает скорость синтеза ДНК. Кроме того, холодовой шок может проявлять себя и в виде др. независимых от клеточного цикла эффектах, таких как стабильность нуклеазы³⁰, кинетика ассоциации gRNA или кинетика разрезания ДНК и стабилизация при репарации промежуточных образований, пост-трансляционная регуляция и клеточная жизнеспособность. Эти дополнительные эффекты холодового шока могут объяснить увеличение эффективности (synergy) наблюдаемую при комбинации с XL413-индуцированным арестом клеточного цикла в G1/S фазе.

Fig. 7: Summary of synergistic gene editing effects favoring HDR outcomes.

Считается, что усиление активности CDK в S фазе стимулирует фосфорилирование ключевых HDR белков, таких как CtIP, способствуя удалению концов DSB и HDR⁶¹. Синхронизация клеточных циклов на границе G1/S с помощью Aphidicolin и на поздней стадии G2/M с помощью Nocodazole, как было установлено, повышает частоту HDR^34,35. Более того, содействие одновременному переходу G1/S с помощью Cyclin D1 (CCND1) приводит к избыточной экспрессии и синхронизации клеточного цикла в фазе G2/M с помощью nocodazole, что еще больше повышает эффективность HDR⁴¹. Здесь мы описали усиление редактирования генов с помощью CDC7 ингибитора XL413 в клетках iPS. XL413 , как известно, накапливает клетки в фазах S/G2/M в линиях раковых клеток⁴⁶, тогда как арест в G1 и ранней S фазе происходит в кариотипически нормальных клетках⁴⁵, это согласуется с нашими наблюдениями на iPS клетках. Также известно, что iPS клетки человека, подобно эмбриональным стволовым клеткам (ES), имеют укороченную G1 фазу ~2.5 ч. и вступают в S фазу ~4 ч. спустя после индуцированной nocodazole синхронизации в фазе G2/M^62,63. Во время целенаправленного воздействия CRISPR-Cas9 активность RNP инициируется в течении 4 ч. после доставки и в основном завершается после~24 ч. из-за деградации RNP⁶⁴, приводя к уменьшению временного промежутка для образования DSB и задействованию пути HDR в фазе S/G2. Следовательно, задержка клеточного цикла в G2/M или синхронизация в G1 и в ранней S фазе в то время, когда активна нуклеаза, являются достаточными и могут обеспечивать быстрое вступление в клеточный цикл в S фазе, которая в любом случае доминирующее состояние клеточного цикла в клетках iPS и способствует HDR репарации. Интересно, что nocodazole неспособен усиливать редактирование генов в iPS клетках в наших экспериментах, XL413 обнаруживает четкий позитивный эффект, гарантирующий дальнейшее использование.

Мы установили, что NHEJ ингибиторы NU7441 и SCR7^41,49 по отдельности улучшают эффективность HDR в клетках iPS и еще больше улучшают эффективность HDR при их комбинировании. DNA-PKcs специфически активируется после формирования DSB⁶¹ и рекрутирует белковые компоненты NHEJ пути, включая DNA ligase IV, которая действует, чтобы соединять концы ДНК. Мы полагаем, что подавление DNA-PKcs с помощью NU7441 может позволить обойти сборку комплекса NHEJ и позволить выбрать альтернативный путь репарации ДНК, тогда как при подавлении нижестоящей DNA ligase IV с помощью SCR7, клетки уже могут быть предетерминированы к NHEJ или некоторому альтернативному пути MutEJ репарации. Это может объяснить высокую эффективность HDR после воздействия NU7441 по сравнению с воздействием SCR7. Интересно, что мы не наблюдали усиления HDR с помощью RS-1 или L755507. Относительно специфического типа HDR мы имели цель подтвердить предположение, что ssODN-опосредованная репарация DSB подвергается synthesis dependent strand annealing (SDSA)^65-67, который является RAD51-независимым процессом и может объяснить ограниченный эффект на HDR энхансеров RS-1 и возможно L755507 в нашей системе.

В предыдущих исследованиях предпринимались попытки комбинировать синхронизацию клеточного цикла с подавлением NHEJ, но не наблюдали улучшения эффективности HDR. Это может быть обусловлено использованием кариотипически аномальных линий клеток, таких как HEK293T клетки⁴⁰ или из-за низкой эффективности SCR7 ингибитора в плюрипотентных стволовых клетках³⁵. Кроме того, наблюдали пики активности HDR в средине S фазы и снижение в G2 фазе в кариотипически нормальных клетках^16,17, это может указывать на ограничение эффективности, наблюдаемое в iPS клетках в поздней G2/M фазе синхронизации с помощью Nocodazole. Эти результаты демонстрируют, что разные состояния одновременного модулирования фаз клеточного цикла и выбора пути репарации ДНК синергетически увеличивают частоту HDR. Мы впервые сообщаем о синергетических эффектах синхронизации клеточного цикла и модуляции пути репарации ДНК на прецизионное редактирование генов.

Используя этот подход, мы получили до 96.6% клеток с HDR аллелями во время биаллельного редактирования, включая 84.8% биаллельных HDR редактирований, когда генерировались гомозиготные мутации. Неожиданно высокая эффективность редактирования оказалась ассоциирована с почти несуществующими гетерозиготными мутантными клетками. Одиночные HDR аллели формировались с помощью точного моноаллельного редактирования и были преимущественно ассоциированы с indel во втором аллеле, это согласуется с предыдущими сообщениями^11,12. Поэтому мы приспособили стратегию смешанных ssODN, чтобы создавать компаундные гетерозиготные мутантные аллели, защищенные от повторного разрезания с помощью Cas9^8,12 и получали до 32.2% компаундных гетерозиготных мутантов с GFP репортером. Принимая во внимание эндогенные мишени для моделирования болезней, мы генерировали гомозиготные и компаундные гетерозиготные мутации во многих локусах и продемонстрировали, что синергистическое редактирование генов существенно усиливает частоту исходов HDR в несколько раз по сравнению с базовыми уровнями HDR. В конечном счете получение гетерозиготных мутантов без молчащих мутаций, защищающих второй аллель, может потребовать второго раунда редактирования^8,68 или использования прицельного двух-ступенчатого донорского вектора и процесса эксцизии, такого как метод MhAX². Др. стратегии могут воздействовать на специфичность гаплотипов⁶⁹, конверсию треков^8,66 или титрацию нуклеаз, чтобы склонить в направлении моноаллельного редактирования, но эти подходы д. быть локус-зависимыми и с приемлемыми затратами. Мы ожидаем, что синергистическое редактирование генов сможет улучшить базирующуюся на ssODN стратегию для внесения и удаления блокирующих мутаций с использованием с двухступенчатого воздействия на цель.

Итак, мы создали биаллельную репортерную систему, способную выявлять аллель-специфические результаты репарации ДНК и определять синергистические состояния при редактировании генов, усиливающие HDR и HDR/MutEJ соотношение при использовании холодового шока, синхронизации клеточного цикла и модуляции репарации ДНК. Усилением высокой эффективности биаллельных модификаций мы продемонстрировали стратегию генерации компаундных гетерозиготных iPS клеточных линий. Мы ожидаем, что усиление надежности результатов биаллельного редактирования позволит существенно облегчить генерацию доминантных и рецессивных моделей генетических болезней и возможно также терапии с использованием iPS клеток человека.