В 1900, Hugo de Vries и др. ученые признали важность наблюдений Менделя и основали будущую дисциплину Генетику, которая оказалась применима ко всем живым организмам. Примерно в то же самое время, William Ernest Castle с коллегами начали свои исследования по наследованию специфических расцветок шерсти у мышей и др. животных (Silvers, 1979). Мутация albino, которая была известна с античного времени в Римской, Греческой , Японской и Китайской империях, стала первым признаком у млекопитающих, с помощью которого попытались подтвердить законы Менделя (Cuenot, 1902). Признак albino оказался рецессивным и наследовался как и ожидалось с распределением Менделя (Allen, 1904; Castle & Allen, 1903). Символ "C" ("color") был использован для описания признака albino, при этом "c" указывало на рецессивность признака. Второй аллель, описанный для этого локуса, мутация "extreme dilution" (ce), описан спустя несколько лет (Detlefsen & Roberts, 1921). После этого значительно большее число аллея c (все рецессивные) были открыты и охарактеризованы (сегодня насчитывается 151 аллелей в Mouse Genome Informatics web site, http://www.informatics.jax.org/marker/MGI:98880). Установлено, что все мутации albino были четко картированы в локусе tyrosinase (Tyr) - как показал комплементационный анализ с использованием трансгенных мышей (Beermann et al., 1990). С тех пор многие группы исследователей, включая и нашу, исследовали структуру и функцию локуса Tyr мыши.

В самом деле, Lluis Montoliu запланировал представить, что мы знаем о локусе Tyr на 24th International Pigment Cell Conference в Yamagata (Japan) on 18-21 June 2020, после награждения H. S. Raper медалью European Society for Pigment Cell Research и International Federation of Pigment Cell Societies за его вклад в понимание пигментных нарушений. К сожалению, конференция была отменена и-за пандемии COVID-19, вместо этого представим основные положения его лекции. Henry Stanley Raper (1882-1951) был престижным биохимиком, хорошо известный своими пионерскими работами по метаболизму жира и формированию меланина (Borovansky & Wiley, 2011).

Локус Tyr мыши имеет 5 экзонов и расположен на хромосоме 7 (coordinates 87,424,771-87,493,512) на обратной нти ДНК (Ensembl, GRCm38). Его ортолог у человека TYR, находится на хромосоме 11 (coordinates 89,177,875-89,295,759) на основной нити ДНК (Ensembl, GRCh38). Фермент tyrosinase (EC 1.14.18.1) является медь-содержащей oxidase, которая превращает аминокислоту L-tyrosine в dopaquinone посредством L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) (del Marmol & Beermann, 1996; Riley, 1999). После этого, dopaquinone подвергается серии не-ферментативных и ферментативных реакций, приводящих к продукции меланина (eumelanin и pheomelanin). Отсутствие активности tyrosinase блокирует биосинтез пигмента, приводя к фенотипу отсутствия пигмента или альбинизму. Tyrosinase принадлежит семейству родственных белков (tyrosinase-related proteins, Tyrp), включая Tyrp1 и Tyrp2 (также известны как dopachrome tautomerase или Dct), которые также участвуют в меланогенезе (Garc-a-Borron & Solano, 2002).

Ген TYR обнаруживает двойственный и очень клеточно-специфичный паттерн экспрессии. У мышей экспрессия Tyr ограничена двумя типами клеток : (a) меланоцитами, происходящими из нервного гребня, и (b) retinal pigment epithelium (RPE). Меланоциты мигрируют во время развития и колонизируют кожу, волосяные луковицы и многие др. места тела, такие как сосудистая оболочка глаз, улитка внутреннего уха и клапаны сердца (Giménez et al., 2003; Murillo-Cuesta et al., 2010). RPE является одиночным слоем тесно связанных пигментных клеток, обнаруживаемых в самом наружном слое сетчатки, которая происходит из глазного бокала и образует часть гемато-энцефалического барьера (Abbott et al., 2010; Bharti et al., 2006; Giménez et al., 2003).

У людей мутации в гене TYR ассоциированы с oculocutaneous albinism type 1 (OCA1), наиболее распространенным типом альбинизма в Европе и Сев. Америке. OCA1 является редкой генетической болезнью (OMIM: 203,100; ORPHANET: 352,731), ассоциированной с тяжелым дефицитом зрения и разными гипопигментациями кожи, волос и глаз (Martinez-Garcia & Montoliu, 2013). Известные анатомические дефекты глаз включают гипоплазию foveal, просвечивание радужной оболочки и transillumination, и неправильное направление непересекающихся в перекресте (ipsilateral) проекций аксонов из клеток ретинальных ганглиев, соединяющихся с geniculate ядрами головного мозга. Эти дефекты приводят к снижению остроты зрения, фотофобии, нистагму и нарушению стереоскопического зрения (Montoliu et al., 2014). Сходным образом, мутации в Tyr затрагивают пигментацию кожи и глаз со сравнимыми дефектами сетчатки (Giménez et al., 2004; Jeffery et al., 1994, 1997; Lavado & Montoliu, 2006). Интересно, что эти дефекты могут быть частично устранены у albino мышей с помощью генетически обеспечиваемого накопления L-DOPA в сетчатке, это подчеркивает жизненно важную роль этого предшественника меланина в нормальном развитии зрительной системы (Lavado et al., 2006).

Мутация albino не влияет на жизнеспособность мутантных Tyr мышей. В самом деле, этот умеренный и жизнеспособный, но во всем остальном очевидный фенотип. В связи с этим целенаправленное воздействие на ген Tyr и поиск мутаций потери функции (с четкой гипопигментацией или фенотипом albino) используется во многих экспериментах (Kotani et al., 2015; Mizuno et al., 2014; Nakayama et al., 2013; Rasys et al., 2019). Локус Tyr обладает дополнительными уникальными свойствами, которые делают его особенно пригодным в качестве экспериментальной модели для генетических экспериментов. Мутации Tyr дают четкий albino фенотип. который эпистатичен по отношению к др. мутациям генов окраски шерсти мышей, чей фенотип остается скрытым в отсутствие активного белка tyrosinase. Более того, дефицит Tyr одним из немногих примеров фенотипа, сохраняется независимо от генетического фона (Nadeau, 2001). Нет др. генов, способных компенсировать мутации Tyr.

Сегодня мы знаем примерно 22 гена, чьи мутации ассоциируют с разными типами альбинизма (Garrido et al., 2020; Montoliu et al., 2014; Montoliu & Kelsh, 2014; Montoliu & Marks, 2017; Pennamen, et al., 2020; Pennamen, et al., 2020), возникающими с частотой 1:10,000-20,000 в Западных популяциях.

Существенная пропорция (~30%) пациентов с клинически диагностированным OCA1 не обнаруживает мутаций в TYR кодирующей последовательности и ближайшем промоторе и интронных последовательностях (King et al., 2003; Lasseaux et al., 2018; Montoliu et al., 2014). Это наблюдение указывает на то, что существуют и др. регуляторные элементы ДНК внутри локуса TYR, ответственные за нарушения транскрипции. Геномная последовательность мышиного Tyr и человеческого TYR локусов сильно законсервирована: 86% тождественности на уровне белка и 84% на уровне ДНК. Эта гомология распространяется и за пределы кодирующих регионов в некодирующие последовательности. Напр., 5' дистальный регуляторный элемент, на 12/15-kb выше промотора Tyr, был первоначально открыт у мышей (Ganss et al., 1994; Porter et al., 1991), а позднее найден ~ 9 kb выше промотора человеческого TYR (Fryer et al., 2003; Regales et al., 2003).Соотв., функциональные и структурные исследования мышиного локуса Tyr не только интересны в отношении архитектуры гена млекопитающих, но и также как источника предполагаемых мутаций в некодируемых геномных последовательностях, которые имеют отношение к адекватной экспрессии гена и могут быть ассоциированы с OCA1.

В 1990, Beermann с колл. успешно спасли albino фенотип реципиентных мышей с помощью микро-инъекций конструкции мини-гена Tyr (ptrTyr4). Конструкция содержала небольшую часть геномного локуса мыши (промотор и 5' вышестоящая последовательность до ~5,5 kb, exon 1, intron 1, и часть экзона 2), сцепленную с остальной частью гена Tyr вплоть до экзона 5 плюс последовательность terminator, все произошедшие из кДНК (Figure 1). Мини-ген оказался достаточным, чтобы генерировать трансгенных мышей с пигментированными глазами и кожей, а эксперимент в конечном счете подтвердил связь между albino (C) локусом и кодирующим энзим геном Tyr, опровергая предыдущие предположения, что локус C кодирует регулятор для tyrosinase (Silvers, 1979). Мини-ген Tyr может быть построен из субнабора кДНК, выделенного ранее в той же лаб., руководимой Gänther Schütz, включая полной длины клон кДНК (Ruppert et al., 1988), коорый обеспечивал активность tyrosinase в tyrosinase-негативных клетках после временной трансфекции (Müller et al., 1988). Хотя первый крупный интрон оказался включенным в этой трансгенной Tyr конструкции, чтобы обеспечить эффективную экспрессию (в соотв. с рекомендациями Brinster et al., 1988), возникающие в результате трансгенные мыши имели изменчивую и слабо серую окраску шерсти, а не ожидаемую agouti дикого типа пигментацию (Beermann et al., 1990). Этот результат может быть объяснен тем, что геномная часть Tyr мини-гена происходила от chinchilla mouse (cch) содержащих G-to-A точечную мутацию, дающую изменение аминокислоты с alanine на threonine в позиции 482 (p.A482T), это приводило к достоверному снижению активности tyrosinase. Изменчивость фенотипа пигментации также объясняется эффектами известной хромосомной позиции, связанными со случайной интеграцией трансгена в геном хозяина. Эта первая Tyr конструкция (ptrTyr4, с промотором в 5.5 kb и 5' вышестоящими последовательностями) была способна запускать Tyr-специфическую экспрессию в коже и глазах мышей. Сходные результаты изменчивости пигментации наблюдала и группа Takuji Takeuchi, использовавших др. мини-ген Tyr , содержащий 2.6 kb от промотора и 5' не-кодирующую последовательность, которую инъецировали в яйцеклетки оплодотворенных albino мышей (Tanaka et al., 1990).

Figure 1 Schematic view of the mouse Tyr locus flanked by the Grm5 and Nox4 genes (top), and detailing the different transgenic Tyr constructs and genome-edited alleles described in the text. The black boxes in the coding area of the genes represent exons, whereas the white boxes correspond to introns. Regulatory elements are presented as gray boxes. Small arrows at the beginning of genes correspond to transcription start sites. A white box surrounded by a dashed line indicates a deleted regulatory element. A full LINE1 retrotransposon, upstream of 5'B is indicated (Giraldo, et al., 2003). Abbreviations: 5'B = 5' Boundary (also known as LCR, DNase I HS or DRE); 3'B = 3' Boundary: CNS = Conserved Non-Coding Sequence 2. The ptrTyr4 (Beermann et al., 1990), ptrTyr5 (Beerman et al., 1991) and ptrhsTyr4 (Ganss, et al., 1994) standard transgenic constructs contain genomic DNA sequences up to exon 2 and, thereafter, the remainder of the coding information was derived from a full-length Tyr cDNA (Ruppert et al., 1988). The YAC constructs YRT2, YRT3, YRT4, YRT5 (Montoliu et al., 1996), YRT2-derived deletions ?A, ?B and ?AB (Giraldo et al., 1999; Giraldo & Montoliu, 2002); and YRT2?LCR (Moreira et al., 2004) are shown with YAC vector sequences at both ends, illustrated as black triangles (arrow shape). In the YRT5 construct, the black box placed at the 5'B location represents the yeast marker used to target and replace this regulatory element. In the TYRINS5 construct, the 1.2 kb fragment deleted by CRISPR?Cas9 is included within the 3.6 kb 5'B/LCR fragment depicted in this scheme (Seruggia et al., 2015). Some of the transcription or nuclear factors bound to each regulatory element are also indicated below. The black box in the YRT5 YAC constructs represents a yeast marker used to substitute the 5'B regulatory element. Simplified but drawn approximately to scale. The mouse Tyr gene is transcribed from the reverse DNA strand and is normally presented running in the opposite direction. Here, the entire chromosome fragment has been arbitrarily flipped, for convenience and clarity of the scheme. The resulting pigmentation phenotype for each of these constructs over the recipient mouse albino phenotype is indicated next to their names following this code: (+) partial rescue, (++) full rescue, and (?) failed to rescue. The name of each construct is indicated on the right

Дальнейшее уменьшение 5' не-кодирующей последовательности ниже минимального Tyr промотора (~270 bp), как было показано позднее достаточно для управления мини-геном Tyr (ptrTyr5) для обнаружимой экспрессии Tyr в клетках RPE и меланоцитах (Beermann et al., 1992; Kl?ppel et al., 1991), хотя снова с варьирующей окраской шерсти (Figure 1). Этот небольшой мини-ген Tyr был также использован в качестве биологического маркера, чтобы легко идентифицировать трансгенных мышей основателей при рождении с использованием albino реципиентной лини мышей (Beermann et al., 1991). Др. группа также подтвердила использование Tyr конструкции мини-гена в качестве маркера для трансгенеза мышей (Overbeek et al., 1991). Обоснованное использование мини-генов Tyr в качестве трансгенных маркеров может быть объяснено сл. образом. Совместные микро-инъекции Tyr мини-генов с неродственной экспериментальной конструкцией гена в яйцклетки от оплодотворенных мышей albino д. обычно приводить к появлению трансгенных пигментированных мышат, которые интегрируют также экспериментальную конструкцию.

Использование информации, предоставляемой первой генерацией Tyr трансгенных мышей, позволило установить предварительную структуру гена Tyr у мышей (Takeuchi, 1992). Эта первая серия экспериментов подтвердила, что дополнительные регуляторные элементы помимо 5.5 kb 5' вышестоящей последовательности, по-видимому, необходимы для получения мощной экспрессии дикого типа Tyr.

Первый сигнал о существовании 5' дистальных регуляторных элементов в локусе Tyr мыши был получен в результате молекулярной характеристики chinchilla-mottled мутации, которая дает прекрасный паттерн поперечной исчерченности темных и светлых полос серых оттенков шерсти у гомозиготных мышей с этой мутацией (Figure 2). Путем картирования 5' region региона гена Tyr у дикого типа (Tyr+) и chinchilla-mottled (Tyr^c-m) мышей, группа Beatrice Mintz установили, что DNAse I hypersensitive сайт в -12 kb от промотора транслоцируется на дальнейшее геномное расстояние (более 30 kb) у Tyr^c-m мышей из-за хромосомной перестройки (Porter et al., 1991). Такие крупные геномные альтерации 5' выше локуса Tyr были подтверждены при молекулярной характеристике мутации extreme dilution mottled (cem), полученной от chinchilla-mottled (cm) мышей (Lavado et al., 2005).

Figure 2 An adult chinchilla-mottle mouse (Tyr^c-m) carrying the cm mutant allele in homozygosity, in an albino outbred Hsd:NMRI background. Some characteristic lighter and darker bands can be intuited on its dorsal skin coat color. Mice carrying the chinchilla?mottled (cm) and the extreme dilution mottled (cem) mutations were imported from MRC?Harwell (UK) to the CNB-CSIC to investigate the molecular determinants of the Tyr mutant alleles (Lavado et al., 2005). Photography: Lluis Montoliu

Примерно в то же время в лаб. Schü?tz в Heidelberg попытались использовать крупную геномную конструкцию, типа клонированных дрожжевых искусственных хромосом (YACs), чтобы генерировать трансгенных мышей. Первые Tyr YAC трансгенные мыши были производными той же самой конструкции Tyr мини-гена с 5.5 kb из 5'-вышестоящей последовательности, клонированной в векторе YAC, при этом финальный размер был в 35 kb (Schedl et al., 1992). Неудивительно, что Tyr трансгенные мыши были пигментированы, но обладали изменчивой пигментацией окраски шерсти, описанной выше (Beermann et al., 1990). Разные результаты получали, когда значительно более крупный регион генома Tyr, 250 kb в длину был использован в веторе YAC (Schedl, et al., 1993) (YRT2, Figure 1), который полностью устранял albino фенотип у реципиентных мышей и восстанавливал классическую agouti окраску шерсти, неотличимую от пигментации дикого типа (Schedl et al., 1993). Более того, экспрессия этого Tyr YAC трансгена, как было установлено, зависела от числа копий, указывая, что каждая копия способна экспрессировать полностью Tyr.

Обычные различия между YRT2 Tyr YAC трансгеном (250 kb) и предыдущей конструкцией Tyr мини-гена заключались в большом количестве 5' вышестоящих не-кодирующих последовательностей (~150 kb) включая YAC геномный клон, соответствующий уже описанному сайту DNAse I hypersensitive в -12 kb (Porter et al., 1991). Чтобы исследовать, действительно ли полное устранение фенотипа albino с помощью YRT2 Tyr YAC трансгена связано с этой предполагаемым 5' не-кодирующим элементом, были разработаны два подхода.

Во-первых, геномный фрагмент в 3.6 kb, содержащий DNAse I hypersensitive сайт был добавлен к конструкции Tyr мини-гена, несущей 5.5 kb от 5' вышестоящей последовательности (phstrTyr4, Figure 1) и был микро-инъецирован в оплодотворенные яйцеклетки от albino мышей. Возникающие в результате трансгенные мыши интенсивно пигментированы и обладали пигментаций шерсти и связанной с этим экспрессией Tyr, которая зависела от количества интегрированных копий трансгена (Ganss, et al., 1994). Также отобранный сайт DNAse I hypersensitive был обнаружен как клеточно-специфический, присутствующий в клетках меланомы, но отсутствующий в фибробластах и, следовательно, обладающий ткане-специфическим энхансером. In vitro, активность 5' Tyr энхансера может быть упрощена с помощью в 200 bp стержневой последовательности (Ganss, et al., 1994). Похожие результаты были получены независимо со сходными трансгенными мышами (Porter & Meyer, 1994).

В качестве альтернативного подхода обладающего преимуществами выступают YAC Tyr конструкции, которые могут быть созданы в дрожжевых клетках, серия новых YAC Tyr конструкций была получена путем целенаправленного воздействия недавно идентифицированного Tyr 5' энхансера (Montoliu et al., 1996). Три производные YAC конструкции были созданы, исходя из YRT2 Tyr YAC: YRT3, с делецией 5' не-кодирующей последовательности выше сайта DNAse I hypersensitive; YRT4, делетированы все 5' не-кодирующих последовательности, включая сайт DNAse I hypersensitive; и YRT5, в которой 5' не-кодирующий фрагмент, содержащий DNAse I hypersensitive site, был заменен характерным для дрожжей маркером (Figure 1). Получаемые в результате YAC Tyr трансгенные мыши были поразительно чистыми. YRT3 Tyr трансгенные мыши были неотличимы от YRT2 Tyr трансгенных мышей и дикого типа пигментированных agouti мышей, тогда как YRT4 и YRT5 Tyr трансгенные мыши обнаруживали драматическую потерю пигментированной окраски шерсти и разнохарактерную экспрессию Tyr в коже ушей (Montoliu et al., 1996). Эти результаты подчеркивают важность этого Tyr 5' дистального регуляторного элемента, который был назван Locus Control Region (LCR) как следствие предыдущего описания сходных дистальных регуляторных элементов, контролирующих экспрессию beta-globin домена у трансгенных мышей (Grosveld et al., 1987).

Несколько лет спустя создан др. YRT2 Tyr YAC , YRT2-LCR (Figure 1), путем простого удаления региона LCR (совершенное целенаправленное событие по сравнению с YRT5 Tyr YAC трансгеном, где тот же самый регион был замещен дрожжевым маркером), и в результате снова возникал сравнимый фенотип у трансгенных мышей, который обнаруживался у YRT4 и YRT5 с гипопигментированной или variegation окраской шерсти (Moreira et al., 2004). Последующая характеристика YRT4 Tyr YAC мышей во время эмбриональной фазы подтвердила variegated фенотип и была предположена задержка экспрессии Tyr в развивающейся сетчатке (Giménez et al., 2001, 2005).

Геномные пограничные свойства изоляторов, также известные как изолирующие активности, включают в себя несколько важных функций, а именно (а) защиту от влияния хромосомного положения; (b) действуют в качестве барьеров против окружающего гетерохроматина; (c) обладают способностью блокировать транскрипционные взаимодействия между промотором и дистальным энхансером, если помещаются между ними; и (d) и обеспечивают динамическую регуляцию организации генома, влияющего на становление паттерна экспрессии генов для данного домена экспрессии (Chen & Lei, 2019; Giraldo et al., 2003; Montoliu, 2002). Такие изоляционные свойства были также продемонстрированы в мышином Tyr 5' вышестоящей не-кодирующей ДНК последовательности, это было подтверждено экспериментами in vivo на трансгенных мышах и мухах (Drosophila melanogaster) (Giraldo, et al., 2003), а также на трансгенных рыбках данио (Danio rerio) (Bessa et al., 2009), все они подтвердили дополнительную роль для этго LCR/5' регуляторного/меланоцит-специфического энхансерного элемента как геномных границ. Независимые наблюдения Tyr 5' регуляторного элемента идентифицировали прис4утствие scaffold/matrix attachment regions (S/MARs), которые также, по-видимому, вносят вклад в описанную изолирующую активность (Porter et al., 1999).

Определенный прогресс был достигнут в отношении последовательностей ДНК, участвующих в регуляции транскрипции, связанной с мышиным промотором Tyr и соседними проксимальными 5' не-кодирующими последовательностями, и родственными ядерными факторами. Предыдущие данные о первом поколении Tyr трансгенных мышей позволили сделать вывод, что последовательность промотора в 270-bp достаточна для поддержания клеточно-специфической экспрессии (Beermann et al., 1992; Kl?ppel et al., 1991). Последовательность ДНК ~236 bp от места старта транскрипции Tyr мыши , по-видимому, трансдуцирует клеточно-специфическую активность энхансера в клетках меланомы мыши (Ponnazhagan & Kwon, 1992). Дополнительные места связывания с предполагаемыми транскрипционными факторами были идентифицированы путем сравнения промоторов генов Tyr и Trp1 (Shibahara, 1993). Более того, сайты связывания для bHLH (basic-helix-loop-helix) транскрипционных факторов были выявлены в мышином Tyr промоторе - т.наз. M-box - который включает мотив CTGCAG, как полагают, для связи с microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) (Ganss et al., 1994). Более систематический мутационный анализ в 270-bp мышиного Tyr промотора выявил места связывания для двух позитивных элементов и одного негативного регулятора в 270 и ~80 bp, это ещё больше подкрепило предположение, что Mitf является фактором, преимущественно соединяющимся с M-box (Ganss et al., 1994). Вскоре после этого было подтверждено, что специфичность транскрипции мышиного Tyr перомотора обеспечивается с помощью двух сильно законсервированных мотивов, Tyr Initiator (Irn) и ранее описанного M-box, оба содержат одну и ту же стержневую последовательность, известную как E-box (CATGTG) и оба занимаются Mitf (Bentley et al., 1994). Mitf был последним из найденных главных регуляторов пигментных генов и онкогенов меланомы, среди несметного количества биологических процессов, в которые он, скорее всего, вовлечен (Goding, 2000; Goding & Arnheiter, 2019;).

Относительно мышиного Tyr дистального 5' melanocyte-специфического энхансера с пограничной активностью, расположенным между ~12/~15 kb выше промотора, предварительный анализ DNase I footprinting подтвердил существование, по крайней мере, двух сайтов связывания, первоначально наз. hs1 и hs2 boxes, внутри стержневого элемента в 200 bp, преимущественно связанные с повсеместными факторами CREB и AP-1 (Ganss, et al., 1994). Дополнительные эксперименты с трансгенными мышами описали конструкции, указывающие, что этот 5' дистальный элемент в основном оперирует как специфичный для меланоцитов энхансер и , скорее всего, не влияет на экспрессию Tyr в клетках RPE (Camacho-H?bner & Beermann, 2001). В этом отношении, дополнительная законсервированная не-кодирующая последовательность (CNS) была идентифицирована с помощью геномного сравнительного анализа ~47 kb 5' выше Tyr промотора и была названа CNS2. Роль энхансера транскрипции и специфического для RPE паттерна экспрессии элемента CNS2 была тестирована с использованием временного трансгенного репортера мышей во время эмбрионального развития после микроинъекции и переноса эмбрионов, в отсутствие формально подтвержденной трансгенной линии мышей (Murisier et al., 2007a) (Figure 1).

Чтобы оценить потенциально отличающиеся роли hs1 и hs2 boxes в Tyr 5' дистальном энхансере, два сайта связывания (переименованные в A и B boxes, соотв.) были делетированы одновременно или по отдельности из функционального YAC Tyr YRT2 (Giraldo et al., 1999; Giraldo & Montoliu, 2002). Возникающие в результате трансгенные мыши (?A, ?B, and ?AB) обнаруживали широкий круг окраски шерсти и чрезвычайно изменчивые фенотипы, которые не могли интерпретировать (Giraldo & Montoliu, unpublished). Важно отметить, что все эти YAC трансгены, несмотря на свой крупный размер, вставлялись случайно в геном хозяина и, следовательно, могли быть подвержены действию эффекта положения на хромосоме, подобно любому др. трансгену.

Более детальный анализ in vitro потенциальных ядерных факторов, связывающих Tyr 5' дистальный регуляторный элемент, соотв. меланоцит-специфическому энхансеру (Camacho-H?bner & Beermann, 2001; Ganss, et al., 1994; Montoliu et al., 1996) , и свойств геномных границ (Bessa et al., 2009; Giraldo, et al., 2003) подтвердил участие Mitf, Sox10 и USF (Murisier et al., 2007b). Mitf и Sox10, как было установлено, кооперируют для специфичной для меланоцитов экспрессии (Marathe et al., 2017), тогда как USF ассоциирует с геномными границами или insulators (Hassan?Zadeh et al., 2012).

В 2012, две публикации вызывали переворот во всей области биологии, предложив использование старейшей адаптивной иммунной системы, выработанной прокариотами (чтобы защидать самих себя от бактериофагов) для обеспечения редактирования генома в любом гене любого вида (Gasiunas et al., 2012; Jinek et al., 2012). Использование этой системы, известной как CRISPR-Cas9, разрослось в последние годы на самые разные виды (Fernandez et al., 2017; Josa et al., 2016; Seruggia & Montoliu, 2014).

Это предоставило исключительную возможность функционального и структурного анализа не-кодирующего генома, традиционно неподдающегося генетическим модификациям благодаря превалированию разных семейств повторяющихся последовательностей. Сначала, стало осуществимо и не столь затратное, целенаправленное воздействие на регуляторные элементы ДНК in situ, чтобы изменить, инвертировать, удвоить или делетировать отобранные геномные последовательности, чтобы оценить их значение в их естественном геномном окружении. Этот подход позволяет оценивать мутации в случайно интегрированных классических трансгенах, когда положение на хромосоме влияет драматически и затемняет эффекты мутаций.

Мы решили целенаправленно воздействовать и удалять мышиный Tyr 5' регуляторный элемент -12/-15 kb выше промотора, чтобы функциональной оценить роль этой не-кодирующей последовательности ДНК во всей регуляции транскрипции локуса (Figure 1). Сложный субнабор ядерных факторов и активностей был картирован в этом геномном фрагменте, часто с разными именами для одной и той же последовательности ДНК, поскольку описываемые функции описаны по-разному. В этой связи этот Tyr 5' дистальный элемент, открытый в 1991 (Porter et al., 1991) выступал под разными названиями, включая DNAse I hypersensitive site (HS), melanocyte-specific enhancer, LCR, distal regulatory element (DRE), Tyr distal enhancer, Tyr 5' genomic boundary, S/MAR…, но все эти названия означали один и тот же геномный фрагмент, содержащий, по крайней мере, две активности: меланоцит-специфического энхансера и геномной границы.

Мы разработали RNA guides, комплементарную к концу Tyr 5' регуляторного элемента и использовали CRISPR/Cas9 стратегию, чтобы генерировать редактирование генома мышей, лишенных фрагмента в 1.2-kb, окружающего и включающего A и B boxes, ранее известные как hs1 и hs2 (Ganss, et al., 1994) (Seruggia et al., 2015).

Реагенты CRISPR/Cas9 микро-инъецировали в пронуклеусы и цитоплазму оплодотворенных яиц, происходящих от гибридных мышей с окраской шерсти дикого типа (B6CBAF2). Получены многочисленные мыши основатели и большинство из них оказались мозаичными, несущими разные аллели. Все мыши основатели подвергались анализу последовательностей и отбору и в конечном итоге аллели, сегрегировавшие после скрещивания с albino индивидами. Некоторые мыши основатели уже обнаруживали неуниформную слабую серую окраску шерсти, указывая на делецию Tyr 5' регуляторного элемента в обоих эндогенных аллелях и давали гомозиготных мутантов (Seruggia et al., 2015). Анализ некоторых независимых мутантных аллелей показал мощный и четкий фенотип, а именно слабую серую окраску шерсти, по-видимому, с пигментацией глаз дикого типа без признаков variegation, систематически обнаруживаемой, когда один и тот же элемент удалялся из трансгена Tyr (Giménez et al., 2001; Montoliu et al., 1996; Moreira et al., 2004). Такое расположение делетированного фрагмента ДНК в нескольких независимых линиях с одним и тем же фенотипом гипопигментации снова подчеркивает наличие стержневого элемента в этом 5' регионе, включая ранее идентифицированные hs1/hs2 (box A and B) сайты связывания для ядерных факторов. Детальный гистологический анализ сетчатки от мышей с отредактированным геномом показал, что только происходящие из нервного гребня меланоциты в хороидном сплетении теряют экспрессию Tyr и поэтому не обнаруживают пигментации (Seruggia et al., 2020). Напротив слой RPE из клеток, которые нормально и униформно пигментированы, подтверждают мнение, что 5' регуляторный элемент в основном контролирует экспрессию Tyr в клоне меланоцитов, не из оптического бокала происходящих RPE клеток. Более того, прямое сравнение отредактированных по геному мышей, лишенных 5' Tyr регуляторного элемента в эндогенном хромосомном положении с YAC Tyr YRT4 и YRT5 (Giménez et al., 2001; Montoliu et al., 1996), и YAC Tyr YRT2 ΔLCR трансгенных мышей (Moreira et al., 2004), лишенных сходного региона внутри конструкции, показало, что классическая variegated пигментация, наблюдаемая у последней группы животных, исчезает полностью у мышей с CRISPR/Cas9 отредактированным геномом. Это наблюдение подтверждает, что variegated фенотип первоначально описанный у YAC YRT4, YRT5 и YRT2ΔLCR трансгенных мышей может быть объяснен случайной интеграцией трансгена и последующим эффектом положения на хромосоме. Этот эксперимент подчеркнул также уместность оценки роли не-кодирующих ДНК регуляторных элементов в из естественном окружении, этот подход становится возможным с появлением CRISPR/as9 методов редактирования генома (Seruggia et al., 2020; Seruggia et al., 2015; Seruggia & Montoliu, 2016).

Мышиный локус Tyrокружен двумя генами: Nox4, расположенным ~ 26 kb 3' ниже Tyr и Grm5, обнаруживаемым ~ 91 kb 5' выше Tyr (Figure 1). Та же самая хромосомная организация эволюционна закреплена и поддерживается в геноме человека.

Хотя паттерн экспрессии Tyr ограничен меланоцитами, происходящими из нервного гребня, оба соседних гена обнаруживают отличающиеся паттерны экспрессии. Ген Nox4 кодирует type 4 NADPH oxidase из респираторной цепи и экспрессируется повсеместно (Block et al., 2009). Ген Grm5 кодирует type 5 glutamate metabotropic receptor и обнаруживает специфичный для нервной системы паттерн экспрессии (Thompson et al., 2014). Поэтому разумно предположить, что локус Tyr участвует в защите домена экспрессии с участием геномных границ или инсуляторов для поддержания клеточно-специфической экспрессии, не взаимодействуя с соседними генами (Montoliu, 2002).

Одна такая геномная граница была идентифицирована внутри 5' Tyr дистального регуляторного элемента, ни же сильно гипометилированного полного LINE1 интегрированного ретротранспозона (Bessa et al., 2009; Giraldo, et al., 2003; Porter et al., 1999). Делеция этой 5' границы из её местоположения в хромосоме с помощью CRISPR/Cas9 техники дала отредактированных по геному мышей (наз. TYRINS5) с четкой гипопигментацией окраски шерсти и отсутствием очевидных альтераций в клетках RPE (Seruggia et al., 2015).

Доказательством существования сходной геномной границы на 3' конце локуса Tyr мыши появились в недавних исследованиях. В частности, использование техники Chromosome Conformation Capture (3C) (Hag?ge et al., 2007), применительно к закреплению последовательности Tyr промотора, выявило строгое взаимодействие промотора Tyr с последовательностью ДНК, картированной на 3' не-транслируемой области локуса Tyr, как в клетках меланомы (экспрессирующих Tyr) , так и в фибробластах (не экспрессирующих Tyr) (Seruggia et al., 2020). Внимательное рассмотрение этих последовательностей ДНК выявило присутствие сайтов связывания для ядерного фактора CTCF, как известно, трансдуцирующего активность insulator (Bell et al., 1999). Этот 3' Tyr регуляторный элемент также ведет себя как геномный инсулятор в клетках и у рыбок данио, поэтому мы пришли к выводу, что эта 3' граница мышиного домена Tyr отделяет ген от локуса Nox4. Чтобы оценить функциональное значение этой 3' Tyr границы, мы генерировали отредактированных по геному мышей, используя CRISPR/Cas9 точно также как ранее это было сделано для 5' Tyr границы (Seruggia et al., 2015). Возникающие в результате редактирования генома мыши были лишены 3' Tyr границы(наз. TYRINS3), он были неотличимы от пигментации дикого типа, как в отношении окраски кожи, так и пигментации глаз (Seruggia et al., 2020) (Figure 1). Этот неожиданный фенотип был в дальнейшем исследован путем измерения не только Tyr, но и также уровней экспрессии Nox4 и Grm5 в разных органах отредактированных по геному TYRINS5 и TYRINS3 мышей, несущих гомозиготные делеции на 5' и 3' Tyr границах, соотв. Tyr экспрессия в глазах TYRINS5 мышей была снижена и почти отсутствовала в меланоцитах кожи, в соответствии с отсутствием пигментации в choroidal и кожных меланоцитах. Напротив экспрессия Tyr , по-видимому, была неизменной у TYRINS3 мышей.

Удивительно удаление фланкирующих Tyr границ также влияет на соотв. соседние гены. Напр., экспрессия Nox4 увеличивалась в коже TYRINS3 мышей, а экспрессия Grm5 оказывалась выше в головном мозге TYRINS5 мышей (Seruggia et al., 2020).

Наконец, сходные эксперименты были недавно проделаны с сильно удаленным CNS2 элементом (Murisier et al., 2007a). Делеция этого элемента у отредактированных по геному мышей, по-видимому, изменяет окраску шерсти и пигментацию глаз, как у TYRINS3 мышей. Элемент CNS2 содержит сайт связывания для транскрипционного фактора Otx2, специфически экспрессирующегося в развивающемся RPE (Bovolenta et al., 1997). Тщательная оценка экспрессии Tyr показала достоверное снижение экспрессии в глазах, подтверждая скорее кооперативную, чем кардинальную роль для этого дистального регуляторного элемента в домене экспрессии Tyr у мышей. В том же исследовании идентифицировали дополнительный CTCF сайт связывания выше CNS2, который, по-видимому, д. поддерживать ген Grm5, изолированный от Tyr. Не выявлено отличий в экспрессии Grm5 в CNS2-делетированном у genome-edited мышей (Josa & Montoliu, unpublished).

Локу Tyr у мышей был тщательно исследован с помощью разных методов. Комбинированные результаты позволили идентифицировать ключевые не-кодирующие ДНК регуляторные элементы, контролирующие экспрессию этого гена. Эти сайты связывания для транскрипции или ядерных факторов обнаружены преимущественно вблизи промотора Tyr, а также описаны границы 5' и 3' и сайт CNS2. Альтерации любого из этих мест могут приводить к нарушениям экспрессии Tyr, а также к изменениям паттернов экспрессии соседних локусов Nox4 и Grm5. Кроме того, эти исследования подчеркивают важность исследования не-кодирующих ДНК регуляторных элементов в их хромосомном эндогенном контексте, используя технику CRISPR/Cas9 геномного редактирования. Характеристика этих эволюционно закрепленных Tyr ДНК регуляторных элементов выявило дополнительное значение открытия новых сайтов мишеней для мутаций, которые могут быть ответственны за существенные альтерации в экспрессии локуса, возможно приводя к соотв. редким болезням у людей: oculocutaneous albinism type 1 (OCA1). Локус Tyr мыши проявляется не только как фундаментальный ген, кодирующий скорость-ограничивающий энзим в пути биосинтеза меланина, но и также как пример для понимания того, как гены млекопитающих регулируются структурно и функционально.